Summary
Makrofajlar uzun doğal ve adaptif immün yanıtları kritik bir bileşeni olarak kabul edilmiştir. Makrofajlar ve mikrop arasındaki etkileşimin, evrimsel genetik ve biyokimyasal yönleri ile ilgili bilginin son patlama makrofajlara bilimsel ilgi yenilenmiştir. Bu makalede, fare kemik iliği makrofajları ayırt etmek için bir yöntem tarif edilir.
Abstract
Makrofajlar, doğal ve adaptif immün yanıtları kritik bileşenleri ve bunlar nedeniyle güçlü mikrobisidal faaliyetlerinin yabancı işgalcilere karşı ilk savunma hattı vardır. Makrofajlar, tüm vücuda yaygın şekilde dağıtılmıştır ve lenfoid organlarda bulunurlar, karaciğer, akciğer, gastrointestinal sistem, merkezi sinir sistemi, kemik ve deri. Çünkü onların yeniden bölme içinde, bunlar, fizyolojik ve patolojik işlemler geniş bir yelpazede katılabilir. Makrofajlar microenvironmental değişiklikleri tanımak ve doku dengesini korumak için mümkün oldukça çok yönlü hücrelerdir. Çok sayıda patojenler, hayatta çoğaltmak ve enfekte insan ve hayvanları hem vücutta yayılmasına için Truva atları gibi makrofajlar kullanmak için mekanizmalar gelişmiştir. Konak-patojen etkileşimleri, evrimsel genetik ve biyokimyasal açıdan ilgi son patlama makrofajlar ilgili bilimsel ilgi yeniledi. Burada, bir tarifkonukçu-patojen etkileşimlerine okuyan hem de diğer işlemler için makrofajların sayıda sağlayacak faregiller kemik iliğinden izole makrofajlar ve yetiştirmek için prosedür.
Introduction
Makrofaj fonksiyonunun önemli bir yönü doğal ve adaptif bağışıklık rolleri olduğunu. Çünkü asal partiküller, bakteri veya parazit fagosite kapasiteleri, makrofajlar yabancı işgalcilere karşı ilk savunma hattı vardır. Bir kez içselleştirilmiş, mikroplar fagolizozomları içinde parçalanırlar. Aynı zamanda makrofajlar, T lenfositler ve diğer bağışıklık hücrelerinin için işe alım sinyalleri ve antijenlerini gönderebilirsiniz. Makrofajlar monositlerden elde edilmiştir. Monositler miyeloid kök hücrelerden kemik iliği ortaya çıkan ve makrofajlara ayırt periferik kan ve çeşitli dokulara göç ederler. Sağlıklı yetişkin fare, çeşitli organ ve dokularda (Tablo 1), 1,2 vücut boyunca dağıtılan yaklaşık 10 8 makrofajlar içerdiği tahmin edilmektedir. Makrofajlar nedeniyle mikroçevresinin 3,4 uyum kabiliyetleri büyük fenotipik ve fonksiyonel çeşitlilik gösterir. En önemli macrophage mülkiyet mikropları fagosite ve onları yok etmek için kendi kapasitesi ile tanımlanır onların mikrobisidal faaliyetidir. Fagositik yanıt mikrobiyal temas ile uyarılır kompleks sinyal ağların aktivasyonu ile tanımlanan, bu yüzden, makrofajlar çeşitli uyaranlara karşı yanıt olarak uygun gen ifadesini modüle ederler. Fagositozundan sonra, mikroplar phagolysosome denilen bir yapıda ortadan kalkar, ancak birçok patojen mikroplar makrofaj 5 mikrobisidal fonksiyonunu yıkmak için stratejiler geliştirdik. Farklı mikrobiyal türler tarafından kullanılan yıkılma mekanizmalarının çeşitlilik Fagositik sürecinin 6 karmaşıklığı ve phagolysosome biyogeneze bir kanıtıdır. Bulaşıcı hastalıklar, başlıca insan sağlık sorunları, ve çok sayıda mekanizmaları ve molekülleri makrofaj antimikrobiyal faaliyetlerine katılmak. Ayrıca, mikroplar tarafından kaçırıldı vardır mikrobisidal özelliklerinin hedefleri hala bilinmiyor, bu nedenle, bir e varmakrofajlar ile ilgili bilimsel dikkatini yeniledi konak-patojen etkileşimleri, evrimsel genetik ve biyokimyasal açıdan ilgi xplosion. Şu anda, bu alanda araştırma çoğunluğu fagositik aktivitesi, sitokin üretimi ve oksidatif patlama düzenlenmesinde birincil makrofaj farklılık makrofajlar hücre çizgileri, yapılır. Buna ek olarak, mikroskopi için daha az uygundur. Etkileşim makrofajlar-patojenleri araştırmak için daha fazla fizyolojik özellikler sergileyen bu gibi Kemik İliği kökenli makrofajlar (BMDMs) birincil makrofajlar, kullanımı tavsiye edilir. Bu makrofajlar transgenik farelerden izole edilmiş ve doğrudan doğruya, örneğin lentiviral transfeksiyonu gibi yeni teknolojilerin durumu ile olabilir çünkü Ayrıca, bu, genetik olarak modifiye edilmiş BMDMs üzerinde çalışmak mümkündür, bunların gen ekspresyon profili gen aşırı ifadesi veya RNA girişim ile değiştirilebilir. Burada, biz fare kemik m ayırt etmek için bir prosedür açıklanmaktadırfonksiyonel gibi Proteomikte 7, transkriptomik 8 gibi analizler çeşitli için 7 gün içinde makrofajlar çok sayıda sağlayacaktır makrofajlar içine ok, içi insan ticareti 9, dinamik çalışmaları 10, genetik ekranlar (RNAi) ve 11 tarama ilaç çalışmaları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Bildirimi
Kurallara uygun olarak Aix-Marseille Üniversitesi'nden hayvan taşınması için protokol bizim kurumsal Hayvan Etik Kurul "Conseil Scientifique du Centre de Formation et de Recherche Deneysel Médico-chirurgical" tarafından onaylandı (CFREMC, Eric Ghigo Proje izni 10-300.122.013) bir Décret N 1987/10/19 arasında 87-848 °. Deneyler Faculté de Médecine de la Timone (Eric Ghigo için Deneme İzni numarası 13.385) gerçekleştirildi.
1.. Malzeme ve Kültür Ortamı Hazırlama
- Iki forseps, iki makas, iki cerrahi bıçaklar, bir havan ve havan sterilize edin.
- % 10 fetal buzağı serumu (FCS), 2 mM glutamin, 100 U / ml penisilin ve / ml streptomisin ihtiva eden 100 ug tam DMEM elde edilir.
- 1x PBS elde etmek için steril damıtılmış su içinde 10x PBS seyreltin.
- Buz gibi soğuk 1 x PBS, buz soğukluğunda tam DMEM, tam bir DMEM wa elde edilir37 ° C'ye kadar şekillendirilir
2. L929 Hücre üst fazlan hazırlanması
- , 37 ° C de tam DMEM (yirmi 175 cm 2 şişeler)% 5 CO2 akmak üzere L929 hücreleri büyütün.
Not: faktörü (GM-CSF) uyarıcı Granülosit-makrofaj koloni makrofaj 12 içine hematopoietik hücre değişimini etkileme için gereklidir. L929 hücreleri, GM-CSF üretir.
- Izdiham, taze tam DMEM ile kültür ortamı değiştirin. 10 gün boyunca 32 ° C,% 5 CO2 için şişeler aktarın.
- Toplayın, havuz ve 10 dakika için 750 xg Süpernatantlar santrifüj. Hücre pelet atın.
- -20 ° C'de 15 ml tüpler ve mağaza saklayın yüzer
3. Kemik Makrofaj (BMDM) HAZIRLIĞI İliği-türevli
- Servikal dislokasyon 1 fare Kurban.
- Deney boyunca steril bir cerrahi bıçaklar kullanın. % 70 alkolizm ile cildi dezenfektehol. Her arka bacak üstünde bir kesi yapmak ve kas maruz ayak doğru deri aşağıya çekin.
- Arka ayaklarını kesti, steril makas ve steril forseps ile cilt kaldırmak. Steril, buz gibi soğuk 1 x PBS (5 mi) ihtiva eden steril bir Petri kabı (35/10 mm) olan bacaklar yerleştirin.
- Steril makas ve forseps ile kemik yapışmış olan eti ve kasları çıkarın.
- Buz soğukluğunda steril 1x PBS (5 mi) ihtiva eden yeni, steril bir Petri kabı (35/10 mm) içine kemikleri aktarın. 5 ml buz soğukluğunda steril 1 x PBS ile kemikleri iki kez yıkayın.
- 5 ml buz soğukluğunda steril 1 x PBS içeren steril bir havanda içine kemik aktarın.
- Steril makasla eklem femur tibia kesti. Bir havan tokmağı kullanılarak 5 ml buz gibi soğuk, steril 1 x PBS içeren steril bir havanda yavaşça kemikleri şut.
- Buz soğukluğunda 15 ml tüpler içinde süpernatan toplamak. Bu adım 3x tekrarlayın.
- 70 mikron naylon filtre içinden hücre strakatı parçaları kaldırmak için İner. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 450 x g'de santrifüje süzüntü
- Yavaşça süpernatant atın. 30 saniye için 10 ml alyuvar lisiz tamponu pelet ayrıştırmaları. 20 ml buz soğukluğunda, tam DMEM ekleyin.
Not: Bu adımın amacı, kırmızı kan hücreleri, kirletici kaldırmak için, bu yüzden, bu adım alyuvar lisiz tamponu ile hematopoietik hücre değişimini önlemek için 2 dakika içinde gerçekleştirilmelidir.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 450 x g'de santrifüje Yavaşça süpernatant atın. 37 ° C'ye ısıtılmış olan 20 ml bitmiş DMEM içinde pelet ayırmak
- 2 Petri kapları (100/20 mm) içine ayrışmış hücreleri aktarın. 37 ° C'de 4 saat inkübe bunları
- Oda sıcaklığında 50 ml tüpler içinde süpernatantlar toplayın. Ikamet makrofajlar içeren yemekleri atın.
Not: Bu adımın amacı, yerleşik kemik Marro ortadan kaldırmak içinkültürü-işlenmiş plastik uymak için kabiliyetleri ile w makrofajlar. Bu yerleşik makrofajlar diğer deneylerde de kullanılabilir.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj Toplanan süpernatantlar Süpernatant atın.
- 10 ml% 15 L929 hücre süpernatan ihtiva eden tam bir DMEM içinde yavaşça pelet ayrıştırmaları. 40 mikron naylon hücre süzgecinden hücrelerin filtre.
- Filtratı kurtarın. 140 ml% 15 L929 hücre ortamı ile takviye edilmiş DMEM tam için toplanan filtrat (10 mi) ilave edin.
- Petri kabı (15 Petri kapları, 100/20 mm) başına hücre süspansiyonu 10 ml dağıtın. 37 ° C,% 5 CO2 de hücreleri inkübe edin.
- 3 gün boyunca hücrelerin büyümesine
- 10 ml% 15 L929 deneyinde ile takviye edilmiş DMEM tam ekleyin. Ilave 4 gün boyunca inkübe hücreleri.
Not: Bir ters mikroskop ile, periyodik olarak, hücre büyümesini Monitör (3,14-3,16 adım). Yapışık makrofajlar olacakkültür 3 gün sonra saptanmıştır.
4. Hasat BMDMs
- Süpernatant kaldırmak. Bitmiş DMEM ile BMDMs 2 kez yıkayın
- 5 ml 37 ° C'ye ısıtıldı edilmiş tam bir DMEM ekleme Nazikçe bir lastik polis ile kazıyarak BMDMs ayırın.
- 10 dakika boyunca 450 x g 'de 50 ml tüpler ve santrifüj BMDMs toplayın. Yavaşça, 20 ml bitmiş DMEM içinde hücre pelletleri ayrışır.
- Tripan mavisi mevcudiyetinde BMDMs Toplamı (en fazla% 10 mortalite dikkat edilmelidir.)
Not: Genellikle, yaklaşık 6-7.5 x 10 7 makrofajlar makrofaj 15 Petri kutularına (100/20 mm) elde edilmiştir. Yaklaşık 4-5 x 10 6 makrofaj / Petri (100/20 mm) vardır.
- Deney için gerekli olan BMDMs hazırlayın. 37 ° C'de komple ortam içinde 16 saat sonra,% 5 CO2, makrofajlar yeniden desteğe yapışır.
5. BMDMs saklanması
- İzole BMDMs (adım 4.3) toplayın. 10 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj. Not: BMDMs sıvı azot içinde dondurulmuş olabilir.
- Her bir ampul içine / ml pipet ve 1 ml 4 x 10 6 hücre nihai konsantrasyonda,% 10 DMSO ve% 90 FCS içeren dondurma ortamı içinde yeniden süspanse hücre topakları.
- 1 ° C / dk bir soğutma oranında hücreleri dondurur. 24 saat sonra uzun süreli saklama için sıvı nitrojen kaba ampul aktarın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yöntemin amacı, kolayca birkaç gün makrofajların çok sayıda elde etmek olmuştur. Kemik iliği hücre hazırlama, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Arka bacak kemikleri toplanır ve bir havanda ezildi. Makrofajlar yerleşik kemik iliği hücre hazırlama çıkarıldı sonra, kemik iliği hücreleri, GM-CSF (Gün 0) ile inkübe edildi. 3 gün sonra, kültürden önce yuvarlak ve nonadherent olan hücreler, makrofajlar içine farklılaştırmak ve (Şekil 1A) uymak başlar. F4/80 sitometri analizi ile ve HLA-DR belirteçler hücreleri bu nedenle makrofajlar (Şekil 1 B) ayrılırlar olduğunu kanıtlayan hem işaretlerini ifade olduğunu göstermiştir. 7 gün sonra, bir tek-tabakalı BMDM 6-7.5 x 10 7 BMDM / fare ile elde edilmiştir. Makrofajlar deneyler farklı (Şekil 2) kullanılabilir. BMDMs fonksiyonel aktiviteleri, farklı yollarla belirlenebilir. Örneğin, BMDM phagocytosisimli lateks boncuk içselleştirme ile izlenmiştir. Hücre başına tanelerin sayısı zaman (Şekil 2A) artmıştır. BMDM endositik potansiyel (Şekil 2B), bakteriyel patojen etkileşimleri (Şekil 2C) ve sinyal iletim yolları (Şekil 2B) de değerlendirildi.
| Yer | Hücre tipleri |
| Kemik | Osteoklast |
| Kemik iliği | Pro-monosit, makrofaj |
| Merkezi sinir sistemi | Mikrogliyal hücre |
| Lamina propria | Resident makrofaj |
| Karaciğer | Kupffer hücre |
| Akciğer | Alveoler makrofaj |
| Periferik kan | Monosit |
| Periton boşluğu | Periton makrofaj |
| Cilt | Langerhans hücreli |
| Dalak | Resident makrofaj |
| Timüs | Resident makrofaj |
Doku ve sıvılarda Tablo 1. Makrofaj kaynakları.
Şekil 1. BMDM üretiminin şematik görünüşüdür. (A) Bu rakam, makrofajlar (day7) olgunlaşması için progenitör farklılaşması (gün 0) itibaren BMDM farklılaşma adımları göstermektedir. (B) FACS analizi makrofajlar belirteçleri HLA-DR ve F4/80 olarak kullanarak 7. günde izole hücrelerin saflığını gösterir. büyük görüntülemek için buraya tıklayınr rakam.
Şekil 2. BMDMs ile mümkündür deneylerin örnekleri arasında. (A) fagositoz deneyi. BMDMs lateks boncuklar ile farklı zaman aralıklarında daha inkübe edildi, ve boncuk uptake mikroskopi ile gözlemlenmiştir. (B) BMDMs hücre içi Coxiella burnetii lipopolisakkarid (LPS) yerelleştirme. LPS (kırmızı) (mavi) protein-1 (LAMP-1), lizozomal membran-ilişkili bulunduğu bir bölmeye lokalize ama D (yeşil) katepsin değildi. Bu deney, LPS, lizozomlar ile kaynaştırmak için mümkün değildir geç Endozomlar içinde mevcut olduğunu gösterir. (Kırmızı) Tropheryma whipplei ile enfekte (C) BMDMs (yeşil) katepsin D barındırır bölümünde lokalize değildi. (D) Temsilcisi immunoblot toplam (t) ve fosforile (p) p38a Escherichia coli LPS-uyarılmış BMDMs (1 ug / ml) içinde MAP kinaz seviyeleri ortaya koydu. Ölçek çubukları 5 um temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada tarif edilen protokol BMDMs çok sayıda üretilmesi için bir yöntem göstermektedir. BMDM birincil hücreler ve olgunlaşmamış makrofaj hücre hatları, aksine, olgun vardır, çünkü biyolojik fonksiyonunu ve monositler ayırt makrofajların özelliklerine sahiptir. BMDMs genetik tarama (RNAi), ilaç tarama, fonksiyonel çalışmalar, konak-patojen etkileşimi çalışmaları ve soruşturma diğer birçok alanda kullanılabilir.
Burada sunulan işlem çok basittir ve herhangi bir özel ekipman gerektirmez, bu nedenle kolayca laboratuar veya sınıfta gerçekleştirilebilir. Bu yöntem, bazı uygulama ve el becerisi gerektirir. Bu nedenle gelecekteki deneyler kolaylaştırmak, sıvı azot içinde BMDMs saklamak da mümkündür.
Başarılı BMDM kültürü için birkaç önemli adım vardır: 1) steril, sağlıklı kültürünü koruyarak; 2) kemik iliği çıkarma verimli olması gerekir; 3) L929 destekernatant kalitesi çok önemlidir, 4) hematopoietik hücre hasarı önlemek için en fazla 2 dakika boyunca alyuvar lisiz tamponu hücrelerin maruz değildir.
Bu protokolün bazı değişiklik yapmak mümkün ama sayısını sınırlayan vardır. 1) DMEM, RPMI 1640 ile ikame edilmiş olabilir, ancak BMDM üretimi daha az etkili olduğunu, 2), ticari M-CSF (500-1000 UI / ml) kullanılarak L929 süpernatan kullanılabilir, ancak pahalı ve M-CSF olmak zorundadır farklılaşma sürecinde hücrelere 2 gün her bir ilave, 3) alternatif olarak, kemik iliği yerine havan tokmağı kullanılarak steril bir havanda kemikleri kırma 25 G iğne ile donatılmış bir şırınga kullanarak kemik ekstrüde edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbir çıkar beyan çatışmalar vardır.
Acknowledgments
Bu çalışma CNRS (RESİMLER EG 2012-2014) tarafından ve Regione Campania (LR n.5, Giovanna Mottola 2002/03/28) bir hibe ile desteklenmiştir. Filippo Conti Bilimsel İşbirliği Vakfı'' Infectiopole Sud bir üyesidir.'' Nicola Boucherit Araştırma ve Teknoloji Bakanlığı Fransız bir adam olduğunu. Finansman kaynakları çalışma tasarımı, veri toplama, veri analizi, yayınlamak kararı, ya da yazının hazırlanmasında hiçbir rolü vardı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco Life Technologies | 21969-035 | |
| Fetal Calf Serum | Gibco Life Technologies | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15070 | |
| Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-024 | |
| PBS (10x) | Lonza | BEM515F | |
| Red Blood Cell Lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer 70 μm Nylon | BD Falcon | 352350 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| Petri dishes (100/20 mm) | any supplier | n/a | culture treated |
| Petri dishes (35/10 mm) | any supplier | n/a |
References
- Rutherford, M. S., Witsell, A., Schook, L. B. Mechanisms generating functionally heterogeneous macrophages: chaos revisited. J. Leukocyte Biol. 53, 602-618 (1993).
- Van Furth, R. Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).
- Adams, D., Halmiton, T. Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).
- Morris, L., Graham, C. F., Gordon, S. Macrophages in haemopoietic and other tissues of the developing mouse detected by the monoclonal antibody F4/80. Development. 112, 517-526 (1991).
- Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Phagocytosis of microbes: complexity in action. Annu. Rev. Immunol. 20, 825-852 (2002).
- Castagna, A., Polati, R., Bossi, A. M., Girelli, D. Monocyte/macrophage proteomics: recent findings and biomedical applications. Expert Rev. Proteomics. 9, 201-215 (2012).
- Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. J. Immunol. 181, 3733-3739 (2008).
- Barry, A. O., et al. Impaired stimulation of p38alpha-MAPK/Vps41-HOPS by LPS from pathogenic Coxiella burnetii prevents trafficking to microbicidal phagolysosomes. Cell Host Microbe. 12, 751-763 (2012).
- Henry, R. M., Hoppe, A. D., Joshi, N., Swanson, J. A. The uniformity of phagosome maturation in macrophages. J. Cell Biol. 164, 185-194 (2004).
- Sundaramurthy, V., et al. Integration of Chemical and RNAi Multiparametric Profiles Identifies Triggers of Intracellular Mycobacterial Killing. Cell Host Microbe. 13, 129-142 (2013).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant. J. Leukocyte Biol. 41, 83-91 (1987).
