Summary
Makrofager har længe været anerkendt som et afgørende element i den medfødte og adaptive immunrespons. Den seneste eksplosion af viden vedrørende evolutionære, genetiske og biokemiske aspekter af samspillet mellem makrofager og mikrober har fornyet videnskabelig opmærksomhed på makrofager. Denne artikel beskriver en fremgangsmåde til at skelne makrofager fra museknoglemarv.
Abstract
Makrofager er kritiske komponenter af det medfødte og adaptive immunrespons, og de er de første linje i forsvaret mod fremmede magter på grund af deres stærke mikrobiocide aktiviteter. Makrofager er bredt fordelt i hele kroppen og er til stede i de lymfoide organer, lever, lunger, mave-tarmkanal, centralnervesystem, knogler og hud. På grund af deres fordeling, de deltager i en lang række fysiologiske og patologiske processer. Makrofager er alsidige celler, der er i stand til at genkende microenvironmental ændringer og opretholde vævshomeostase. Talrige patogener har udviklet mekanismer til at bruge makrofager som trojanske heste for at overleve, replikere i og inficere både mennesker og dyr og til at overføre til hele kroppen. Den seneste eksplosion af interesse i evolutionære, genetiske og biokemiske aspekter af host-patogen interaktioner har fornyet videnskabelig opmærksomhed med hensyn til makrofager. Her beskriver vi enfremgangsmåde til at isolere og dyrke makrofager fra murin knoglemarv, der vil give et stort antal makrofager til at studere vært-patogen interaktioner såvel som andre processer.
Introduction
Et væsentligt aspekt af makrofagfunktion er deres rolle i medfødte og adaptive immunitet. På grund af deres evne til at fagocytere inaktive partikler, bakterier eller parasitter, makrofager er en første linje i forsvaret mod udenlandske angribere. Når internaliseret er mikrober nedbrydes inden for phagolysosomes. Makrofager også sende rekruttering signaler til og præsentere antigener til andre immunceller såsom T-lymfocytter. Makrofager er afledt fra monocytter. Monocytter opstår i knoglemarven fra myeloide stamceller og migrere til perifert blod og væv, hvor de differentierer til makrofager. Det anslås, at en sund voksen mus indeholder ca 10 8 makrofager, der er fordelt over hele kroppen i forskellige organer og væv (tabel 1) 1,2. Makrofager vise stor fænotypisk og funktionel diversitet på grund af deres evne til at tilpasse deres mikromiljø 3,4. Den vigtigste MACROPhage ejendom er deres mikrobicidaktivitet, som er defineret ved deres evne til at fagocytere mikrober og ødelægge dem. Fagocyterende respons er defineret ved aktivering af komplekse signalsystemer netværk, der er stimuleret af mikrobiel kontakt, og dermed makrofager modulere genekspression passende reaktion på forskellige stimuli. Efter fagocytose bliver mikrober elimineret i en struktur kaldet fagolysosomet, men har mange patogene mikrober udviklet strategier til at undergrave mikrobicide funktion af makrofager 5. Mangfoldigheden af undergravende mekanismer, der anvendes af forskellige mikrobielle arter er en hyldest til kompleksiteten af fagocyterende processen 6 og fagolysosomet biogenese. Infektionssygdomme er store sundhedsproblemer, og talrige mekanismer og molekyler deltager i makrofag antimikrobielle aktiviteter. Endvidere målene i mikrobicide egenskaber, der er kapret af mikrober forbliver ukendte, og dermed er der en eXplosion af interesse i de evolutionære, genetiske og biokemiske aspekter af værtspatogene interaktioner, der har fornyet videnskabelig opmærksomhed med hensyn til makrofager. I øjeblikket er størstedelen af forskningen på området gjort på makrofager cellelinjer, som adskiller sig fra primære makrofager i fagocyterende aktivitet, den cytokiner produktion og regulering af den oxidative burst. Desuden er de mindre egnede til mikroskopi. For at undersøge samspillet makrofager-patogener anbefales det at bruge primære makrofager, såsom knoglemarv afledte makrofager (BMDMs), som udviser mere fysiologiske funktioner. Desuden er det muligt at arbejde på genetisk modificerede BMDMs, fordi disse makrofager kan isoleres direkte fra transgene mus og med tilgængeligheden af nye teknologier, såsom lentivirale transfektion deres genekspressionsprofilen kan ændres ved genetisk overekspression eller RNA-interferens. Her beskriver vi en procedure for at differentiere murine knogle mpil til makrofager, der vil give et stort antal makrofager i 7 dage for forskellige funktionelle analyser, f.eks proteomics 7, transcriptomics 8, intracellulær handel studerer 9, dynamiske undersøgelser 10, genetiske skærme (RNAi) og narkotika screening 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etiske retningslinjer
Protokollen for håndtering af dyr blev godkendt af vores institutionelle Animal Ethics Committee "Conseil Scientifique du Centre de Formation et de Recherche Experimental Médico-kirurgiske" (CFREMC Projekt tilladelse 10-300.122.013 til Eric Ghigo) fra Aix-Marseille Universitet i overensstemmelse med reglerne i décret nr. 87-848 af 1987/10/19. Eksperimenterne blev udført ved Faculté de Médecine de la Timone (Eksperimenter tilladelsens nummer 13,385 til Eric Ghigo).
1.. Materiale og Kultur Medier Forberedelse
- Sterilisere to pincet, to sakse, to kirurgiske knive, en morter og en pistil.
- Opnå fuldstændig DMEM indeholdende 10% føtalt kalveserum (FCS), 2 mM glutamin, 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin.
- Fortyndet 10x PBS i sterilt distillated vand for at opnå 1x PBS.
- Opnå iskold 1x PBS, iskold komplet DMEM, komplet DMEM waRMED til 37 ° C.
2. Fremstilling af L929 cellesupernatanter
- Grow L929-celler til konfluens (tyve 175 cm2 kolber) i komplet DMEM ved 37 ° C, 5% CO2.
Bemærk: granulocyt-makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) er forpligtet til at fremkalde hæmatopoietisk celle differentiering i makrofager 12. L929-celler producere GM-CSF.
- Ved konfluens erstatte dyrkningsmedium med frisk komplet DMEM. Overførsel kolber til 32 ° C, 5% CO2 i 10 dage.
- Indsamle, pool og centrifugeres supernatanterne ved 750 xg i 10 min. Kassér cellepellets.
- Opbevar supernatanter i 15 ml rør og opbevares ved -20 ° C.
3. Bone Marrow-afledt Macrophage (BMDM) Forberedelse
- Sacrifice 1 mus ved cervikal dislokation.
- Brug sterile kirurgiske knive hele eksperimentet. Desinficer huden med 70% alkoholhol. Lave et snit i toppen af hvert bagben og trække huden ned mod foden at eksponere musklen.
- Skær bagbenene, fjern skindet med steril saks og steril pincet. Anbring benene i en steril petriskål (35/10 mm) indeholdende steril iskold 1x PBS (5 ml).
- Tag kødet og muskler, der klæber til knoglerne med steril saks og pincet.
- Overfør knoglerne i en ny, steril petriskål (35/10 mm) indeholdende iskold steril 1x PBS (5 ml). Vask knoglerne to gange med 5 ml iskold, steril 1x PBS.
- Overfør knogle i en steril mørtel indeholdende 5 ml iskold steril 1x PBS.
- Skær skinneben fra lårbenet ved samlingen med steril saks. Smash knoglerne forsigtigt i et sterilt mørtel indeholdende 5 ml iskold steril 1x PBS ved hjælp af en støder.
- Saml supernatanten i iskold 15 ml rør. Gentag dette trin 3x.
- Der filtreres gennem et 70 um Nylon celle strainer at fjerne faste fragmenter. Filtratet centrifugeres ved 450 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
- Forsigtigt supernatanten. Dissociere pellet i 10 ml røde blodlegemer lysepuffer til 30 sek. Tilsæt 20 ml iskold, komplet DMEM.
Bemærk: Formålet med dette trin er at fjerne kontaminerende røde blodlegemer, og dermed skal dette trin skal udføres inden for 2 min at undgå hæmatopoietisk celle ændring af de røde blodlegemer lysisbuffer.
- Centrifuger ved 450 x g i 10 minutter ved 4 ° C. Forsigtigt supernatanten. Dissociere pellet i 20 ml komplet DMEM, der er blevet opvarmet til 37 ° C.
- Overfør dissocierede celler i 2 petriskåle (100/20 mm). Inkuber dem i 4 timer ved 37 ° C.
- Opsaml supernatanter i 50 ml rør ved stuetemperatur. Kassér de retter, der indeholder de bosiddende makrofager.
Bemærk: Formålet med dette trin er at fjerne bosat knogle Marrow makrofager ved deres evne til at holde sig til kultur-behandlede plast. Disse stationære makrofager kan anvendes i andre eksperimenter.
- Centrifuger de indsamlede supernatanter ved 450 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Supernatanten.
- Dissociér forsigtigt pellet i 10 ml komplet DMEM indeholdende 15% L929 cellesupernatant. Filtreres cellerne gennem en 40 um Nylon cellefilter.
- Filtratet Recover. Det opsamlede filtrat (10 ml) tilsættes til 140 ml komplet DMEM, der er suppleret med 15% L929-celle medier.
- Fordel 10 ml af cellesuspensionen per petriskål (15 petriskåle, 100/20 mm). Inkuberes cellerne ved 37 ° C, 5% CO2.
- Dyrk cellerne i 3 dage
- Tilsæt 10 ml komplet DMEM, der er blevet suppleret med 15% L929. Cellerne inkuberes i yderligere 4 dage.
Bemærk: Overvåg cellevækst med jævne mellemrum med et inverteret mikroskop (trin 3,14-3,16). Adhærente makrofager bliverefter 3 dages dyrkning.
4.. Høst BMDMs
- Supernatanten fjernes. Vask BMDMs 2 gange med komplet DMEM
- 5 ml komplet DMEM, der er blevet opvarmet til 37 ° C. Frigør BMDMs ved forsigtigt at skrabe med en gummi politimand.
- Saml BMDMs i 50 ml rør og centrifugeres ved 450 xg i 10 min. Forsigtigt adskille cellepellets i 20 ml komplet DMEM.
- Grev BMDMs i overværelse af trypanblåt (burde ingen dødelighed mere end 10% skal overholdes).
Bemærk: Generelt er ca 6-7,5 x 10 7 makrofager opnået fra 15 petriskåle (100/20 mm) af makrofager. Der er ca 4-5 x 10 6 makrofager / petriskål (100/20 mm).
- Forbered BMDMs som det kræves for eksperimentet. Efter 16 timer i fuldstændig medier ved 37 ° C, 5% CO 2, makrofager igen vil holde sig til støtte.
5.. Lagring BMDMs
- Saml isolerede BMDMs (trin 4.3). Centrifuger ved 450 x g i 10 min. Bemærk: BMDMs kan fryses i flydende nitrogen.
- Resuspender cellepellets i frysning medier bestående af 10% DMSO og 90% FCS ved en endelig koncentration på 4 x 10 6 celler / ml og pipette 1 ml i hver ampul.
- Frys celler ved en afkølingshastighed på 1 ° C / min. Efter 24 timer overføres ampullen til en flydende nitrogen beholder til langtidsopbevaring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Formålet med denne fremgangsmåde var for let at få et stort antal makrofager i nogle dage. Knoglemarv forberedelse Cellen er illustreret i figur 1. Knogler fra bagbenet blev opsamlet og knust i en morter. Når de residente makrofager blev fjernet fra fremstilling knoglemarven celle blev knoglemarvsceller inkuberet med GM-CSF (dag 0). Efter 3 dage blev cellerne, som var rund og adhærerende før kultur, begynder at differentiere til makrofager og overholde (figur 1A). Cytometrianalyse hjælp F4/80 og HLA-DR markører viste, at celler udtrykte begge mærker således beviser, at de er differentieret i makrofager (figur 1B). Efter 7 dage blev en BMDM monolag opnået med 6-7,5 x 10 7 BMDM / mus. Makrofager kan anvendes i forskellige typer af eksperimenter (figur 2). De funktionelle aktiviteter BMDMs kan bestemmes på forskellige måder. For eksempel BMDM phagocytoser blev overvåget ved latexperle internalisering. Antallet af perler pr celle blev forøget over tid (figur 2A). BMDM endocytic potentiale (figur 2B) blev bakterielle patogen interaktioner (figur 2C) og signaltransduktionsveje (Figur 2D) også vurderes.
| Placering | Celletyper |
| Bone | Osteoclast |
| Knoglemarv | Pro-monocyt, makrofag |
| Centralnervesystemet | Microglial celle |
| Lamina propria | Resident makrofag |
| Lever | Kupffer celle |
| Lunge | Alveolær makrofag |
| Perifert blod | Monocyt |
| Bughulen | Peritoneal makrofag |
| Hud | Langerhans celle |
| Spleen | Resident makrofag |
| Thymus | Resident makrofag |
Tabel 1.. Makrofag kilder i væv og væsker.
Figur 1. Skematisk visning af BMDM produktion. (A) Dette tal illustrerer de trin BMDM differentiering fra stamfader differentiering (dag 0) for at modne makrofager (day7). (B) FACS-analyse illustrerer renheden af isolerede celler på dag 7 bruger som makrofager markører HLA-DR og F4/80. Klik her for at se det i stortr figur.
Figur 2. Eksempler på eksperimenter, der er mulige med BMDMs. (A) Fagocytose assay. BMDMs blev inkuberet i forskellige perioder med latex perler og perle optagelse blev observeret ved mikroskopi. (B) Intracellulær Coxiella burnetii lipopolysaccharid (LPS) lokalisering i BMDMs. LPS (i rødt) blev lokaliseret til et rum, som huser lysosomale-associeret membran protein-1 (LAMP-1) (i blåt), men ikke katepsin D (i grønt). Dette eksperiment viser, at LPS er til stede i slutningen af endosomer, der er i stand til at fusionere med lysosomer. (C) BMDMs inficeret med Tropheryma whipplei (i rødt) blev ikke lokaliseret i rum, der huser cathepsin D (i grønt). (D) Repræsentant immunobmasse viser total (t) og phosphoryleret (p) p38a MAP Kinase niveauer i Escherichia coli LPS-stimulerede BMDMs (1 ug / ml). Skala søjler repræsenterer 5 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den heri beskrevne protokol detaljer en fremgangsmåde til at producere store antal af BMDMs. BMDM er primære celler og har den biologiske funktion og egenskaber af makrofager differentierede fra monocytter, fordi der er modne, i modsætning til makrofag-cellelinier, som er umodne. BMDMs kan anvendes til genetisk screening (RNAi), drug screening, funktionelle undersøgelser, værtspatogene interaktionsstudier og mange andre områder af undersøgelsen.
Proceduren præsenteret heri er meget enkel og kræver ikke specialiseret udstyr, og derfor kan den let udføres i et laboratorium eller klassen. Denne metode kræver lidt øvelse og håndelag. Det er også muligt at lagre BMDMs i flydende nitrogen, hvilket vil lette fremtidige eksperimenter.
Der er flere kritiske trin for en vellykket BMDM kultur: 1) Opretholdelse af et sterilt, sund kultur, 2) knoglemarv udvinding skal være effektiv, 3) L929 supernatant kvalitet er kritisk, 4) ikke udsætter celler til de røde blodlegemer lysis buffer for mere end 2 min for at undgå hæmatopoietisk celleskader.
Det er muligt at gøre nogle ændringer af protokollen, men der er i at begrænse antallet. 1) DMEM kan erstattes af RPMI 1640, men BMDM produktion er mindre effektiv, 2) kommerciel M-CSF (500-1000 IE / ml) kan anvendes i stedet for L929 supernatanten, men det er dyrt og M-CSF skal være tilføjet hver 2 dage at celler under differentiering proces, 3) alternativt knoglemarv kan ekstruderes fra knoglerne ved hjælp af en sprøjte med 25 G kanyle i stedet for at smadre knogler i en steril morter ved hjælp af pistil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der er ikke erklæret interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af CNRS (PICS 2012-2014 til EG) og af en bevilling fra Regione Campania (LR n.5, 28.03.2002 til Giovanna Mottola). Filippo Conti er en fyr af det videnskabelige samarbejde Foundation'' Infectiopole Sud.'' Nicola Boucherit er en fyr fra det franske ministerium for forskning og teknologi. Finansieringskilderne havde nogen rolle i undersøgelsens design, dataindsamling, dataanalyse, beslutning om at offentliggøre, eller manuskriptet forberedelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco Life Technologies | 21969-035 | |
| Fetal Calf Serum | Gibco Life Technologies | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15070 | |
| Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-024 | |
| PBS (10x) | Lonza | BEM515F | |
| Red Blood Cell Lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer 70 μm Nylon | BD Falcon | 352350 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| Petri dishes (100/20 mm) | any supplier | n/a | culture treated |
| Petri dishes (35/10 mm) | any supplier | n/a |
References
- Rutherford, M. S., Witsell, A., Schook, L. B. Mechanisms generating functionally heterogeneous macrophages: chaos revisited. J. Leukocyte Biol. 53, 602-618 (1993).
- Van Furth, R. Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).
- Adams, D., Halmiton, T. Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).
- Morris, L., Graham, C. F., Gordon, S. Macrophages in haemopoietic and other tissues of the developing mouse detected by the monoclonal antibody F4/80. Development. 112, 517-526 (1991).
- Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Phagocytosis of microbes: complexity in action. Annu. Rev. Immunol. 20, 825-852 (2002).
- Castagna, A., Polati, R., Bossi, A. M., Girelli, D. Monocyte/macrophage proteomics: recent findings and biomedical applications. Expert Rev. Proteomics. 9, 201-215 (2012).
- Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. J. Immunol. 181, 3733-3739 (2008).
- Barry, A. O., et al. Impaired stimulation of p38alpha-MAPK/Vps41-HOPS by LPS from pathogenic Coxiella burnetii prevents trafficking to microbicidal phagolysosomes. Cell Host Microbe. 12, 751-763 (2012).
- Henry, R. M., Hoppe, A. D., Joshi, N., Swanson, J. A. The uniformity of phagosome maturation in macrophages. J. Cell Biol. 164, 185-194 (2004).
- Sundaramurthy, V., et al. Integration of Chemical and RNAi Multiparametric Profiles Identifies Triggers of Intracellular Mycobacterial Killing. Cell Host Microbe. 13, 129-142 (2013).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant. J. Leukocyte Biol. 41, 83-91 (1987).
