Summary
Los macrófagos han sido reconocidos como un componente crítico de la respuesta inmune innata y adaptativa. La reciente explosión de conocimientos relativos a los aspectos evolutivos, genéticos y bioquímicos de la interacción entre los macrófagos y los microbios ha renovado la atención científica a los macrófagos. Este artículo describe un método para diferenciar los macrófagos de médula ósea de ratón.
Abstract
Los macrófagos son componentes fundamentales de la respuesta inmune innata y adaptativa, y son la primera línea de defensa contra los invasores extranjeros debido a sus actividades microbicidas poderosos. Los macrófagos se distribuyen ampliamente por todo el cuerpo y están presentes en los órganos linfoides, hígado, pulmones, tracto gastrointestinal, sistema nervioso central, hueso, y la piel. Debido a su reparto, que participan en una amplia gama de procesos fisiológicos y patológicos. Los macrófagos son células altamente versátiles que son capaces de reconocer alteraciones microambientales y para mantener la homeostasis del tejido. Numerosos patógenos han desarrollado mecanismos para utilizar los macrófagos como caballos de Troya para sobrevivir, replicarse en, e infectar a los seres humanos y los animales y de propagar por todo el cuerpo. La reciente explosión de interés en los aspectos evolutivos, genéticos y bioquímicos de las interacciones huésped-patógeno ha renovado la atención científica en relación con los macrófagos. Aquí se describe unprocedimiento para aislar y cultivar los macrófagos de la médula ósea murina que proporcionará un gran número de macrófagos para el estudio de las interacciones huésped-patógeno, así como otros procesos.
Introduction
Un aspecto significativo de la función de los macrófagos es su papel en la inmunidad innata y adaptativa. Debido a su capacidad de fagocitar partículas inertes, bacterias o parásitos, los macrófagos son una primera línea de defensa contra los invasores extranjeros. Una vez interiorizado, los microbios son degradados en los fagolisosomas. Los macrófagos también envían señales de contratación para y presentan antígenos a otras células inmunes, como los linfocitos T. Los macrófagos se derivan de monocitos. Los monocitos se originan en la médula ósea a partir de células madre mieloides y migran a la sangre periférica y diversos tejidos donde se diferencian en macrófagos. Se estima que un ratón adulto sano contiene aproximadamente 10 8 macrófagos que se distribuyen por todo el cuerpo en varios órganos y tejidos (Tabla 1) 1,2. Los macrófagos muestran una gran diversidad fenotípica y funcional debido a su capacidad de adaptarse a su 3,4 microambiente. El macrop más importanteHage propiedad es su actividad microbicida, que se define por su capacidad para fagocitar y destruir microbios ellos. La respuesta fagocítica se define por la activación de complejas redes de señalización que son estimulados por el contacto microbiana, por lo tanto, los macrófagos modulan la expresión génica apropiada en respuesta a diversos estímulos. Después de la fagocitosis, los microbios se eliminan en una estructura llamada fagolisosoma, sin embargo, muchos microbios patógenos han desarrollado estrategias para subvertir la función microbicida de los macrófagos 5. La diversidad de mecanismos de subversión que son utilizados por diferentes especies microbianas es un testimonio de la complejidad del proceso de fagocitosis 6 y fagolisosoma biogénesis. Las enfermedades infecciosas son importantes problemas de salud humana, y numerosos mecanismos y moléculas participan en la actividad antimicrobiana de los macrófagos. Además, los objetivos de las propiedades microbicidas que son secuestrados por los microbios siguen siendo desconocidos, por lo que no es un correoxplosion de interés en los aspectos evolutivos, genéticos y bioquímicos de las interacciones huésped-patógeno que ha renovado la atención científica en relación con los macrófagos. En la actualidad, la mayoría de la investigación en el campo se hace en macrófagos líneas celulares, que difieren de los macrófagos primarios en la actividad fagocítica, la producción de citoquinas y la regulación de la explosión oxidativa. Además, son menos adecuados para la microscopía. Para investigar la interacción macrófagos-patógenos, se recomienda utilizar los macrófagos primarios, como la médula de macrófagos derivados (BMDMs), que presentan características más fisiológicas. Además, es posible trabajar en BMDMs modificados genéticamente, debido a que estos macrófagos pueden ser aislados directamente a partir de ratones transgénicos y, con la disponibilidad de nuevas tecnologías, tales como la transfección lentiviral, su perfil de expresión génica puede ser alterada por la sobreexpresión del gen o ARN de interferencia. Aquí se describe un procedimiento para diferenciar murino m huesoflecha en macrófagos que proporcionarán un gran número de macrófagos en 7 días para diversos análisis funcional, como la proteómica 7, 8 transcriptómica, tráfico intracelular estudia 9, 10 estudios dinámicos, pantallas genéticas (RNAi), y detección de drogas 11.
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Protocol
Declaración de Ética
El protocolo para el manejo de animales fue aprobado por el Comité de Ética institucional Animal "Conseil Scientifique du Centre de Formation et de Recherche Experimental Médico-Quirúrgica" (CFREMC, permiso Proyecto 10-300122013 a Eric Ghigo) de la Universidad de Aix-Marsella, en acuerdo con las reglas del Decreto N ° 87-848 del 10/19/1987. Los experimentos se realizaron en la Faculté de Médecine de la Timone (número de permiso de Experimentación 13.385 a Eric Ghigo).
1. Material y Cultura Preparación de Medios
- Esterilizar dos pinzas, dos tijeras, dos cuchillas quirúrgicas, un mortero y una mano de mortero.
- Obtener DMEM completo que contiene 10% de suero de ternera fetal (FCS), glutamina 2 mM, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina.
- Diluir 10 veces en PBS agua destilada estéril para obtener PBS 1x.
- Obtener enfriado con hielo 1x PBS, DMEM completo enfriado con hielo, WA DMEM completormado a 37 ° C.
2. Preparación de sobrenadantes de células L929
- Crecer células L929 hasta confluencia (veinte por 175 cm 2 frascos) en DMEM completo a 37 ° C, 5% de CO 2.
Nota: Se requiere de colonias de granulocitos y macrófagos factor estimulante (GM-CSF) para inducir la diferenciación de células hematopoyéticas en macrófagos 12. L929 células producen GM-CSF.
- En la confluencia, sustituir el medio de cultivo por DMEM completo fresco. Transferencia frascos a 32 ° C, 5% de CO 2 durante 10 días.
- Recopilar, piscina y centrifugar los sobrenadantes a 750 g durante 10 min. Desechar los sedimentos celulares.
- Sobrenadantes tienda en tubos de 15 ml y almacenar a -20 ° C.
3. Médula ósea derivada de macrófagos (BMDM) Preparación
- Sacrifica 1 ratón por dislocación cervical.
- Utilice cuchillas quirúrgicas estériles durante todo el experimento. Desinfecte la piel con 70% alcohol. Hacer una incisión en la parte superior de cada pata trasera y tire de la piel hacia abajo hacia el pie para exponer el músculo.
- Cortar las patas traseras, quitar la piel con unas tijeras estériles y pinzas estériles. Coloque las piernas dentro de una placa de Petri estéril (35/10 mm) que contiene estéril, frío de hielo 1x PBS (5 ml).
- Retire la carne y los músculos que se ha adherido a los huesos con tijeras y pinzas estériles.
- Transferencia de los huesos en una nueva, placa de Petri estéril (35/10 mm) que contiene enfriado con hielo, 1 x PBS estéril (5 ml). Lavar los huesos dos veces con 5 ml enfriado en hielo, 1x PBS estéril.
- Transferir el hueso en un mortero estéril que contiene 5 ml enfriado en hielo, 1x PBS estéril.
- Cortar la tibia del fémur en la articulación con tijeras estériles. Aplasta los huesos suavemente en un mortero estéril que contiene 5 ml enfriado en hielo, 1x PBS estéril usando una mano de mortero.
- Recoger el sobrenadante en tubos de 15 ml enfriado en hielo. Repita este paso 3x.
- Filtrar con un 70 micras stra celular NylonINER para eliminar los fragmentos sólidos. Centrifugar el filtrado a 450 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Deseche con cuidado el sobrenadante. Disociar el precipitado en 10 ml de sangre roja tampón de lisis celular para 30 seg. Añadir 20 ml enfriado en hielo, DMEM completo.
Nota: El objetivo de este paso es eliminar la contaminación de las células rojas de la sangre, por lo tanto, este paso debe realizarse dentro de 2 min para evitar la alteración de células hematopoyéticas por la sangre tampón de lisis de glóbulos rojos.
- Se centrifuga a 450 × g durante 10 min a 4 ° C. Deseche con cuidado el sobrenadante. Disociar el precipitado en 20 ml de DMEM completo que se ha calentado a 37 ° C.
- Transferencia de las células disociadas en 2 placas de Petri (100/20 mm). Incubar durante 4 horas a 37 ° C.
- Reunir los sobrenadantes en tubos de 50 ml a temperatura ambiente. Deseche los platos que contienen los macrófagos residentes.
Nota: El objetivo de este paso es eliminar el marro hueso residentemacrófagos w por su capacidad de adherirse a plástico de cultivo tratados. Estos macrófagos residentes pueden ser utilizados en otros experimentos.
- Centrifugar los sobrenadantes recogidos a 450 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante.
- Disociar suavemente el sedimento en 10 ml de DMEM completo que contiene 15% de L929 sobrenadante celular. Filtre las células a través de una 40 m de células colador de nylon.
- Recuperar el filtrado. Añadir el filtrado recogido (10 ml) a 140 ml de DMEM completo que se ha suplementado con 15% de L929 medio celular.
- Distribuir 10 ml de la suspensión de células por placa de Petri (15 placas de Petri, 100/20 mm). Se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Se cultivan las células durante 3 días
- Añadir 10 ml de DMEM completo que se ha suplementado con 15% de L929. Se incuban las células durante 4 días adicionales.
Nota: Supervisar periódicamente el crecimiento de células con un microscopio invertido (pasos 3.14 a 3.16). Macrófagos adherentes seránobservado después de 3 días de cultivo.
4. BMDMs Cosecha
- Eliminar el sobrenadante. Lave BMDMs 2 veces con DMEM completo
- Añadir 5 ml de DMEM completo que se ha calentado a 37 ° C. Separe BMDMs raspando suavemente con una espátula de caucho.
- Recoger BMDMs en tubos de 50 ml y centrifugar a 450 xg durante 10 min. Disociar suavemente sedimentos celulares en 20 ml de DMEM completo.
- Cuente BMDMs en presencia de azul de tripano (sin mortalidad superior al 10% debe ser observado).
Nota: Por lo general, alrededor de 6-7,5 x 10 7 macrófagos se obtuvieron a partir de 15 placas de Petri (100/20 mm) de los macrófagos. Hay aproximadamente 4-5 x 10 6 macrófagos / placa de Petri (20/100 mm).
- Preparar BMDMs según sea necesario para el experimento. Después de 16 h en medio completo a 37 ° C, 5% de CO 2, macrófagos volverá a adherirse al soporte.
5. Almacenamiento BMDMs
- Recoger BMDMs aislados (paso 4.3). Se centrifuga a 450 × g durante 10 min. Nota: BMDMs pueden congelarse en nitrógeno líquido.
- Resuspender los sedimentos celulares en medio de congelación que consiste en 10% de DMSO y 90% de FCS a una concentración final de 4 x 10 6 células / ml y pipeta de 1 ml en cada ampolla.
- Congelar las células a una velocidad de enfriamiento de 1 º C / min. Después de 24 horas, transferir la ampolla a un contenedor de nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.
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Representative Results
El objetivo de este método era obtener fácilmente un gran número de macrófagos en pocos días. La preparación de células de médula ósea se ilustra en la Figura 1. Los huesos de la pata trasera se recogieron y se rompieron en un mortero. Una vez que los macrófagos residentes fueron retirados de la preparación de células de médula ósea, células de médula ósea se incubaron con GM-CSF (Día 0). Después de 3 días, las células, que eran redondas y no adherente antes del cultivo, comienzan a diferenciarse en macrófagos y adherirse (Figura 1A). Citometría de análisis utilizando F4/80 y marcadores HLA-DR revelado que las células expresan ambos marcadores tanto, que acrediten que se diferencian en macrófagos (Figura 1B). Después de 7 días, una monocapa BMDM se obtuvo con 6-7,5 x 10 7 BMDM / ratón. Los macrófagos pueden ser utilizados en diferentes tipos de experimentos (Figura 2). Las actividades funcionales de la BMDMs pueden determinarse de diferentes maneras. Por ejemplo, phagocytos BMDMes decir se controló por el látex del grano internalización. El número de perlas por célula aumentó con el tiempo (Figura 2A). BMDM potencial endocítica (Figura 2B), también se evaluaron las interacciones patógeno bacteriano (Figura 2 C) y las vías de transducción de señales (Figura 2D).
| Ubicación | Los tipos de células |
| Hueso | Osteoclastos |
| La médula ósea | Pro-monocitos, macrófagos |
| Sistema nervioso central | Célula microglial |
| Lámina propia | Macrófagos Residente |
| Hígado | Las células de Kupffer |
| Pulmón | Macrófagos alveolares |
| Sangre periférica | Monocitos |
| Cavidad peritoneal | Macrófago peritoneal |
| Piel | De células de Langerhans |
| Bazo | Macrófagos Residente |
| Timo | Macrófagos Residente |
Tabla 1. Fuentes de macrófagos en los tejidos y fluidos.
Figura 1. Vista esquemática de la producción BMDM. (A) Esta figura ilustra los pasos de BMDM diferenciación de la diferenciación de progenitores (día 0), con vencimiento macrófagos (day7). (B) Análisis FACS ilustra la pureza de las células aisladas en el día 7, utilizando como macrófagos marcadores de HLA-DR y F4/80. Haz clic aquí para ver en grander figura.
Figura 2. Ejemplos de experimentos que son posibles con BMDMs. (A) ensayo de fagocitosis. BMDMs se incubaron durante diferentes períodos de tiempo con perlas de látex, y la absorción de grano se observó por microscopía. (B) intracelular Coxiella burnetii lipopolisacárido (LPS) de localización en BMDMs. LPS (en rojo) se localizó en un compartimiento que alberga membrana lisosomal asociada a la proteína-1 (LAMP-1) (en azul), pero no de la catepsina D (en verde). Este experimento demuestra que el LPS está presente en endosomas tardíos que no son capaces de fusionarse con los lisosomas. (C) BMDMs infectadas con Tropheryma whipplei (en rojo) no se localizan en el compartimento que alberga la catepsina D (en verde). (D) immunob Representantemucho demostrando total de (t) y fosforilado (P) p38 niveles de MAP quinasa en Escherichia coli BMDMs estimuladas con LPS (1 mg / ml). Las barras de escala representan 5 micras.
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Discussion
El protocolo descrito en el presente documento detalla un método para producir un gran número de BMDMs. BMDM son células primarias y tienen la función y las propiedades de los macrófagos a partir de monocitos diferenciados biológica porque hay madura, en contraste a las líneas celulares de macrófagos, que son inmaduros. BMDMs pueden ser utilizados para la investigación genética (RNAi), la detección de drogas, los estudios funcionales, estudios de interacción huésped-patógeno y muchas otras áreas de investigación.
El procedimiento presentado en este documento es muy simple y no requiere ningún equipo especializado, por lo que se puede realizar fácilmente en un laboratorio o en el aula. Este método requiere un poco de práctica y destreza manual. También es posible almacenar los BMDMs en nitrógeno líquido, facilitando de este modo los experimentos futuros.
Hay varios pasos críticos para la cultura BMDM éxito: 1) el mantenimiento de un cultivo estéril, sana, 2) la extracción de la médula ósea debe ser eficiente; 3) L929 supcalidad ernatant es crítica; 4) no exponer las células a la sangre tampón de lisis de glóbulos rojos durante más de 2 minutos para evitar daños en las células hematopoyéticas.
Es posible hacer una modificación del protocolo, pero hay en la limitación de número. 1) DMEM que puede ser sustituido por RPMI 1640, pero la producción BMDM es menos eficiente; 2) comercial M-CSF (500-1000 UI / ml) puede ser utilizado en lugar de L929 sobrenadante, pero es caro y M-CSF tiene que ser añadido cada 2 días a las células durante el proceso de diferenciación; 3), alternativamente, la médula ósea se puede extruir a partir de hueso usando una jeringa equipada con 25 g de aguja en lugar de aplastar los huesos en un mortero estéril usando una mano de mortero.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el CNRS (PICS 2012-2014 a EG) y por una beca de la Regione Campania (n.5 LR, 28.03.2002 a Giovanna Mottola). Filippo Conti es un compañero de la Cooperación Científica Fundación'' Infectiopole Sud''. Nicola Boucherit es becario del Ministerio francés de Investigación y Tecnología. Las fuentes de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida de datos, análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco Life Technologies | 21969-035 | |
| Fetal Calf Serum | Gibco Life Technologies | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15070 | |
| Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-024 | |
| PBS (10x) | Lonza | BEM515F | |
| Red Blood Cell Lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer 70 μm Nylon | BD Falcon | 352350 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| Petri dishes (100/20 mm) | any supplier | n/a | culture treated |
| Petri dishes (35/10 mm) | any supplier | n/a |
References
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