Summary
המקרופאגים כבר מזמן מוכרים כמרכיב קריטי של תגובות חיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות. הפיצוץ האחרון של ידע הנוגע להיבטים אבולוציוניים, גנטיים, והביוכימי של האינטראקציה בין מקרופגים וחיידקים חידש את תשומת לב מדעית למקרופאגים. מאמר זה מתאר שיטה להבדיל מקרופאגים ממח העצם של עכבר.
Abstract
המקרופאגים הם רכיבים קריטיים של תגובות חיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות, והם קו הגנה הראשון נגד פולשים זרים בשל פעילות microbicidal החזקה שלהם. המקרופאגים מופצים באופן נרחב בכל הגוף ונמצאים באיברים הלימפה, כבד, ריאות, מערכת עיכול, מערכת עצבים מרכזית, עצם, ועור. בגלל חלוקה מחודשת שלהם, הם משתתפים במגוון רחב של תהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים. המקרופאגים הם תאים תכליתיים מאוד שהם מסוגלים לזהות שינויי microenvironmental ולשמור על הומאוסטזיס רקמות. פתוגנים רבים התפתחו מנגנונים להשתמש מקרופאגים כמו סוסים טרויאניים כדי לשרוד, לשכפל, ולהדביק גם בני אדם ובעלי חיים ולהפיץ בכל הגוף. הפיצוץ האחרון של עניין בהיבטים אבולוציוניים, גנטיים, והביוכימי של אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן חידש את תשומת לב מדעית לגבי מקרופאגים. כאן, אנו מתאריםהליך לבודד ולטפח מקרופאגים ממח עצם עכברי שיספק מספר גדול של מקרופאגים לחקר אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן, כמו גם תהליכים אחרים.
Introduction
היבט משמעותי של תפקוד מקרופאג הוא תפקידם בחסינות מולדת ובעלי כושר הסתגלות. בגלל היכולת שלהם phagocytose חלקיקים, חיידקים או טפילי אינרטי, מקרופאגים הם קו הגנה ראשון נגד פולשים זרים. הפנים פעם, חיידקים מפורקים בתוך phagolysosomes. המקרופאגים גם לשלוח אותות גיוס ולאנטיגנים הווה לתאים אחרים של מערכת חיסון, כגון לימפוציטים מסוג T. המקרופאגים נגזרים ממונוציטים. מונוציטים מתעוררים במח עצם מתאי גזע מיאלואידית ולהגר לדם היקפי ורקמות שונות שבו הם להתמיין מקרופאגים. הערכה היא כי בעכבר בוגר ובריא מכיל כ 10 8 מקרופאגים שמופצים בכל הגוף באיברים שונים ורקמות (טבלה 1) 1,2. המקרופאגים להציג פנוטיפי גדול ומגוון תפקודי בגלל היכולת שלהם להסתגל ל3,4 microenvironment שלהם. Macrop החשוב ביותררכוש Hage הוא פעילות microbicidal שלהם, אשר מוגדרת על ידי היכולת שלהם phagocytose חיידקים ולהשמיד אותם. תגובת phagocytic מוגדרת על ידי ההפעלה של רשתות איתות מורכבות שהם מגורה על ידי מגע של חיידקים, ולכן, מקרופאגים לווסת ביטוי גנים כראוי בתגובה לגירויים שונים. לאחר phagocytosis, חיידקים בוטלו במבנה שנקרא phagolysosome, עם זאת, רבים חיידקים פתוגניים פיתחו אסטרטגיות לערער את תפקוד microbicidal של מקרופאגים 5. המגוון של מנגנוני חתרנות שמנוצלים על ידי מינים של חיידקים שונים הוא עדות למורכבות תהליך phagocytic 6 וphagolysosome biogenesis. מחלות זיהומיות הן בעיות בריאות אדם גדולות, ומספר רבים של מנגנונים ומולקולות להשתתף בפעילויות מיקרוביאלית מקרופאג. יתר על כן, המטרות של מאפייני microbicidal שנחטפו על ידי חיידקים אינן ידועות, ולכן, יש דוארxplosion עניין בהיבטים אבולוציוניים, גנטיים, והביוכימי של אינטראקציות בין מאכסן לפתוגן שחדש את תשומת לב מדעית לגבי מקרופאגים. נכון לעכשיו, מרבית המחקר בתחום נעשה על שורות תאי מקרופאגים, אשר נבדלות ממקרופאגים העיקריים בפעילות phagocytic, ייצור ציטוקינים והרגולציה של פרץ חמצוני. בנוסף, הם פחות מתאימים למיקרוסקופ. כדי לחקור את מקרופאגים-פתוגנים האינטראקציה מומלץ להשתמש מקרופאגים עיקריים, כגון המקרופאגים מח העצם נגזרו (BMDMs), שמפגינים תכונות פיסיולוגיות יותר. יתר על כן, זה אפשרי לעבוד על BMDMs מהונדס גנטי, כי מקרופאגים אלו עשויים להיות מבודדים ישירות מעכברים הטרנסגניים ו, עם הזמינות של טכנולוגיות חדישות כגון transfection lentiviral, פרופיל ביטוי הגנים שלהם ניתן לשנות על ידי ביטוי יתר של גן או התערבות RNA. כאן אנו מתארים הליך להבדיל מ 'עצם Murineחץ לתוך מקרופאגים שיספק מספר גדול של מקרופאגים ב -7 ימים לשונים פונקציונלי ניתוחים כגון פרוטאומיקה 7, transcriptomics 8, סחר תאיים מלומד 9 מחקרים, דינמיים 10, מסכי גנטיים (RNAi) וסמי הקרנת 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרת אתיקה
הפרוטוקול לטיפול בבעלי חיים אושר על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים "גיבוש דה Conseil Scientifique מרכז du et de משוכלל ונדיר הניסויי מדיקו-Chirurgical" המוסדי שלנו (CFREMC, היתר פרויקט 10-300,122,013 לאריק Ghigo) מאוניברסיטת Aix-Marseille בקנה אחד עם הכללים של Décret N ° 87-848 של 1987/10/19. הניסויים בוצעו בFaculté דה לרפואת de la Timone (מספר היתר ניסויים 13.385 לאריק Ghigo).
1. חומר ותרבות מדיה הכנה
- לעקר שני מלקחיים, שני מספריים, שני להבי כירורגים, מכתש ועלי.
- השג DMEM מלא המכיל 10% עוברי עגל בסרום (FCS), 2 גלוטמין מ"מ, 100 U / ml פניצילין ו100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין.
- לדלל 10x PBS במי distillated סטרילי כדי להשיג PBS 1X.
- השג קר כקרח 1x PBS, DMEM מלא קר כקרח, ווא DMEM המלאrmed 37 ° C.
2. הכנת L929 Supernatants הסלולרי
- לגדול L929 תאים למפגש (עשרים 175 סנטימטר 2 צלוחיות) בDMEM המלא על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
הערה: המושבה granulocyte-macrophage גירוי גורם (GM-CSF) נדרש כדי לגרום להתמיינות תאי hematopoietic מקרופאגים 12. L929 תאים לייצר GM-CSF.
- בנקודת מפגש, להחליף תקשורת ותרבות עם DMEM להשלים טרי. העבר את צלוחיות ל32 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 10 ימים.
- לאסוף, בריכה וצנטריפוגות supernatants ב750 XG 10 דקות. השלך כדורי תא.
- supernatants חנות ב15 צינורות מיליליטר ולאחסן ב -20 ° C.
3. מח עצם נגזרות Macrophage (BMDM) הכנה
- להקריב את העכבר 1 על ידי נקע בצוואר הרחם.
- השתמש בסכין כירורגית סטרילי לאורך כל הניסוי. לחטא את העור עם alco 70%חול. עושה חתך בחלק העליון של כל רגל אחורית ולמשוך למטה את העור לכיוון כף הרגל כדי לחשוף את השריר.
- חותכים את רגליו האחוריות, להסיר את העור עם מספריים סטריליים ומלקחיים סטריליות. הנח את הרגליים בתוך צלחת פטרי סטרילית (35/10 מ"מ) המכילה סטרילי, קר כקרח 1x PBS (5 מיליליטר).
- הסר את הבשר ושרירים ההקפדה על העצמות עם מספריים ומלקחיים סטריליות.
- מעביר את העצמות לתוך צלחת חדשה, סטרילי פטרי (35/10 מ"מ) המכילה קר כקרח, 1x PBS סטרילי (5 מיליליטר). שטוף את העצמות שתי פעמים עם 5 מיליליטר קר כקרח, 1x PBS סטרילית.
- העבר את העצם לתוך מרגמה סטרילי המכילה 5 מיליליטר קר כקרח, 1x PBS סטרילית.
- חותכים את עצם השוק מעצם הירך במפרק עם מספריים סטריליים. לרסק את העצמות בעדינות במכתש סטרילי המכיל 5 מיליליטר קר כקרח, 1x PBS סטרילית באמצעות העלי.
- לאסוף את supernatant ב15 צינורות מיליליטר קר כקרח. חזור 3x שלב זה.
- לסנן דרך stra תא ניילון 70 מיקרומטרINER להסיר שברים מוצקים. צנטריפוגה התסנין ב450 XG 10 דקות ב 4 ° C.
- בעדינות זורקי supernatant. לנתק את גלולה ב10 מיליליטר חיץ תמוגה תא דם האדום ל30 שניות. הוסף 20, DMEM מלא קר כקרח מיליליטר.
הערה: המטרה של שלב זה היא להסיר לזהם כדוריות דם אדומים, ולכן יש לבצע שלב זה תוך 2 דקות, כדי למנוע שינוי תא hematopoietic ידי חיץ תמוגה תא הדם האדום.
- צנטריפוגה ב XG 450 10 דקות ב 4 ° C. בעדינות זורקי supernatant. לנתק את גלולה ב20 מיליליטר DMEM מלא כי כבר חימם ל37 ° C.
- להעביר את התאים ניתקו לתוך 2 צלחות פטרי (100/20 מ"מ). דגירה אותם במשך 4 שעות ב 37 ° C.
- לאסוף supernatants ב50 מיליליטר צינורות בטמפרטורת חדר. מחק את המנות המכילות מקרופאגים תושב.
הערה: המטרה של שלב זה היא לחסל את Marro עצם תושבמקרופאגים w ידי היכולת שלהם לדבוק בפלסטיק שטופלה בתרבות. מקרופאגים תושב אלה עשויים לשמש בניסויים אחרים.
- צנטריפוגה supernatants נאסף ב450 XG 10 דקות ב 4 ° C. בטל supernatant.
- לנתק בעדינות את הכדור ב10 מיליליטר DMEM מלא המכיל 15% L929 supernatant תא. סנן את התאים דרך מסננת תא ניילון 40 מיקרומטר.
- לשחזר את התסנין. הוסף את התסנין שנאסף (10 מיליליטר) ל140 מיליליטר DMEM השלם שכבר השלים עם 15% L929 תקשורת סלולרי.
- הפץ 10 מיליליטר של ההשעיה התא לכל צלחת פטרי (15 צלחות פטרי, 100/20 מ"מ). דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- לגדל תאים במשך 3 ימים
- הוסף 10 מיליליטר DMEM השלם שכבר השלים עם 15% L929. דגירה תאים למשך 4 ימים נוספים.
הערה: צג צמיחת תאים מעת לעת עם מיקרוסקופ הפוכה (שלבים 3.14-3.16). מקרופאגים חסיד יהיונצפה לאחר 3 ימים של התרבות.
4. BMDMs קצירה
- הסר את supernatant. שטוף BMDMs 2 פעמים עם DMEM המלא
- הוסף 5 מיליליטר DMEM המלא כי כבר חימם ל37 ° C. ניתוק BMDMs בעדינות על ידי גירוד עם שוטר גומי.
- לאסוף BMDMs ב50 צינורות מיליליטר ו צנטריפוגות ב XG 450 10 דקות. בעדינות לנתק את כדורי תא ב20 מיליליטר DMEM המלא.
- רוזן BMDMs בנוכחות trypan הכחול (אין תמותה יותר מ -10% יש לשים לב).
הערה: באופן כללי, כ 6-7.5 x 10 7 מקרופאגים מתקבלים מ15 צלחות פטרי (100/20 מ"מ) של מקרופאגים. ישנם כ 4-5 x 10 6 מקרופאגים / צלחת פטרי (100/20 מ"מ).
- הכן BMDMs כנדרש לצורך הניסוי. לאחר 16 שעות בתקשורת מלאה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, מקרופאגים שוב לדבוק בתמיכה.
5. אחסון BMDMs
- לאסוף BMDMs המבודד (שלב 4.3). צנטריפוגה ב XG 450 10 דקות. הערה: BMDMs עשוי להיות קפוא בחנקן נוזלי.
- כדורי תא גלול בהקפאת תקשורת בהיקף של DMSO 10% וFCS 90% בריכוז סופי של 4 x 10 6 תאים / מיליליטר ו פיפטה 1 מיליליטר לכל מבחנה.
- להקפיא את התאים בקצב קירור של 1 ° C / min. לאחר 24 שעות, להעביר את אמפולה למכל חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מטרתה של שיטה זו הייתה להשיג בקלות מספר גדול של מקרופאגים בכמה ימים. הכנת תא מח העצם מודגמת באיור 1. עצמות מהרגל האחורית נאספו וניפצו במכתש. ברגע שמקרופאגים תושב הוצאו מהכנת התא במח העצם, תאי מח עצם הודגרו עם GM-CSF (יום 0). לאחר 3 ימים, התאים, שהיו עגולים nonadherent ולפני התרבות, מתחילים להתמיין למקרופאגים ולדבוק (איור 1 א). ניתוח cytometry באמצעות F4/80 וסמני HLA-DR חשפו כי תאים ביטאו שני סמנים ובכך להוכיח שהם מובחנים למקרופאגים (איור 1). לאחר 7 ימים, monolayer BMDM הושג עם 6-7.5 x 10 7 BMDM / עכבר. המקרופאגים ניתן להשתמש בסוגים שונים של ניסויים (איור 2). הפעילויות פונקציונליות של BMDMs עשויות להיקבע בדרכים שונות. לדוגמא, phagocytos BMDMכלומר היה פיקוח על ידי הפנמת חרוז לטקס. מספר חרוזים לכל תא גדל לאורך הזמן (איור 2 א). פוטנציאל endocytic BMDM (איור 2), אינטראקציות פתוגן חיידקים (איור 2 ג) ומסלולי העברת אותות (איור 2 ד) הוערכו אף הן.
| מקום | סוגי תאים |
| עצם | Osteoclast |
| מח עצם | Pro-מונוציטים, מקרופאג |
| מערכת עצבים מרכזית | תא microglial |
| propria lamina | מקרופאג תושב |
| כבד | תא Kupffer |
| ריאות | מקרופאג מכתשיים |
| דם היקפי | מונוציטים |
| חלל הצפק | מקרופאג הצפק |
| עור | תא לנגרהנס |
| טחול | מקרופאג תושב |
| קורנית | מקרופאג תושב |
טבלת 1. מקורות Macrophage ברקמות ונוזלים.
איור 1. בתצוגה סכמטית של ייצור BMDM. () נתון זה ממחיש את הצעדים של בידול BMDM מבידול אב (יום 0) להבשיל מקרופאגים (day7). (ב) ניתוח FACS ממחיש את הטוהר של תאים מבודדים ביממה 7 באמצעות סמני מקרופאגים HLA-DR וF4/80. לחץ כאן כדי להציג גדולדמות r.
איור 2. דוגמאות לניסויים שהם אפשריים עם BMDMs. () Assay Phagocytosis. BMDMs הודגרו לתקופות זמן שונות עם חרוזים לטקס, וספיגת חרוז נצפתה על ידי מיקרוסקופ. (ב) לוקליזציה lipopolysaccharide burnetii תאית Coxiella (LPS) בBMDMs. LPS (באדום) היה מקומי לתא שמטפח קרום הקשורים lysosomal חלבון -1 (LAMP-1) (בכחול), אבל לא cathepsin D (בירוק). הניסוי הזה מוכיח כי LPS נמצא בendosomes מאוחר שאינן מסוגלים להתמזג עם lysosomes. BMDMs (C) נגוע בTropheryma whipplei (באדום) לא מקומי בתא שמטפח cathepsin D (בירוק). immunob נציג (D)הרבה הוכחת מוחלטת (t) ופוספורילציה (p) p38α רמות MAP קינאז בBMDMs Escherichia coli מגורה-LPS (1 מיקרוגרם / מיליליטר). ברים סולם מייצגים 5 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר במסמך זה מפרט את שיטה להפקת כמויות גדולות של BMDMs. BMDM הם תאים ראשוניים ויש לי את הפונקציה ותכונות של מקרופאגים מובחנים ממונוציטים ביולוגיים כי יש בוגרים, בניגוד לשורות תאי מקרופאג, שהם לא בשלים. BMDMs עשוי לשמש לסינון גנטי (RNAi), הקרנת סמים, מחקרים פונקציונליים, מחקרי אינטראקציה המאכסן לפתוגן ותחומים רבים אחרים של חקירה.
ההליך המוצג כאן הוא פשוט מאוד ואינו דורש שום ציוד מיוחד, ולכן הוא יכול להתבצע בקלות במעבדה או בכיתה. שיטה זו דורשת קצת תרגול ומיומנות ידנית. כמו כן, ניתן לאחסן את BMDMs בחנקן נוזלי, וכך להקל על ניסויים עתידיים.
ישנם מספר צעדים קריטיים לתרבות BMDM מוצלחת: 1) שמירה על תרבות סטרילי, בריאה; 2) שאיבת מח עצם צריך להיות יעיל; 3) L929 supאיכות ernatant היא קריטית; 4) אל תחשפו את התאים למאגר תמוגה תא הדם האדום ליותר מ -2 דקות, כדי למנוע נזק לתאי hematopoietic.
זה אפשרי לעשות קצת שינוי של הפרוטוקול אבל יש בהגבלת מספר. 1) ניתן להחליף DMEM ידי RPMI 1640, אבל ייצור BMDM הוא פחות יעיל; 2) המסחרי M-CSF (500-1000 UI / מיליליטר) יכול לשמש במקום L929 supernatant, אבל זה יקר ו-M-CSF צריך להיות הוספתי כל 2 ימים לתאים במהלך תהליך ההתמיינות: 3) לחלופין מח עצם ניתן נמתח מעצם שימוש במזרק מצויד ב25 מחט G במקום לנפץ את העצמות במכתש סטרילית באמצעות העלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין קונפליקטים מוצהרים של ריבית.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי CNRS (PICS 2012-2014 לEG) ועל ידי מענק מRegione קמפניה (n.5 LR, -28.03.2002 לג'ובאנה מוטולה). פיליפו קונטי הוא בחור של שיתוף הפעולה המדעי קרן'' Infectiopole Sud.'' ניקולה Boucherit הוא עמית של המשרד הצרפתי למחקר וטכנולוגיה. היו מקורות המימון לא היה תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף נתונים, ניתוח נתונים, החלטה לפרסם, או הכנת כתב יד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco Life Technologies | 21969-035 | |
| Fetal Calf Serum | Gibco Life Technologies | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15070 | |
| Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-024 | |
| PBS (10x) | Lonza | BEM515F | |
| Red Blood Cell Lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer 70 μm Nylon | BD Falcon | 352350 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| Petri dishes (100/20 mm) | any supplier | n/a | culture treated |
| Petri dishes (35/10 mm) | any supplier | n/a |
References
- Rutherford, M. S., Witsell, A., Schook, L. B. Mechanisms generating functionally heterogeneous macrophages: chaos revisited. J. Leukocyte Biol. 53, 602-618 (1993).
- Van Furth, R. Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).
- Adams, D., Halmiton, T. Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).
- Morris, L., Graham, C. F., Gordon, S. Macrophages in haemopoietic and other tissues of the developing mouse detected by the monoclonal antibody F4/80. Development. 112, 517-526 (1991).
- Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Phagocytosis of microbes: complexity in action. Annu. Rev. Immunol. 20, 825-852 (2002).
- Castagna, A., Polati, R., Bossi, A. M., Girelli, D. Monocyte/macrophage proteomics: recent findings and biomedical applications. Expert Rev. Proteomics. 9, 201-215 (2012).
- Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. J. Immunol. 181, 3733-3739 (2008).
- Barry, A. O., et al. Impaired stimulation of p38alpha-MAPK/Vps41-HOPS by LPS from pathogenic Coxiella burnetii prevents trafficking to microbicidal phagolysosomes. Cell Host Microbe. 12, 751-763 (2012).
- Henry, R. M., Hoppe, A. D., Joshi, N., Swanson, J. A. The uniformity of phagosome maturation in macrophages. J. Cell Biol. 164, 185-194 (2004).
- Sundaramurthy, V., et al. Integration of Chemical and RNAi Multiparametric Profiles Identifies Triggers of Intracellular Mycobacterial Killing. Cell Host Microbe. 13, 129-142 (2013).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant. J. Leukocyte Biol. 41, 83-91 (1987).
