Summary
Les macrophages ont longtemps été reconnu comme un élément essentiel des réponses immunitaires innées et adaptatives. L'explosion récente des connaissances relatives aux aspects évolutifs, génétiques, biochimiques et de l'interaction entre les macrophages et les microbes a renouvelé l'attention des scientifiques à macrophages. Cet article décrit une méthode pour différencier les macrophages de moelle osseuse de souris.
Abstract
Les macrophages sont des éléments essentiels de la réponse immunitaire innée et adaptative, et ils sont la première ligne de défense contre les envahisseurs étrangers en raison de leurs activités microbicides puissants. Les macrophages sont largement distribués dans tout le corps et sont présentes dans les organes lymphoïdes, le foie, les poumons, le tractus gastro-intestinal, du système nerveux central, de l'os et de la peau. En raison de leur répartition, ils participent à une large gamme de processus physiologiques et pathologiques. Les macrophages sont des cellules très polyvalents qui sont capables de reconnaître des modifications micro-environnementales et de maintenir l'homéostasie tissulaire. De nombreux agents pathogènes ont développé des mécanismes pour utiliser les macrophages comme des chevaux de Troie pour survivre, se reproduire dans, et d'infecter les humains et les animaux et de se propager dans tout le corps. La récente explosion de l'intérêt pour les aspects évolutifs, génétiques, biochimiques et des interactions hôte-pathogène a renouvelé l'attention des scientifiques concernant les macrophages. Ici, nous décrivons unprocédé pour isoler et cultiver les macrophages de la moelle osseuse murine qui fournira un grand nombre de macrophages pour étudier les interactions hôte-pathogène, ainsi que d'autres processus.
Introduction
Un aspect important de la fonction des macrophages est leur rôle dans l'immunité innée et adaptative. En raison de leur capacité à phagocyter les particules inertes, des bactéries ou des parasites, les macrophages sont une première ligne de défense contre les envahisseurs étrangers. Une fois intériorisée, les microbes sont dégradés dans phagolysosomes. Macrophages envoient aussi des signaux de recrutement et les antigènes présents à d'autres cellules immunitaires comme les lymphocytes T. Les macrophages sont dérivées de monocytes. Les monocytes se posent dans la moelle osseuse à partir de cellules souches myéloïdes et migrent vers le sang périphérique et de divers tissus où ils se différencient en macrophages. On estime que d'une souris adulte en bonne santé contient environ 10 8 macrophages qui sont distribuées dans tout le corps dans divers organes et tissus (tableau 1) 1,2. Macrophages présentent une grande diversité phénotypique et fonctionnelle en raison de leur capacité à s'adapter à leur 3,4 microenvironnement. Le plus important macrophage propriété est leur activité microbicide, qui est défini par leur capacité de phagocyter des microbes et les détruire. La réponse phagocytaire est définie par l'activation des réseaux de signalisation complexes qui sont stimulés par le contact microbienne, ainsi, les macrophages modulent l'expression du gène de manière appropriée en réponse à divers stimuli. Après la phagocytose, les microbes sont éliminés dans une structure appelée la phagolysosome, mais de nombreux microbes pathogènes ont développé des stratégies pour renverser la fonction microbicide des macrophages 5. La diversité des mécanismes de subversion qui sont utilisés par les différentes espèces microbiennes est un témoignage de la complexité du processus phagocytaire 6 et phagolysosome biogenèse. Les maladies infectieuses sont les principaux problèmes de santé humaine, et de nombreux mécanismes et les molécules participent à des activités antimicrobiennes des macrophages. En outre, les objectifs des propriétés microbicides qui sont pris en otage par les microbes restent inconnus; ainsi, il est un explosion d'intérêt dans les aspects évolutifs, génétiques, biochimiques et des interactions hôte-pathogène qui a renouvelé l'attention des scientifiques concernant les macrophages. Actuellement, la majorité des travaux de recherche dans le domaine est effectuée sur des lignées de cellules macrophages, qui diffèrent des macrophages primaires dans l'activité phagocytaire, la production de cytokines et la régulation de la poussée oxydative. En outre, ils sont moins appropriés pour la microscopie. Pour étudier l'interaction macrophages-pathogènes, il est recommandé d'utiliser les macrophages primaires, telles que les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs), qui présentent des caractéristiques plus physiologiques. En outre, il est possible de travailler sur BMDMs génétiquement modifiés, parce que ces macrophages pourraient être isolés directement à partir des souris transgéniques, et de la disponibilité des technologies nouvelles telles que la transfection lentiviral, son profil d'expression du gène peut être modifiée par surexpression du gène ou de l'ARN interférence. Ici, nous décrivons une procédure de différencier osseuse murine mflèche en macrophages qui fourniront un grand nombre de macrophages dans les 7 jours pour diverses analyses fonctionnelles telles que la protéomique 7, 8 transcriptomique, le trafic intracellulaire étudie 9, 10 études dynamiques, les écrans génétiques (ARNi) et le dépistage de drogues 11.
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Protocol
Déclaration d'éthique
Le protocole de manipulation des animaux a été approuvé par notre Comité institutionnel d'éthique animale "Conseil Scientifique du Centre de Formation et de Recherche Expérimentale Médico-Chirurgical» (CFREMC, permis de projet 10-300122013 Eric Ghigo) de l'Université d'Aix-Marseille en accord avec les règles de Décret N ° 87-848 du 19/10/1987. Les expériences ont été effectuées à la Faculté de Médecine de la Timone (numéro de permis d'expérimentation 13,385 à Eric Ghigo).
Une. Matériel et Culture Préparation médias
- Stériliser deux pinces, deux ciseaux, deux lames chirurgicales, un mortier et un pilon.
- Obtenir du DMEM complet contenant 10% de sérum de veau foetal (FCS), 2 mM de glutamine, 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine.
- Diluer 10x PBS dans de l'eau distillée stérile pour obtenir 1x PBS.
- Obtenir glacée 1x PBS, DMEM complet glacée, wa DMEM completrmé à 37 ° C.
2. Préparation de L929 surnageants cellulaires
- Croître jusqu'à confluence des cellules L929 (vingt 175 cm2 dans du DMEM complet) à 37 ° C, 5% CO 2.
Remarque: les colonies de granulocytes-macrophages facteur de stimulation (GM-CSF) est nécessaire pour induire la différenciation des cellules hématopoïétiques dans les macrophages 12. L929 produisent GM-CSF.
- A confluence, remplacer le support de culture avec du DMEM complet frais. Transférer les flacons à 32 ° C, 5% CO 2 pendant 10 jours.
- Recueillir, piscine et centrifuger les surnageants à 750 g pendant 10 min. Jeter culots cellulaires.
- surnageants de magasins en tubes de 15 ml et conserver à -20 ° C.
3. Dérivées de moelle osseuse macrophages (BMDM) Préparation
- Sacrifier une souris par dislocation cervicale.
- Utiliser des lames chirurgicales stériles pendant toute l'expérience. Désinfecter la peau avec 70% alcohol. Faire une incision au sommet de chaque patte arrière et tirez la peau vers le bas vers le pied pour exposer le muscle.
- Coupez les pattes de derrière, enlever la peau avec des ciseaux stériles et des pinces stériles. Placer les jambes à l'intérieur d'une boîte de Pétri stérile (35/10 mm) contenant stérile, refroidi à la glace 1x PBS (5 ml).
- Retirer la chair et les muscles qui sont adhère à l'os avec des ciseaux et des pinces stériles.
- Transférer les os dans un nouveau plat, Petri stérile (35/10 mm) contenant de la glace-froid, stérile 1x PBS (5 ml). Laver les os deux fois avec 5 ml refroidi à la glace, 1x PBS stérile.
- Transférer l'os dans un mortier stérile contenant 5 ml refroidi à la glace, 1x PBS stérile.
- Couper le tibia du fémur à l'articulation avec des ciseaux stériles. Briser les os délicatement dans un mortier stérile contenant 5 ml de glace-froid, stérile 1x PBS aide d'un pilon.
- Recueillir le surnageant dans 15 ml tubes glacés. Répétez cette étape 3x.
- Filtrer à travers une cellule de Nylon stra 70 umINER pour éliminer les fragments solides. Centrifuger le filtrat à 450 xg pendant 10 min à 4 ° C.
- Jeter doucement le surnageant. Dissocier le culot dans 10 ml de tampon de lyse des globules rouges pendant 30 s. Ajouter 20 ml refroidi à la glace, du DMEM complet.
Remarque: Le but de cette étape est d'éliminer les contaminer les globules rouges, ainsi, cette étape doit être effectuée en 2 min afin d'éviter l'altération des cellules hématopoïétiques par le tampon de lyse des globules rouges du sang.
- Centrifuger à 450 g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter doucement le surnageant. Dissocier le culot dans 20 ml de DMEM complet qui a été chauffé à 37 ° C.
- Transférer les cellules dissociées dans deux boîtes de Pétri (100/20 mm). Incuber pendant 4 heures à 37 ° C.
- Collecter les surnageants dans des tubes de 50 ml à la température ambiante. Jeter les plats qui contiennent les macrophages résidents.
Remarque: L'objectif de cette étape est d'éliminer la Marro osseuse résidentw macrophages par leur aptitude à adhérer à la culture traitée plastique. Ces macrophages résidents peuvent être utilisés dans d'autres expériences.
- Centrifuger les surnageants recueillis à 450 xg pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Dissocier doucement le culot dans 10 ml de DMEM complet contenant 15% L929 surnageant cellulaire. Filtrer les cellules à travers un tamis cellulaire en nylon de 40 pm.
- Récupérer le filtrat. Ajouter le filtrat recueilli (10 ml) à 140 ml de DMEM complet qui a été supplémenté avec 15% de cellules L929 médias.
- Distribuer 10 ml de la suspension de cellules par boîte de Pétri (15 boîtes de Pétri, 100/20 mm). Incuber les cellules à 37 ° C, 5% CO 2.
- Cultiver des cellules pendant 3 jours
- Ajouter 10 ml de DMEM complet qui a été complété par 15% L929. Incuber les cellules pendant 4 jours supplémentaires.
Remarque: Surveiller la croissance des cellules périodiquement avec un microscope inversé (étapes 3.14 à 3.16). Macrophages adhérents serontobservé après 3 jours de culture.
4. BMDMs de récolte
- Retirer le surnageant. Laver BMDMs 2 fois avec du DMEM complet
- Ajouter 5 ml de DMEM complet qui a été chauffé à 37 ° C. Détachez BMDMs en grattant doucement avec une spatule en caoutchouc.
- Recueillir BMDMs en tubes de 50 ml et centrifuger à 450 g pendant 10 min. Dissocier doucement culots de cellules dans 20 ml de DMEM complet.
- Comptez BMDMs en présence de bleu trypan (pas de mortalité de plus de 10% doit être observé).
Remarque: En règle générale, d'environ 6 à 7,5 x 10 7 macrophages sont obtenus à partir de 15 boites de Pétri (100/20 mm) des macrophages. Il ya environ 4-5 x 10 6 macrophages / boîte de Pétri (100/20 mm).
- Préparer BMDMs comme requis pour l'expérience. Après 16 heures dans un milieu complet à 37 ° C, 5% CO 2, les macrophages de nouveau adhérer au support.
5. Stockage BMDMs
- Recueillir BMDMs isolés (étape 4.3). Centrifuger à 450 g pendant 10 min. Remarque: BMDMs peuvent être congelées dans l'azote liquide.
- les culots de cellules de remettre en suspension dans des milieux de congélation consistant en 10% de DMSO et 90% de FCS à une concentration finale de 4 x 10 6 cellules / ml et pipette 1 ml dans chaque ampoule.
- Geler les cellules à une vitesse de refroidissement de 1 ° C / min. Après 24 h, le transfert de l'ampoule dans un récipient d'azote liquide pour un stockage à long terme.
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Representative Results
Le but de ce procédé est d'obtenir facilement un grand nombre de macrophages dans quelques jours. La préparation de cellules de moelle osseuse est illustré sur la figure 1. Os de la patte arrière ont été recueillies et brisé dans un mortier. Une fois que les macrophages résidents ont été retirés de la préparation de cellules de moelle osseuse, des cellules de moelle osseuse ont été incubées avec du GM-CSF (jour 0). Après 3 jours, les cellules, qui étaient ronds et non adhérent avant la culture, commencent à se différencier en macrophages et adhérer (Figure 1A). L'analyse par cytométrie en utilisant F4/80 et marqueurs HLA-DR a révélé que les cellules ont exprimé deux marqueurs prouvant ainsi qu'ils se différencient en macrophages (figure 1B). Après 7 jours, une monocouche BMDM a été obtenue avec 6 à 7,5 x 10 7 BMDM / souris. Les macrophages peuvent être utilisés dans différents types d'expériences (Figure 2). Les activités fonctionnelles de la BMDMs peuvent être déterminés de diverses façons. Par exemple, phagocytos BMDMc'est a été surveillée par billes de latex internalisation. Le nombre de billes par cellule augmente au cours du temps (figure 2A). BMDM potentiel d'endocytose (figure 2B), les interactions pathogènes bactériens (figure 2C) et les voies de transduction du signal (figure 2D) ont également été évalués.
| Emplacement | Les types de cellules |
| Os | Ostéoclastes |
| La moelle osseuse | Pro-monocyte, macrophage |
| Système nerveux central | Cellule microgliale |
| Lamina propria | Macrophage résident |
| Foie | Cellules de Kupffer |
| Poumon | Macrophages alvéolaires |
| Sang périphérique | Monocytes |
| Cavité péritonéale | Macrophage péritonéal |
| Peau | Cellules de Langerhans |
| Rate | Macrophage résident |
| Thymus | Macrophage résident |
Tableau 1. Sources macrophages dans les tissus et les fluides.
Figure 1. Vue schématique de la production BMDM. (A) Cette figure illustre les étapes de la différenciation BMDM de la différenciation des progéniteurs (jour 0) à échéance macrophages (day7). (B) Analyse FACS illustre la pureté des cellules isolées à jour 7 en utilisant comme marqueurs des macrophages HLA-DR et F4/80. Cliquez ici pour afficher une grander figure.
Figure 2. Des exemples d'expériences qui sont possibles avec BMDMs. (A) d'essai de phagocytose. BMDMs ont été incubées pendant différentes périodes de temps avec des billes de latex, et le talon absorption a été observée par microscopie. (B) intracellulaire Coxiella burnetii lipopolysaccharide (LPS) localisation dans BMDMs. LPS (en rouge) a été localisée dans un compartiment qui abrite la membrane lysosomale-associated protein-1 (LAMP-1) (en bleu), mais pas la cathepsine D (en vert). Cette expérience démontre que le LPS est présent dans les endosomes tardifs qui sont incapables de fusionner avec les lysosomes. (C) BMDMs infectées par Tropheryma whipplei (en rouge) n'a pas été localisés dans le compartiment qui abrite la cathepsine D (en vert). (D) immunob représentativelot démontrant totale (t) et phosphorylée (p) p38a niveaux MAP kinase dans Escherichia coli BMDMs stimulées par le LPS (1 ug / ml). Barres d'échelle représentent 5 um.
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Discussion
Le protocole décrit ci-après en détail un procédé pour produire de grands nombres de BMDMs. BMDM sont des cellules primaires et ont la fonction biologique et les propriétés des macrophages différenciés à partir de monocytes, car il n'y a mature, à la différence de lignées de cellules macrophages, qui sont immatures. BMDMs peut être utilisé pour le dépistage génétique (RNAi), le dépistage des drogues, des études fonctionnelles, les études d'interaction hôte-pathogène et de nombreux autres domaines de recherche.
La procédure présentée ici est très simple et ne nécessite pas d'équipement spécialisé et, par conséquent, il peut être facilement réalisée dans un laboratoire ou en classe. Cette méthode nécessite un peu de pratique et la dextérité manuelle. Il est également possible de stocker les BMDMs dans de l'azote liquide, ce qui facilite les expériences ultérieures.
Il ya plusieurs étapes essentielles pour la culture de BMDM succès: 1) le maintien d'une saine culture stérile; 2) l'extraction de la moelle osseuse doit être efficace; 3) L929 supernatant qualité est critique; 4) à ne pas exposer les cellules de la mémoire tampon de lyse des globules rouges dans le sang pendant plus de deux minutes pour éviter d'endommager les cellules hématopoïétiques.
Il est possible d'effectuer des modifications du protocole, mais il n'y en nombre limite. 1) DMEM peut être remplacé par du RPMI 1640, mais la production BMDM est moins efficace; 2) commercial M-CSF (500-1000 UI / ml) peut être utilisé à la place de L929 surnageant, mais il est coûteux et M-CSF doit être ajouter tous les 2 jours pour les cellules au cours du processus de différenciation, 3) en variante, la moelle osseuse peut être extrudé à partir de l'os à l'aide d'une seringue équipée d'aiguille 25 G au lieu de casser les os dans un mortier stérile à l'aide d'un pilon.
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Disclosures
Il n'y a pas de conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le CNRS (PICS 2012-2014 à EG) et par une subvention de la Région Campanie (LR n ° 5, 28.03.2002 à Giovanna Mottola). Filippo Conti est un membre de la Fondation de Coopération Scientifique'' Infectiopole Sud.'' Nicola Boucherit est membre du Ministère français de la Recherche et de la Technologie. Les sources de financement n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte de données, analyse de données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco Life Technologies | 21969-035 | |
| Fetal Calf Serum | Gibco Life Technologies | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15070 | |
| Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-024 | |
| PBS (10x) | Lonza | BEM515F | |
| Red Blood Cell Lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer 70 μm Nylon | BD Falcon | 352350 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| Petri dishes (100/20 mm) | any supplier | n/a | culture treated |
| Petri dishes (35/10 mm) | any supplier | n/a |
References
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