Summary
Macrofagen zijn lang erkend als een kritische component van het aangeboren en adaptieve immuunsysteem. De recente explosie van kennis met betrekking tot evolutionaire, genetische en biochemische aspecten van de interactie tussen macrofagen en microben heeft wetenschappelijke aandacht vernieuwd macrofagen. Dit artikel beschrijft een methode om macrofagen te onderscheiden van muizen beenmerg.
Abstract
Macrofagen zijn kritische componenten van het aangeboren en adaptieve immuunrespons, en zij zijn de eerste lijn van verdediging tegen vreemde indringers vanwege hun krachtige microbicidal activiteiten. Macrofagen zijn ruim verdeeld door het lichaam en in de lymfoïde organen, lever, longen, maagdarmkanaal, centraal zenuwstelsel, botten en huid. Door hun verdeling, zij aan diverse fysiologische en pathologische processen. Macrofagen zijn zeer veelzijdig cellen die in staat zijn de micro-omgeving veranderingen herkennen en om weefsel homeostase te behouden zijn. Vele pathogenen mechanismen ontwikkeld om macrofagen als Trojaanse paarden overleven repliceren en infecteren mens en dier en verspreiden door het hele lichaam. De recente explosie van interesse in evolutionaire, genetische en biochemische aspecten van gastheer-pathogeen interacties heeft wetenschappelijke aandacht met betrekking tot macrofagen vernieuwd. Hier beschrijven we eenprocedure voor het isoleren en kweken van murine macrofagen beenmerg dat grote aantallen macrofagen zal voor het bestuderen gastheer-pathogeen interacties en andere processen.
Introduction
Een belangrijk aspect van macrofagen is hun rol bij aangeboren en adaptieve immuniteit. Vanwege hun vermogen om inerte deeltjes, bacteriën of parasieten fagocyteren, macrofagen zijn een eerste lijn van verdediging tegen vreemde indringers. Eenmaal geïnternaliseerd, zijn microben afgebroken binnen phagolysosomes. Macrofagen ook werving signalen voor en presenteren antigenen sturen naar andere afweercellen, zoals T-lymfocyten. Macrofagen zijn afgeleid van monocyten. Monocyten ontstaan in het beenmerg van myeloïde stamcellen en migreren naar perifere bloed en diverse weefsels waar ze differentiëren tot macrofagen. Geschat wordt dat een gezonde volwassen muis bevat ongeveer 10 8 macrofagen die zijn verdeeld over het lichaam in diverse organen en weefsels (Tabel 1) 1.2. Macrofagen weer grote fenotypische en functionele diversiteit vanwege hun vermogen aan te passen aan hun micromilieu 3,4. De belangrijkste macrophage eigenschap is hun microbicide activiteit, die wordt gedefinieerd door hun vermogen om microben fagocyteren en vernietigen. De fagocytische wordt gedefinieerd door de activering van complexe signaalnetwerken die worden gestimuleerd door microbiële contact, dus macrofagen moduleren genexpressie adequaat in reactie op verschillende stimuli. Na fagocytose worden geëlimineerd microben in een structuur die de fagolysosoom, maar hebben veel pathogene microben strategieën ontwikkeld om de microbicide werking van de macrofagen 5 ondermijnen. De diversiteit van subversie mechanismen die worden gebruikt door verschillende microbiële species is een bewijs van de complexiteit van het proces fagocytaire 6 en fagolysosoom biogenese. Infectieziekten zijn belangrijke problemen voor de volksgezondheid, en tal van mechanismen en moleculen deelnemen aan macrofaag antimicrobiële activiteiten. Verder zijn de doelstellingen van de microbicidal eigenschappen die worden gekaapt door microben blijven onbekend, dus is er een eXplosion van belang in de evolutionaire, genetische en biochemische aspecten van gastheer-pathogeen interacties die wetenschappelijke aandacht met betrekking tot macrofagen heeft vernieuwd. Momenteel wordt het grootste deel van het onderzoek in het veld gedaan op macrofagen cellijnen, die verschillen van primaire macrofagen in de fagocytoseactiviteit, de cytokinen productie en de regulering van de oxidatieve burst. Bovendien zijn ze minder geschikt voor microscopie. Om de interactie macrofagen-pathogenen te onderzoeken is het aanbevolen om de primaire macrofagen, zoals beenmerg afgeleide macrofagen (BMDMs), die meer fysiologische kenmerken vertonen gebruiken. Bovendien is het mogelijk om te werken aan genetisch gemodificeerde BMDMs, omdat deze direct macrofagen kunnen worden geïsoleerd uit transgene muizen en, met de beschikbaarheid van nieuwe technologieën zoals lentivirale transfectie hun genexpressie profiel kan worden veranderd door overexpressie van de genen of RNA interferentie. Hier beschrijven we een werkwijze murine bone m differentiërenpijl in macrofagen die grote aantallen macrofagen zal 7 dagen voor verschillende functionele analyses uitgevoerd, zoals proteomics 7, transcriptomics 8, intracellulair verkeer bestudeert 9, dynamische studies 10, genetische screens (RNAi) en drug screening 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek Verklaring
Het protocol voor dier administratiekosten werd goedgekeurd door onze institutionele Animal Ethics Committee "Conseil Scientifique du Centre de Formation et de Recherche Experimentele Medico-Chirurgical" (CFREMC, Project vergunning 10-300122013 Eric Ghigo) van Aix-Marseille University in overeenstemming met de regels van decreet nr. 87-848 van 1987/10/19. De experimenten werden uitgevoerd aan de Faculte de Medecine de la Timone (Experimenteren vergunning nummer 13,385 Eric Ghigo).
1. Materiaal en cultuur Media Voorbereiding
- Steriliseren twee tangen, twee scharen, twee chirurgische mesjes, een mortier en een stamper.
- Verkrijgen compleet DMEM dat 10% foetaal kalfsserum (FCS), 2 mM glutamine, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine.
- Verdunnen 10x PBS in steriel gedestilleerd water om 1x PBS verkrijgen.
- Verkrijgen ijskoude 1x PBS, ijskoude compleet DMEM, compleet DMEM waRmed tot 37 ° C.
2. Bereiding van L929 celsupernatanten
- Groeien L929 cellen tot confluentie (twintig 175 cm2 kolven) in volledige DMEM bij 37 ° C, 5% CO2.
Opmerking: granulocyt-macrofaag kolonie stimulerende factor (GM-CSF) vereist om hematopoietische celdifferentiatie induceren in macrofagen 12. L929 cellen produceren GM-CSF.
- Bij samenloop, vervang cultuur media met verse volledige DMEM. Transfer kolven tot 32 ° C, 5% CO 2 voor 10 dagen.
- Verzamelen, zwembad en centrifuge de bovenstaande vloeistoffen bij 750 xg gedurende 10 minuten. Gooi cel pellets.
- WINKEL supernatanten in 15 ml buizen en bewaar bij -20 ° C.
3. Bone Marrow-afgeleide macrofagen (BMDM) Voorbereiding
- Sacrifice 1 muis door cervicale dislocatie.
- Gebruik steriele chirurgische mesjes gedurende het experiment. Ontsmet de huid met 70% alcoholhol. Een insnijding bovenaan elke achterpoot en trekt de huid naar beneden naar de voet naar de spier bloot.
- Snijd de achterpoten, verwijder de huid met een steriele schaar en een steriel pincet. Plaats benen in een steriele petrischaal (35/10 mm) met steriele, ijskoude 1x PBS (5 ml).
- Verwijder het vlees en spieren die zich houden aan de botten met een steriele schaar en pincet.
- Breng de botten in een nieuwe, steriele petrischaal (35/10 mm) met ijskoude steriele 1x PBS (5 ml). Was de botten twee keer met 5 ml ijskoude, steriele 1x PBS.
- Breng de been in een steriele vijzel met 5 ml ijskoude, steriele 1x PBS.
- Snijd het scheenbeen van het dijbeen bij het gewricht met een steriele schaar. Breek de botten voorzichtig in een steriele vijzel met 5 ml ijskoude, steriele 1x PBS met behulp van een stamper.
- Verzamel de bovenstaande vloeistof in ijskoud 15 ml buizen. Herhaal deze stap 3x.
- Filtreer door een 70 um Nylon cel strainer solide fragmenten te verwijderen. Centrifugeer het filtraat bij 450 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Voorzichtig gooi het supernatant. Distantiëren de pellet in 10 ml rode bloedcel lysisbuffer gedurende 30 sec. Voeg 20 ml ijskoude, compleet DMEM.
Opmerking: Het doel van deze stap is het verwijderen van verontreinigende rode bloedcellen, dus moet deze stap binnen 2 minuten worden uitgevoerd om hematopoietische cellen wijziging van de rode bloedcel lysisbuffer voorkomen.
- Centrifugeer bij 450 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Voorzichtig gooi het supernatant. Distantiëren de pellet in 20 ml compleet DMEM dat is verwarmd tot 37 ° C.
- Breng de gedissocieerde cellen in 2 petrischaaltjes (100/20 mm). Incubeer ze gedurende 4 uur bij 37 ° C.
- Verzamel de bovenstaande vloeistof in 50 ml buizen bij kamertemperatuur. Gooi de gerechten die de bewoner macrofagen bevatten.
Opmerking: Het doel van deze stap is om de bewoner bot marro eliminerenw macrofagen door hun vermogen om zich te houden aan-cultuur behandeld kunststof. Deze resident macrofagen kunnen worden gebruikt in andere experimenten.
- Centrifugeer de verzamelde supernatanten bij 450 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
- Distantiëren voorzichtig de pellet in 10 ml compleet DMEM met 15% L929 celsupernatant. Filter de cellen door een 40 um nylon cel zeef.
- Recover het filtraat. Voeg de verzamelde filtraat (10 ml) om 140 ml volledig DMEM dat is aangevuld met 15% L929 celmedium.
- Verdeel 10 ml van de celsuspensie per Petrischaal (15 Petrischalen, 100/20 mm). Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2.
- Groeien cellen gedurende 3 dagen
- Voeg 10 ml volledig DMEM dat is aangevuld met 15% L929. Incubeer de cellen gedurende 4 extra dagen.
Opmerking: Monitor celgroei periodiek met een omgekeerde microscoop (stappen 3,14-3,16). Hechtende macrofagen zal wordenwaargenomen na 3 dagen van de cultuur.
4. Oogsten BMDMs
- Verwijder het supernatant. Was BMDMs 2 keer met complete DMEM
- Voeg 5 ml compleet DMEM dat is verwarmd tot 37 ° C. Los BMDMs door voorzichtig schrapen met een rubberen politieman.
- Verzamel BMDMs in 50 ml en centrifugeer bij 450 xg gedurende 10 minuten. Zachtjes distantiëren cel pellets in 20 ml compleet DMEM.
- Telling BMDMs in aanwezigheid van trypan blauw (niet meer dan 10% sterfte in acht worden genomen).
Opmerking: In het algemeen worden ongeveer 6-7,5 x 10 7 macrofagen verkregen uit 15 petrischalen (100/20 mm) van macrofagen. Er zijn ongeveer 4-5 x 10 6 macrofagen / petrischaal (100/20 mm).
- Bereid BMDMs zoals vereist voor het experiment. Na 16 uur in compleet medium bij 37 ° C, 5% CO2, macrofagen weer houden aan de drager.
5. Het opslaan BMDMs
- Verzamel geïsoleerde BMDMs (stap 4.3). Centrifugeer bij 450 xg gedurende 10 minuten. Opmerking: BMDMs kan in vloeibare stikstof worden bevroren.
- Resuspendeer celpellets bevriezen medium bestaande uit 10% DMSO en 90% FCS in een uiteindelijke concentratie van 4 x 10 6 cellen / ml en 1 ml pipet in elke ampul.
- Bevries de cellen bij een afkoelsnelheid van 1 ° C / min. Na 24 uur, breng de ampul een vloeibare stikstof container voor langdurige opslag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het doel van deze methode grote aantallen macrofagen gemakkelijk te vinden in een paar dagen. De beenmergcelinjectie bereiding wordt geïllustreerd in Figuur 1. Beenderen van het achterbeen werden verzameld en sloeg in een vijzel. Zodra de bewoner macrofagen werden uit het beenmerg celpreparaat, beenmergcellen werden geïncubeerd met GM-CSF (Dag 0). Na 3 dagen, de cellen, die rond en hechtende voor cultuur waren, beginnen te differentiëren tot macrofagen en hechten (figuur 1A). Cytometrie analyse met behulp F4/80 en HLA-DR markers bleek dat cellen brachten beide markeerders en het blijkt dat ze worden onderverdeeld in macrofagen (Figuur 1B). Na 7 dagen werd een BMDM monolaag verkregen met 6-7,5 x 10 7 BMDM / muis. Macrofagen kunnen worden gebruikt in verschillende soorten experimenten (figuur 2). De functionele activiteiten van het BMDMs kan worden bepaald op verschillende manieren. Bijvoorbeeld, BMDM phagocytoswil werd gevolgd door latex bolletje internalisatie. Het aantal kralen per cel toegenomen in de tijd (Figuur 2A). BMDM endocytisch potentiële (Figuur 2B), werden bacteriële pathogeen interacties (figuur 2C) en signaaltransductie (figuur 2D) ook beoordeeld.
| Plaats | Celtypen |
| Bot | Osteoclast |
| Beenmerg | Pro-monocyt, macrofaag |
| Centrale zenuwstelsel | Microgliale cel |
| Lamina propria | Resident macrofaag |
| Lever | Kupffer cel |
| Long | Alveolaire macrofagen |
| Perifeer bloed | Monocyten |
| Buikholte | Peritoneale macrofagen |
| Huid | Langerhans cel |
| Milt | Resident macrofaag |
| Thymus | Resident macrofaag |
Tabel 1. Macrofaag bronnen in weefsels en vloeistoffen.
Figuur 1. Schematische weergave van BMDM productie. (A) Dit cijfer illustreert de stappen van BMDM differentiatie van voorlopercellen differentiatie (dag 0) tot macrofagen (day7) rijpen. (B) FACS analyse illustreert de zuiverheid van geïsoleerde cellen op dag 7 met behulp van macrofagen merkers HLA-DR en F4/80. Klik hier om groot te bekijkenr figuur.
Figuur 2. Voorbeelden van experimenten die mogelijk is met BMDMs zijn. (A) Fagocytose assay. BMDMs werden gedurende verschillende tijdsperioden met latex kralen, kralen en opname werd waargenomen door microscopie. (B) Intracellular Coxiella burnetii lipopolysaccharide (LPS) lokalisatie in BMDMs. LPS (in rood) werd gelokaliseerd op een compartiment dat-lysosomale geassocieerd membraan herbergt proteïne-1 (LAMP-1) (in het blauw), maar niet cathepsine D (in het groen). Dit experiment toont aan dat LPS aanwezig in de late endosomen die niet in staat te fuseren met lysosomen is. (C) BMDMs geïnfecteerd met Tropheryma whipplei (in rood) is niet gelokaliseerd in compartiment dat cathepsine D havens (in het groen). (D) Vertegenwoordiger immunoblot aantonen totaal (t) en gefosforyleerd (p) p38a MAP kinase niveaus in Escherichia coli LPS-gestimuleerde BMDMs (1 ug / ml). Schaalbalken vertegenwoordigen 5 urn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hierin beschreven protocol detailleert een methode om grote aantallen BMDMs produceren. BMDM primaire cellen en de biologische werking en eigenschappen van macrofagen gedifferentieerd uit monocyten omdat er volwassen, in tegenstelling tot macrofaag cellijnen die onvolwassen zijn. BMDMs kunnen worden gebruikt voor genetische screening (RNAi), drug discovery, functionele studies, gastheer-pathogeen interactie studies en vele andere gebieden van onderzoek.
De hierin voorgestelde procedure is zeer eenvoudig en vereist geen gespecialiseerde apparatuur nodig, daarom kan het gemakkelijk worden uitgevoerd in een laboratorium of klaslokaal. Deze methode vereist enige oefening en handvaardigheid. Het is ook mogelijk de BMDMs bewaren in vloeibare stikstof, waardoor toekomstige experimenten vergemakkelijkt.
Er zijn een aantal cruciale stappen voor een succesvolle BMDM cultuur: 1) behoud van een steriele, gezonde cultuur, 2) beenmerg extractie moet efficiënt zijn, 3) L929 supernatant kwaliteit is essentieel, 4) geen cellen blootstellen aan de rode bloedcel lysisbuffer gedurende meer dan 2 minuten hematopoietische cellen voorkomen.
Het is mogelijk om enkele wijzigingen van het protocol doen, maar er zijn in het beperken nummer. 1) DMEM kan worden vervangen door RPMI 1640, maar BMDM productie minder efficiënt, 2) commercieel M-CSF (500-1000 IE / ml) kan worden gebruikt in plaats van L929 supernatant, maar het is duur en M-CSF moet worden 2 dagen toegevoegd elke aan cellen tijdens de differentiatie proces; 3) alternatief beenmerg kan worden geëxtrudeerd uit bot met behulp van een injectiespuit met 25 G naald in plaats van het inslaan van de botten in een steriele vijzel met stamper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er zijn geen verklaarde belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het CNRS (PICS 2012-2014 naar EG) en door een subsidie van Regione Campania (LR n.5, 28.03.2002 om Giovanna Mottola). Filippo Conti is een fellow van de wetenschappelijke samenwerking Stichting'' Infectiopole Sud.'' Nicola Boucherit is een fellow van het Franse Ministerie van Onderzoek en Technologie. De financieringsbronnen had geen rol in de onderzoeksopzet, dataverzameling, data-analyse, besluit tot publicatie of manuscript voorbereiding.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco Life Technologies | 21969-035 | |
| Fetal Calf Serum | Gibco Life Technologies | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15070 | |
| Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-024 | |
| PBS (10x) | Lonza | BEM515F | |
| Red Blood Cell Lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer 70 μm Nylon | BD Falcon | 352350 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| Petri dishes (100/20 mm) | any supplier | n/a | culture treated |
| Petri dishes (35/10 mm) | any supplier | n/a |
References
- Rutherford, M. S., Witsell, A., Schook, L. B. Mechanisms generating functionally heterogeneous macrophages: chaos revisited. J. Leukocyte Biol. 53, 602-618 (1993).
- Van Furth, R. Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).
- Adams, D., Halmiton, T. Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).
- Morris, L., Graham, C. F., Gordon, S. Macrophages in haemopoietic and other tissues of the developing mouse detected by the monoclonal antibody F4/80. Development. 112, 517-526 (1991).
- Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Phagocytosis of microbes: complexity in action. Annu. Rev. Immunol. 20, 825-852 (2002).
- Castagna, A., Polati, R., Bossi, A. M., Girelli, D. Monocyte/macrophage proteomics: recent findings and biomedical applications. Expert Rev. Proteomics. 9, 201-215 (2012).
- Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. J. Immunol. 181, 3733-3739 (2008).
- Barry, A. O., et al. Impaired stimulation of p38alpha-MAPK/Vps41-HOPS by LPS from pathogenic Coxiella burnetii prevents trafficking to microbicidal phagolysosomes. Cell Host Microbe. 12, 751-763 (2012).
- Henry, R. M., Hoppe, A. D., Joshi, N., Swanson, J. A. The uniformity of phagosome maturation in macrophages. J. Cell Biol. 164, 185-194 (2004).
- Sundaramurthy, V., et al. Integration of Chemical and RNAi Multiparametric Profiles Identifies Triggers of Intracellular Mycobacterial Killing. Cell Host Microbe. 13, 129-142 (2013).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant. J. Leukocyte Biol. 41, 83-91 (1987).
