Summary
Larven av vaxet moth Galleria mellon nyligen etablerat som en in vivo-modell för att studera Legionella pneumophila infektion. Här visar vi de grundläggande tekniker för att karakterisera patogenesen av Legionella i larverna, inklusive ympning, mätning av bakteriell virulens och replikering samt utvinning och analys av infekterade hemocyter.
Abstract
Legionella pneumophila, är vilka smittämnen av en svår lunginflammation som heter legionärssjuka, en viktig mänsklig patogen som infekterar och replikerar i alveolära makrofager. Dess virulens beror på Dot / Icm typ IV sekretionssystem (T4SS), vilket är avgörande för att etablera en replikeringstillåt vacuole kallas Legionella innehåller vacuole (LCV). L. pneumophila infektion kan modelleras i möss men de flesta stammar mus är inte tillåtande, vilket leder till sökandet efter nya infektionsmodeller. Vi har nyligen visat att larverna av vaxet moth Galleria mellon är lämpliga för undersökning av L. pneumophila infektion. G. mellon används allt mer som en infektion modell för mänskliga patogener och en god korrelation mellan virulens av flera bakteriearter i insekten och i däggdjursmodeller. En viktig del av larver immunförsvar är hemocyter, yrkeal fagocyter, som tar upp och förstöra inkräktarna. L. pneumophila är i stånd att infektera, bildar en LCV och replikera i dessa celler. Här visar vi protokoll för analys av L. pneumophila virulens i G. mellon modellen, bland annat hur man odlar smitt L. pneumophila, förbehandla larverna med hämmare, infektera larver och hur man extraherar infekterade celler för kvantifiering och immunofluorescensmikroskopi. Vi beskriver också hur man kan kvantifiera bakteriell replikering och fitness i konkurrensanalyser. Dessa metoder möjliggör snabb screening av mutanter för att fastställa faktorer som är viktiga i L. pneumophila virulens, som beskriver ett nytt verktyg för att underlätta vår förståelse av denna komplexa patogen.
Introduction
Djurmodeller av infektion har visat sig vara ovärderligt för bestämning av bakteriella virulensfaktorer. Dock har ryggradslösa modeller fått ökad uppmärksamhet som ett bärkraftigt alternativ till traditionella däggdjursmodeller infektion. Larverna av vax mal, är Galleria mellon alltmer för att studera ett antal viktiga humana patogener, inklusive grampositiva 1 och gramnegativa bakterier 2,3 och flera patogena svampar 4,5. Med användning av en insekt modell har ett antal fördelar jämfört med traditionella däggdjursmodeller, enligt en ryggradslös, G. mellon är inte föremål för de etiska begränsningarna i däggdjursmodeller. Dessutom kan larverna lätt underhållas, infekterades genom injektion utan bedövning genomgå förbehandling med kemiska inhibitorer 6 och upprätthålla inkubation vid 37 ° C 7. Intressant nog en god korrelation mellan patogenitet av flera mikroorganismer i G. mellonella och däggdjursmodeller av infektion har etablerats 2,8. Den ökade förståelsen av immunsystemet hos G. mellon har också hjälpt till karakteriseringen av denna modell organism. Även insekter inte har ett adaptivt immunsystem som finns i däggdjur, de har sofistikerade cellulära och humeralhuvuden försvar inklusive produktionen av antimikrobiella peptider 9. Hemocyter är den huvudsakliga förmedlaren av cellulära försvar och är de mest talrika celltypen som finns i hemolymfa (eller blod) av G. mellon 10, Dessa celler är professionella fagocyter och utföra liknande funktioner till humana makrofager och neutrofiler både att starta och förnedrande bakterier i ett phago-lysosomala fack 10,11 och bildar knölar runt invaderande bakterier, fysiskt begränsa bakteriell replikering 12.
Legionella pneumophila är en respiratorisk patogen som orsakar svår pneumonia (legionärssjuka) hos känsliga populationer som äldre eller nedsatt immunförsvar 13. Legionella finns överallt i både miljö-och konstgjorda vattenkällor, där det är en patogen av olika arter av sötvatten amöbor 14,15. Legionella överlever och replikerar inom dessa professionella fagocyter genom att använda en multi-proteinkomplex som kallas Dot / ICM (defekta i organellen trafficking / intracellulär förökning) typ 4-sekretionssystemet (T4SS) att translokera över 275 effektor-proteiner in i värdcellen 16 till 20. Dessa proteiner tjänar till att undergräva de normala värdcell fagocytiska vägar, vilket leder till skapandet av Legionella innehåller vacuole (LCV). Den LCV undviker fusion med lysosomer och istället rekryterar endoplasmatiska retiklet (ER)-härledda vesikler, vilket resulterar i ett specialiserat fack som liknar den grova ER 21,22. L. pneumophila anses vara en oavsiktlig mänsklig vägogen, samma strategier som gör det möjligt att replikera i amöbor, också tillåta replikering i mänskliga alveolära makrofager 23.
Däggdjursvärdar har karakteriserats som modeller för mänskligt Legionella infektion inklusive möss och marsvin 24,25. Men majoriteten av musstammar är resistenta mot Legionella infektion 26 med undantag för den inavlade albino A / J-mus, som utvecklar en mild, självbegränsande infektion 24. Även marsvinsmodellen mer liknar human sjukdom 25, bristen på mutanter och ökad kostnad avskräcker deras användning 27. Dessutom har flera ryggradslösa modeller utvecklats för Legionella pneumophila infektion inklusive Caenorhabditis elegans 28, Drosophila melanogaster 29 och flera arter av amöbor 30-32. Dessa modeller har svagheter, virulens i C. elegans 28, vilket begränsar användbarheten av denna modell. Drosophila-modellen har visat sig effektiv i att undersöka bakterie virulensfaktorer 29 och verkar lovande men denna modell är inte helt karaktäriseras. Encelliga amöbor är miljö värdar för L. pneumophila och är idealiska för att undersöka effekten av virulensfaktorer på molekylär nivå 33 saknar dock flera viktiga förmedlare av den mammalievärdcell svar på infektion som t.ex. kaspaser 34. Bristerna i de nuvarande modellerna, tillsammans med den höga kostnaden och etiska frågor i samband med däggdjur experimenterande, har lett till sökandet efter andra lämpliga modellorganismer 29,35.
Vi har nyligen visat att G. mellon är en lämplig modell för L. pneumophila Pathogenesis 36,37. Detta protokoll detaljer de experimentella tekniker som används för smittaing G. mellon larver, analysera larv moral, utvinna hemocyter för räkning och immunofluorescens och bestämma replikation genom livskraftig CFU räknas från infekterade larver.
Protocol
1. Beredning av L. pneumophila för Infection
- Förbered träkol jästextrakt (CYE) plattor (2 g / liter aktivt kol, 10 g / L jästextrakt, 13 g / I agar, 10 g / l N-(2-acetamido)-2-aminothanesulfonic syra (ACES), en g / L α-ketoglutarat, 0,4 g / L L-cystein-HCl och 0,25 g / L ferripyrofosfat, pH 6,9).
Observera: Om det behövs, tillsätt kanamycin (25 | ig / ml) och / eller kloramfenikol (6 | ig / ml) till CYE plattor.- Utför alla L. pneumophila arbete på biosäkerhet skyddsnivå 2 (BSL-2) i en mikrobiell säkerhetsbänk (MSC) i enlighet med lokala regler.
- Serie L. pneumophila från -80 ° C glycerol lager på CYE plattor
- Inkubera plattorna under 4 dagar vid 37 ° C.
Obs: Inkubation av plattor i 4 dagar ökar betydligt virulens hos L. pneumophila i G. mellon över inkubation under 3 dagar. - En dag före infektion, resuspendera en slinga full av bakterier (innehållande flera kolonier) i 1 ml förvärmd (37 ° C) ACES jästextrakt (AYE) buljong och mät absorbansen vid 600 nm (OD 600) med användning av en spektrofotometer.
- Inokulera en fräsch 3 ml AYE kultur (med antibiotika vid behov) till en slutlig OD 600 på 0,1.
- Inkludera en media bara kontrollera för att säkerställa sterilitet av medierna.
- Inkubera vid 37 ° C i en skakande inkubator vid 200 rpm under 21 timmar.
OBS: Bakterier bör odlas till post exponentiell fas för infektion 38. Växa för 21 timmar tillåter experiment som ska standardiseras.
Obs: Om det behövs för proteininduktion, lägga 0,5 mM isopropyl-β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) över natten. - Mät OD 600 (bakterier ska vara i efter exponentiell tillväxtfas, OD 600 2.5-3).
- Späd bakteriekultur för att ge 1 x 10 9 CFU / ml i steril Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (D-PBS).
Obs: Baserat på tidigare resultat, en OD 600 av 1 motsvarar 1 x 10 9 CFU / ml, men detta bör bekräftas för olika L. pneumophila stammar.
OBS: Om det krävs induktion av ett protein från en plasmid, tillsätt 1 mM IPTG till ympen. - Plate inokulatet som beskrivs i avsnitt 9 som en kontroll för att säkerställa den förväntade CFU finns i ympen.
2. Framställning av Larver
- Köp tillräcklig G. mellon larver från en kommersiell leverantör. Larver skickas vid 5: e eller 6: e instar stadium (ungefär mellan 2-3 cm i längd) och är lämpliga för att användas omedelbart.
Anm: En metod som beskriver hur bakre larver har beskrivits tidigare 39.
OBS: Larver kan förvaras i rumstemperatur i upp till två veckor och kräver mat. Kassera omedelbart alla larver visar tecken på förpuppning. - Förbered behållaren för larven med placing en cirkel med 10 cm filterpapper på botten av en 10 cm petriskål.
- Använda trubbig spets pincett, placera tio friska larver av ungefär samma storlek i petriskål.
OBS: Kasta ohälsosamma brun färgad eller fläckigt ser insekter. Friska larver är enhetligt krämig färgad med några områden av mörk missfärgning och har möjlighet att rätta sig snabbt om välte.
3. Infektion av G. mellon Larver
- Förbered injektions plattform genom att tejpa en cirkel av filterpapper till ytan.
- Säkert tejpa en P1000 spets horisontellt till filterpapper för att skapa en injektion plattform. Detta behöver inte vara sterila.
- Sterilisera en mikrotiter spruta 20 pl genom att aspirera 70% etanol och inkubering i minst 10 min.
- Bär punkteringssäkra handskar medan du injicerar,
- Ta bort eventuella rester av etanol genom att aspirera och utvisa sterilt vatten flera gånger.
- Using sprutan aspirera 10 ìl av L. pneumophila 1 x 10 9 CFU / ml suspension.
- Ta en larv och försiktigt men bestämt vända den på rygg, böjda över P1000 spetsen.
- Placera sprutspetsen över den främre, högra proleg av larverna.
- Försiktigt, in spetsen på nålen i proleg och se till att den är inne i larver, och smidigt injicera alla sprutans innehåll.
OBS: Om sprutan är rätt isatt, bör det vara möjligt att ta upp larverna med enbart sprutan för att placera den i kammaren.- Efter injektion observera larverna under några sekunder. Larverna kommer att börja krypa efter ett par sekunder men bör inte utsöndrar vätska.
- Observera kort på larver några timmar efter infektion, infektion med 10 7 CFU L. pneumophila 130b orsakar inte några symtom inom de första 5-8 tim pi därför om larver vänder grå / svart innan denna punkt, tHan experiment bör avbrytas.
Anm: Inokulering av larver med 1 mM IPTG påverkar inte larv viabilitet under loppet av experimentet. - På samma sätt, injicera totalt 10 larver per tillstånd inklusive 10 larver injiceras med D-PBS för att fungera som en kontroll för att analysera larvdödlighet.
- Tape Petriskålar stängda och plats i sekundär inneslutning.
- Inkubera i en vanlig bakteriell inkubator vid 37 ° C, under varaktigheten av försöket.
4. Förbehandling av larver med en kemisk inhibitor
- Före infektion, förbereda larver för injektion enligt avsnitt 3,1-3,6.
- Injicera 10 ìl av en 100 mikroM lösning av Cytochalasin D i den främre, vänstra proleg av 10 larver.
Anm: Inhibitor injiceras i en annan proleg från bakteriesuspensionen för att minska skadan för larver. - Injicera 10 ^ il DMSO till 10 larver som kontroll.
- Inkubera larver vid37 ° C under 4 timmar.
- Injicera förbehandlat larver som beskrivs i avsnitt 3 i den främre, höger proleg med antingen 1 x 10 7 CFU WT L. pneumophila eller en PBS-kontroll.
5. Analys av Larvernas dödlighet
- Vid 18 timmar efter infektion (pi), granska alla infekterade larver för dödlighet.
- För att kontrollera dödlighet, använd trubbiga tippade pincett för att vända på larver och leta efter rörelse av benen, bör friska larver rätta sig snabbt. Pigmente indikerar en stark immunreaktion mot infektioner. Om det finns någon rörelse, räknas som levande.
- Rekordmånga döda och levande larver.
- Upprepa denna process på alla andra tidpunkter som valts.
OBS: Om inkubationen fortsätter under mer än tre dagar, kan puppor ses. Ta bort alla puppor och avliva genom frysning vid - 20 ° C innan metamorfos kan uppstå.
6. Extraktion av Hemolymph
- Slumpmässigt välja trelarver och placera i en 14 ml tub vid valda tidpunkter, t.ex. 5 och 18 timmar pi,
- Placera röret på is under 5 till 10 min, till dess kan observeras ingen rörelse av benen hos larverna.
- Placera bedövades larver på en petriskål och, med användning av en skalpell, göra ett snitt mellan två segment nära svansen av larver.
- Pressa larver i en steril 1,5 ml centrifugrör att samla hemolymfa.
- Pool hemolymfa från minst tre personer. En larver ger mellan 15-50 l av hemolymfa beroende på storlek.
Obs: Under hemolymph utvinning är det mycket lätt att störa tarmen, vilket leder till potentiell kontaminering av proverna. Minska förorening genom skärning larverna nära svansen (bort från tarmen) kommer emellertid antibiotikaselektion alltid vara nödvändig när utstrykning bakterierna.
OBS: För att förhindra hemolymfa från brunfärgning och koagulerande, processen hemolymfa inom 10 minuter efter provtagningen.
- Pool hemolymfa från minst tre personer. En larver ger mellan 15-50 l av hemolymfa beroende på storlek.
- Kasta larvkroppen in i en ny 14 ml Falcon-rör, tätning och plats vid - 20 ° C över natten för att se till att larver är döda.
- Autoklav döda larver och kassera enligt lokala regler.
7. Fastställande av hemocyte viabilitet
- Extrahera hemolymfa som beskrivits ovan.
- Blanda 20 pl av extraherades hemolymfa med 20 pl av 0,02% (vol / vol) trypanblått i PBS i en brunn i en 96 brunnars platta.
- Inkubera under 5 min vid rumstemperatur.
- Belastning 10 mikroliter av hemolymph på en hemocytometer och räkna livskraftiga (inte blå) celler.
- Räkna varje prov i tre exemplar för att minska fel.
8. Behandling av testamentes hemocyter för immunofluorescensmikroskopi
- Blanda den poolade hemolymfa utvinns från minst tre larver och pipett på en 10-15 mm täckglas i en 24-brunnar.
OBS: Täck kräver inte behandling hemocyter kan ansluta sig till glas. - Lägg till 0,5 ml av D-PBS och blanda väl genom att pipettera upp och ned.
- Centrifugera plattan under 10 min vid 500 xg vid rumstemperatur (RT) med användning av en aerosol tätt centrifug hållare.
- Undersök varje brunn med ett inverterat mikroskop för att kontrollera att hemocyter har anslutit sig.
- Avlägsna supernatanten och tvätta cellerna tre gånger genom tillsats av 0,5 ml D-PBS till väggen i brunnen, gungande plattan 2-3x och avlägsnande av D-PBS med en pipett.
- Fixera cellerna genom tillsats av 0,5 ml av 4% (volym / volym) paraformaldehyd (PFA) i PBS.
- Inkubera cellerna i mellan 20 till 30 min vid RT.
- Tvätta cellerna tre gånger med D-PBS, som tidigare.
- Tillsätt 0,5 ml 15 mM NH4CI i PBS för att släcka återstående PFA och inkubera vid RT i 15 min.
- Tvätta cellerna tre gånger med D-PBS.
OBS: I detta skede kan täck lagras över natten vid 4 ° C. - Tillsätt 0,5 ml 0,1% Triton X-100 i PBS och inkubera under 5 min vid RT för att permeabilisera cellerna. Block under 1 timme med blockeringslösning (2% (vikt / volym) BSA i PBS).
- Inkubera under en timme vid RT i mörker med den primära antikroppen utspädd i blockeringslösning vid utspädning som anges av tillverkaren.
- Tvätta 3x med PBS.
- Inkubera i en timme med den sekundära antikroppen och DAPI för visualisering av bakterier som ovan.
- Tvätta 3x med PBS.
- Montera täckglas med hjälp av en droppe monterings reagens på objektglas.
- Inkubera över natten i mörker vid rumstemperatur för att helt torka monteringslösning.
- Bild glider på ett fluorescensmikroskop.
9. Kvantifiering av Bakteriell CFU
- Tillsätt 100 mikrogram / ml spektinomycin att CyE plåtar för att undvika föroreningar av tarmfloran. L. pneumophila stam 130b är naturligt resistenta mot spektinomycin 40.
- Innan hemolymph utvinning, väger 1,5 ml centrifugrör.
- Utdrag hemolymfa som beskrivs i avsnitt 6 och placera in vägde tubes, tillsätt 1 l av 5 mg / ml digitonin, blanda väl och inkubera i 5 min vid RT för att lysera hemocyter.
- Väg åter röret med hemolymfa och fastställa vikten av hemolymfa heras.
- Utför tio-faldiga seriespädningar av hemolymfa i sterilt AYE medier.
- Med hjälp av en penna, dela upp basen på en CYE platta i sex lika stora sektorer och etikett.
- Tallrik tre droppar av 25 | il av varje spädning (med början med den mest utspädda) i varje sektion av plattan.
- Inkubera plattorna med locken upmost över natten vid 37 ° C.
- När dropparna har torkat fullständigt, vrid plattan över och inkubera vid 37 ° C under minst ytterligare två dagar.
- Kvantifiera bakterierna extraherats med hjälp av räkning av de kolonier vid varje spädning och normalisera till vikten av hemolymfa heras.
10. Bestämmande av Competitive Index (CI)
- Kontrollera att båda stammarna växer lika bra i buljong kultur och på CYE agarplattor prior att du försöker med konkurrensindex.
- Förbered WT eller kanamycinresistenta muterade bakteriesuspensioner som beskrivs i avsnitt 1 och blanda i förhållandet 1:1.
- Tallrik serieutspädningar av inokulatet på CYE spektinomycin (100 ug / ml) och CYE spektinomycin / kanamycin
- Infect larver och extraktet hemolymfa vid lämpliga tidpunkter, såsom beskrivits ovan.
- Bestäm livsdugliga räkningar genom att utvinna hemolymfa och plätering seriespäd på CYE spektinomycin och CYE spektinomycin / kanamycin.
- Beräkna konkurrensindex (CI) enligt följande: CI = (mutant utgång / WT-utgång) / (mutant inokulat / WT inokulat).
Representative Results
Här visas att G. mellon är en lämplig, enkel att använda modellen för att studera L. pneumophila infektion. Tidigare har det visats att L. pneumophila virulens i makrofager, amöbor och däggdjursmodeller är beroende av närvaron av Dot / ICM-sekretionssystemet 41-43. G. mellon larver infekterades såsom beskrivits ovan och virulensen hos vildtyp (WT) och en Dot / Icm fattiga stammen jämfördes. Infektion med 10 7 CFU L. pneumophila stam 130b gav 100% dödlighet inom 24 timmar efter infektion (pi). Emellertid L. pneumophila Δ DOTA-stam, vilken inte har en funktionell Dot / Icm T4SS sekretionssystemet, var avirulent i denna analys (figur 1). Detta visar att L. pneumophila virulens i G. mellon beror på förflyttning av Dot / ICM-effektenheter, vilket gör denna modell lämpar sig för karakterisering avfunktionen av dessa proteiner.
Nyligen visade det sig att inhibering av fagocytos genom cytochalasin behandling ökade susceptibly av larverna till infektion av jästsvampen Candida albicans 6. Som L. pneumophila är en intracellulär patogen, beslutades att fastställa om upptag av bakterier är avgörande för dess patogenes i denna modell. Larver förbehandlades med 10 | il av 100 pM Cytochalasin D (CyD) under 4 h vid 37 ° C, därefter infekterades med 10 7 CFU WT L. pneumophila 130b och dödlighet övervakas vid 24 h pi behandling med hämmare ensamt inte påverkade larver överlevnad. Emellertid förbehandlas, infekterade larver visas väsentligt större överlevnad (P = 0,0066, oparat t-test) jämfört med DMSO-behandlade, infekterade insekter (Figur 2). Effekten av Cyd behandling avskaffades av 48 h pi (resultaten visas ej), vilket kan bero på att halveringstiden av läkemedlet i G.mellon. Detta visar att upptaget av L. pneumophila i G. mellon hemocyter är en viktig aspekt av bakteriell virulens.
För att validera uttryck och bestämma den subcellulära lokaliseringen av en effektor-protein i G. mellon, hemocyter extraherades och bearbetats för immunofluorescensmikroskopi. Larver infekterades med WT och Δ DOTA L. pneumophila 130b uttrycka ett fragment av den väldefinierade T4SS effektor, SIDC 41-918, fuserad till fyra N-terminala HA-etiketter. Denna effektor visades att binda LCV via en fosfoinositid-4-fosfat-bindande domän 44. Användning av anti-HA (röd) och anti-Legionella (gröna) antikroppar, 4HA-SIDC 41-918 lokaliserad till LCV i infekterade hemocyter (Figur 3). Denna lokalisering har tidigare visats i amöbor Dictyostelium ideum och i däggdjursmakrofager 44,45 bekräftar comparability av denna modell.
Betydelsen av proteiner för virulens är oftast bestäms genom att jämföra tillväxt kinetik vildtyp och muterade bakterier. För att följa de bakteriella replika kinetik under loppet av infektionen, var tre larver offras vid varje tidpunkt (0, 5, 18, och 24 tim pi), den hemolymfa samlas in och samman och det CFU/0.1g av extraherade hemolymfa bestämdes. Efter en inledande dopp vid 5 tim pi, CFU av wt bakterier ökar upp till 24 h pi men undergår Δ DOTA-stam ingen replikation och avlägsnas vid 18 h pi (figur 4).
Förmågan av L. pneumophila att orsaka lys av makrofager i ett T4SS beroende sätt har länge dokumenterats 46, dock inga liknande studier har gjorts in vivo. Koncentrationen av cirkulerande hemocyter bestämdes vid 5, 18 och 24 h pi Larver infekterades med WT eller Δ
Figur 1. Infektion med L. pneumophila inducerar Dot / ICM-beroende larvdödlighet. 10 larver infekterade med PBS ensamt eller 10
Figur 2. Dödligheten är beroende av bakteriell interna. 10 L. pneumophila larver förbehandlades med 10 | il av 100 pM Cytochalasin D (CyD) under 4 h vid 37 ° C infekterades sedan med 10 7 WT och mortalitet övervakades vid 24 h pi förbehandlades larver uppvisade signifikant (P = 0,0066, oparat t-test) reducerade dödlighet. Resultaten representerar den MEAn vid fyra oberoende försök ± standardavvikelser med 10 larver per tillstånd.
Figur 3. Immunofluorescens avbildning av effektor proteiner i extraherade hemocyter. Hemocyter extraherades ur larver infekterade med L. pneumophila 130b WT eller Δ DOTA uttrycker 4HA-SIDC 41-918 på 5 tim pi Cellerna färgades med hjälp av anti-HA (röd) och anti-legionella (grön) antikroppar och DAPI DNA-fläck (blå) för att visualisera kärnor. 4HA-SIDC 41-918 observerades kring WT, men inte Δ DOTA, bakterier. Scale bar 5 um.
Figur 4. L. pneumophila replikerar inom G. Mellonella i en Dot / ICM-beroende sätt. Larver infekterades med WT eller Δ DOTA L. pneumophila och vid 0, 5, 18 och 24 h pi hemolymfa från tre infekterade insekter poolade, ströks ut på CYE-plattor och CFU bestämdes och normaliserad till inokulatet och till vikten av hemolymfa heras. WT L. pneumophila replikeras under loppet av experimentet medan Δ DOTA stammen klarnades inom 18 tim pi Resultaten är medelvärdet av tre separata experiment ± standardavvikelse.
Figur 5. Infektion med WT L. pneumophila medför betydande hemocyte förstörelse. hemocyter extraherades vid 5, 18, och 24 tim pi från larver infekterade med WT eller Δ DOTA L. pneumophila och livsdugliga celler räknades med hjälp av en hemocytometer. Ingen skillnad iantalet celler sågs vid 5 tim pi mellan stammarna men vid 18 h pi endast cirka 15% av hemocyter förbli i larver infekterade med WT-stammen jämfört med Δ DOTA stam. Resultaten är medelvärdet av tre separata experiment ± standardavvikelse.
Discussion
Galleria mellon larver modell för Legionella pneumophila infektion är ett användbart verktyg för in vivo-studier av patogenes. Här visas det att ett antal aspekter av makrofag infektion kan rekapituleras i G. mellon modellen, bland annat den roll som Dot / Icm T4BSS i virulens och bakteriell replikering och lokalisering av Dot / ICM-effektor SIDC. Dessutom visar vi att en kemisk hämmare av aktin polymerisation minskar avsevärt larvdödlighet, härma resultaten från macophages 47 och bevisningen att internalisering av bakterierna krävs för att orsaka larvdödligheten. Tidigare har det visats att variationerna i virulens mellan L. pneumophila stammar sett i andra infektionsmodeller kan verifieras i G. krävs mellon och induktion av virulensfaktorer i post-exponentiella tillväxtfasen för bakteriell virulens
Fastställande av CFU L. pneumophila från larver infekterade antingen var för sig eller i blandinfektioner kraftigt ökar användbarheten av modellen. Tidigare har flera faktorer upptäckts som har subtila effekter på bakteriell replikering i en eller flera modeller av infektion 29,48-51. Även om larverna inte har en adaptiv immunsystemet, närvaron av det medfödda immunsvaret ger starkare val jämfört med enbart makrofager, som kan tjäna till att amplifiera subtila fenotyper. Därför är det möjligt att även dessa stammar kommer sannolikt inte att påverka larvdödlighet, kan de visa minskad bakteriell replikering eller lämplighet i G. mellon modell. Samt replikering av L. pneumophila i larverna har vi visat betydande hemocyte utarmning sent i infektion. Som L.pneumophila väntas lysera värdceller vid slutet av sin replikationscykeln, mäta hemocyte utarmning kan också fungera som ett indirekt mått på bakteriell replikering. Hemocyte utarmning har tidigare satts i samband med insekts dödlighet i infektions 3,52, men nya resultat visar att bilden är mer komplex än först belived 37. Nyligen har det visats att svält av larver leder till ökad mottaglighet för infektion genom ett undertryckande av immunsvar 53. I de analyser som beskrivs här, har larverna inte matas under hela studien och det är inte känt hur väl matad larver skulle svara på L. pneumophila infektion.
En av fördelarna med G. mellon som modellorganism är enkel extraktion och kvantifiering av hemocyter från infekterade larver. Tidigare filmer har visat olika metoder för att extrahera hemocyter från insekter 54,55 dock träffathod presenteras här är enkla och lämpliga för omedelbar behandling. När extraherade, kan hemocyter lätt kvantifieras, som används för immunofluorescens, transmissionselektronmikroskopi 36 eller flödescytometri 56 eller odlade och infekterade ex vivo 3 vilket gör att cellernas respons på infektion ska undersökas i detalj. Detta ökar avsevärt flexibiliteten hos modellen. En varning för att immunofluorescens i G. mellon är det begränsade utbudet av antikroppar valideras mot G. mellon proteiner. Men studier har visat att skapa antikroppar mot larv proteiner 57 och antikroppar mot humana immunrelaterade proteiner befanns känna igen G. mellon proteiner 11 som visar potentialen för immunofluorescens på G. mellon hemocyter.
Enkelheten i G. mellon infektion möjliggör snabba, medel genomströmning skärmar som kundeanvändas för att jämföra virulensen hos olika Legionella-arter och stammar och kan användas för att ytterligare analysera tidigare identifierade virulensfaktorer såsom adhesionsmolekyler 58 eller typ 2-sekretionssystemet 59 som erfordras för virulens i andra modeller. Dessutom kommer användningen av denna modell för att möjliggöra identifiering och ytterligare karakterisering av nya virulensfaktorer inklusive utsöndrade och translokerade effektor-proteiner. Nyligen har det visats att fosfolipas C-aktiviteten hos L. pneumophila har en roll i G. mellon virulens 60 och att Dot / Icm effektorprotein SdhA krävs för virulens 37. Dessutom har vi nyligen visat att det finns ett samband mellan de fenotyper som observerats i G. mellon och i A / J mus-stam 37.
Detta understryker värdet av detta verktyg för att komplettera protozo miljö och encellig värd och murine infektionsmodeller. The G. mellon modell kommer att bli ännu mer värdefull i framtiden, när larver genomsekvensen kommer att finnas tillgängliga och fler genetiska verktyg är etablerade. Stegen i denna riktning omfattar den nyligen offentlig beskriver immunrelaterade transcriptome 61 och bildandet av ett initiativ för att främja geners uttryck i Lepidoptera spp. 62.
Genom att använda G. mellon larver, har vi ett antal enkla, snabba avläsningar av bakteriell virulens som kan användas för att undersöka patogenesen av L. pneumophila. Inrättande av dessa analyser och bredare screening av L. pneumophila stammar och serogrupper kommer att öka nyttan av detta nya verktyg och kommer att bidra till vår förståelse av L. pneumophila patogenes.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
CR Harding stöddes av Wellcome Trust student WT086724.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/ Equipment | |||
| ACES yeast extract (AYE) broth | 4 g ACES, 4 g yeast extract, 0.4 g α-ketoglutarate, pH 6.9, 400 ml H2O, autoclaved, 4 ml iron solution*, 4 ml cysteine solution* *add sterile ingredients after autoclaving |
||
| Charcoal buffered yeast extract (CYE) plates | As above, with the addition of 0.6 g activated charcoal and 6 g agar | ||
| Sterile iron solution (Ferric Pyrophosphate) | Sigma | P6526 | 0.6 mM solution, sterile filtered |
| Sterile cysteine solution | Sigma | C7880 | 3.3 mM solution, sterile filtered |
| G. mellonella (waxworms) | Livefood UK | W250 | |
| Anti-HA-Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate (TRITC) | Sigma | H9037 | |
| Anti-Legionella LPS | Cambridge Biosciences | PA1-7227 | |
| Anti-Rabbit IgG Alexa488 | Jackson Immunoreach | 711-485-152 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma | I6758 | |
| Dulbeccos phosphate buffered saline (D-PBS) | Sigma | D8662 | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1026 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma | A9434 | |
| Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | |
| Cytochalasin D | Biomol International | BML-T109-0001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Microtiter Syringe | Sigma | 24544 | |
| Cell counter, double, Improved Neubauer | VWR | 631-0926 | |
| Centrifuge | For centrifuging plates | ||
| Fluorescence microscope | Any microscope with appropriate filters for the required fluorophores | ||
| Inverted microscope | For viable cell counting | ||
| Puncture-proof glove | Turtleskin | ||
References
- Olsen, R. J., Watkins, M. E., Cantu, C. C., Beres, S. B., Musser, J. M. Virulence of serotype M3 Group A Streptococcus strains in wax worms (Galleria mellonella larvae. Virulence. 2, 111-119 (2011).
- Jander, G., Rahme, L. G., Ausubel, F. M. Positive correlation between virulence of Pseudomonas aeruginosa mutants in mice and insects. J. Bacteriol. 182, 3843-3845 (2000).
- Mukherjee, K., et al. Galleria mellonella as a model system for studying Listeria pathogenesis. Appl. Environ. Microbiol. 76, 310-317 (2010).
- Mowlds, P., Barron, A., Kavanagh, K. Physical stress primes the immune response of Galleria mellonella larvae to infection by Candida albicans. Microbes Infect. 10, 628-634 (2008).
- Renwick, J., Daly, P., Reeves, E. P., Kavanagh, K. Susceptibility of larvae of Galleria mellonella to infection by Aspergillus fumigatus is dependent upon stage of conidial germination. Mycopathologia. 161, 377-384 (2006).
- Banville, N., Fallon, J., McLoughlin, K., Kavanagh, K. Disruption of haemocyte function by exposure to cytochalasin b or nocodazole increases the susceptibility of Galleria mellonella larvae to infection. Microbes Infect. 13, 1191-1198 (2012).
- Mowlds, P., Kavanagh, K. Effect of pre-incubation temperature on susceptibility of Galleria mellonella larvae to infection by Candida albicans. Mycopathologia. 165, 5-12 (2008).
- Joyce, S. A., Gahan, C. G. Molecular pathogenesis of Listeria monocytogenes in the alternative model host Galleria mellonella. Microbiology. 156, 3456-3468 (2010).
- Mak, P., Zdybicka-Barabas, A., Cytrynska, M. A different repertoire of Galleria mellonella antimicrobial peptides in larvae challenged with bacteria and fungi. Dev. Comp. Immunol. 34, 1129-1136 (2010).
- Lavine, M. D., Strand, M. R. Insect hemocytes and their role in immunity. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1295-1309 (2002).
- Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils. Infect. Immun. 73, 4161-4170 (2005).
- Ratcliffe, N. A., Gagen, S. J. Studies on the in vivo cellular reactions of insects: an ultrastructural analysis of nodule formation in Galleria mellonella. Tissue Cell. 9, 73-85 (1977).
- Fraser, D. W., et al. Legionnaires' disease: description of an epidemic of pneumonia. N. Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).
- Rowbotham, T. J. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae. J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).
- Fields, B. S.
- Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 7, 7-19 (1993).
- Segal, G., Purcell, M., Shuman, H. A. Host cell killing and bacterial conjugation require overlapping sets of genes within a 22-kb region of the Legionella pneumophila genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1669-1674 (1998).
- Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
- Zhu, W., et al. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS One. 6, e17638 (2011).
- Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLoS Pathog. 5, e1000508 (2009).
- Horwitz, M. A. The Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) inhibits phagosome-lysosome fusion in human monocytes. J. Exp. Med. 158, 2108-2126 (1983).
- Swanson, M. S., Isberg, R. R. Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum. Infect. Immun. 63, 3609-3620 (1995).
- Segal, G., Shuman, H. A. Legionella pneumophila utilizes the same genes to multiply within Acanthamoeba castellanii and human macrophages. Infect. Immun. 67, 2117-2124 (1999).
- Brieland, J., et al. Replicative Legionella pneumophila lung infection in intratracheally inoculated A/J mice. A murine model of human Legionnaires' disease. Am. J. Pathol. 145, 1537-1546 (1994).
- Baskerville, A., Fitzgeorge, R. B., Broster, M., Hambleton, P., Dennis, P. J. Experimental transmission of legionnaires' disease by exposure to aerosols of Legionella pneumophila. Lancet. 2, 1389-1390 (1981).
- Wright, E. K., et al. Naip5 affects host susceptibility to the intracellular pathogen Legionella pneumophila. Curr. Biol. 13, 27-36 (2003).
- Padilla-Carlin, D. J., McMurray, D. N., Hickey, A. J. The guinea pig as a model of infectious diseases. Comp. Med. 58, 324-340 (2008).
- Komura, T., Yasui, C., Miyamoto, H., Nishikawa, Y. Caenorhabditis elegans as an alternative model host for Legionella pneumophila, and protective effects of Bifidobacterium infantis. Appl. Environ. Microbiol. 76, 4105-4108 (2011).
- Kubori, T., Shinzawa, N., Kanuka, H., Nagai, H. Legionella metaeffector exploits host proteasome to temporally regulate cognate effector. PLoS Pathog. 6, e1001216 (2010).
- Abu Kwaik, Y. The phagosome containing Legionella pneumophila within the protozoan Hartmannella vermiformis is surrounded by the rough endoplasmic reticulum. Appl. Environ. Microbiol. 62, 2022-2028 (1996).
- Molmeret, M., Horn, M., Wagner, M., Santic, M., Abu Kwaik, Y. Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens. Appl. Environ. Microbiol. 71, 10-1128 (2005).
- Solomon, J. M., Rupper, A., Cardelli, J. A., Isberg, R. R. Intracellular growth of Legionella pneumophila in Dictyostelium discoideum, a system for genetic analysis of host-pathogen interactions. Infect. Immun. 68, 2939-2947 (2000).
- Hilbi, H., Weber, S. S., Ragaz, C., Nyfeler, Y., Urwyler, S. Environmental predators as models for bacterial pathogenesis. Environ. Microbiol. 9, 563-575 (2007).
- Khoa, D. B., Trang, L. T., Takeda, M. Expression analyses of caspase-1 and related activities in the midgut of Galleria mellonella during metamorphosis. Insect Mol Biol. 21, 247-256 (2012).
- Brassinga, A. K., et al. Caenorhabditis is a metazoan host for Legionella. Cell Microbiol. 12, 343-361 (2011).
- Harding, C. R., et al. Legionella pneumophila pathogenesis in the Galleria mellonella infection model. Infect. Immun. 80, 2780-2790 (2012).
- Harding, C. R., et al. The Dot/Icm effector SdhA is necessary for virulence of Legionella pneumophila in Galleria mellonella and A/J mice. Infect. Immun. 81, 10-1128 (2013).
- Byrne, B., Swanson, M. S. Expression of Legionella pneumophila virulence traits in response to growth conditions. Infect. Immun. 66, 3029-3034 (1998).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis. J. Vis. Exp. , e4392 (2012).
- Suter, T. M., Viswanathan, V. K., Cianciotto, N. P. Isolation of a gene encoding a novel spectinomycin phosphotransferase from Legionella pneumophila. Antimicrob. Agents Chemother. 41, 1385-1388 (1997).
- Hilbi, H., Segal, G., Shuman, H. A. Icm/dot-dependent upregulation of phagocytosis by Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 42, 603-617 (2001).
- Watarai, M., et al. Legionella pneumophila is internalized by a macropinocytotic uptake pathway controlled by the Dot/Icm system and the mouse Lgn1 locus. J. Exp. Med. 194, 1081-1096 (2001).
- Santic, M., Asare, R., Doric, M., Abu Kwaik, Y. Host-dependent trigger of caspases and apoptosis by Legionella pneumophila. Infect. Immun. 75, 2903-2913 (2007).
- Weber, S. S., Ragaz, C., Reus, K., Nyfeler, Y., Hilbi, H. Legionella pneumophila exploits PI(4)P to anchor secreted effector proteins to the replicative vacuole. PLoS Pathog. 2 (4), e46 (2006).
- Luo, Z. Q., Isberg, R. R. Multiple substrates of the Legionella pneumophila Dot/Icm system identified by interbacterial protein transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 841-846 (2004).
- Alli, O. A., et al. Temporal pore formation-mediated egress from macrophages and alveolar epithelial cells by Legionella pneumophila. Infect. Immun. 68, 6431-6440 (2000).
- Elliott, J. A., Winn, W. C. Treatment of alveolar macrophages with cytochalasin D inhibits uptake and subsequent growth of Legionella pneumophila. Infect. Immun. 51, 31-36 (1986).
- Cirillo, S. L., Yan, L., Littman, M., Samrakandi, M. M., Cirillo, J. D. Role of the Legionella pneumophila rtxA gene in amoebae. Microbiology. 148, 1667-1677 (2002).
- Ridenour, D. A., Cirillo, S. L., Feng, S., Samrakandi, M. M., Cirillo, J. D. Identification of a gene that affects the efficiency of host cell infection by Legionella pneumophila in a temperature-dependent fashion. Infect. Immun. 71, 6256-6263 (2003).
- Samrakandi, M. M., Cirillo, S. L., Ridenour, D. A., Bermudez, L. E., Cirillo, J. D. Genetic and phenotypic differences between Legionella pneumophila strains. J. Clin. Microbiol. 40, 1352-1362 (2002).
- Lomma, M., et al. The Legionella pneumophila F-box protein Lpp2082 (AnkB) modulates ubiquitination of the host protein parvin B and promotes intracellular replication. Cell. Microbiol. , (2010).
- Champion, O. L., et al. Galleria mellonella as an alternative infection model for Yersinia pseudotuberculosis. Microbiology. 155, 1516-1522 (2009).
- Banville, N., Browne, N., Kavanagh, K. Effect of nutrient deprivation on the susceptibility of Galleria mellonella larvae to infection. Virulence. 3, 497-503 (2012).
- Qayum, A. A., Telang, A. A protocol for collecting and staining hemocytes from the yellow fever mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. , e2772 (2011).
- Stoepler, T. M., Castillo, J. C., Lill, J. T., Eleftherianos, I. A simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. J. Vis. Exp. , e4173 (2012).
- Garcia-Garcia, E., Garcia-Garcia, P. L., Rosales, C. An fMLP receptor is involved in activation of phagocytosis by hemocytes from specific insect species. Dev. Comp. Immunol. 33, 728-739 (2009).
- Bogus, M., Scheller, K. Allatotropin released by the brain controls larval molting in Galleria mellonella by affecting juvenile hormone synthesis. Int. J. Dev. Biol. 40, 205-210 (1996).
- Chang, B., Kura, F., Amemura-Maekawa, J., Koizumi, N., Watanabe, H. Identification of a novel adhesion molecule involved in the virulence of Legionella pneumophila. Infect. 73, 4272-4280 (2005).
- Cianciotto, N. P. Many substrates and functions of type II secretion: lessons learned from Legionella pneumophila. Future Microbiol. 4, 797-805 (2009).
- Aurass, P., et al. The Legionella pneumophila Dot/Icm-secreted effector PlcC/CegC1 together with PlcA and PlcB promotes virulence and belongs to a novel zinc metallophospholipase C family present in bacteria and fungi. J. Biol. Chem. , (2013).
- Vogel, H., Altincicek, B., Glockner, G., Vilcinskas, A. A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella. BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).
- Terenius, O., et al. RNA interference in Lepidoptera: an overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. J. Insect. Physiol. 57, 231-245 (2011).
