Introduction
循环外来体的确切功能仍未知的很长一段时间。即使是现在外来体的完整路径机制尚不完全清楚。由于外来体携带的抗原，蛋白质和涉及到他们的亲本来源的细胞，它们的功能的细胞 - 细胞信号发送器的RNA（mRNA和miRNA）的主要被给予优先权。
许多不同的方法已经在文献中描述的用于分离和外来体1,2的定量检测。然而，在“金标准”没有达成共识已经达成。与此同时，大多数科学家活跃在切体研究领域的同意，孤立的一致方法非常必要的，以实现更高程度不同的报告和研究报告之间的可比性。
荧光激活细胞分选（FACS）是用于外来体分析3中最常见和普遍的工具。 FACS有奔EFIT即，通过荧光标记，来自不同来源的细胞可以在一个步骤中进行比较。 FACS的主要缺点是，该方法是不够敏感，以确定颗粒小于0.5微米4，而外来体一般是30-120纳米之间在直径为5，甚至更少来测量它们的大小。
扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）的其他工具进行颗粒尺寸和外来体的形态学分析。但是，这两个SEM和TEM的缺点是样品的制备是费时，这两种方法涉及劳动密集的步骤和各具有工件生成的一些风险。既不方法适合于高样品通量和几千一个样品的单一颗粒的表征。此外，可以同时或至少分析在非常短的周期进行定量分析，为临床日常其中样品具有通常被难以进行。新一代的技术，现在让我们来分析外来体，恕不另行紧张的筹备工作（ 例如，环境SEM）。这些现代化的技术仍然相当不方便分析含外来体，以确定它们的平均数量和规模分布6大体积悬浮液。
另一个可视化和外来体的分析高度敏感的方法是纳米粒子跟踪分析（NTA）。这种方法利用了物理两种不同的原则。首先，颗粒通过散射当它们被照射激光束的光检测。第二个现象被称为布朗运动，根据该不同的颗粒在液体中的悬浮液的扩散成反比它们的大小。在后一种情况下，该运动也取决于温度和液体的粘度。然而，这样的速度是直接关系到颗粒大小和所使用的NTA。使用软洁具为基础的分析，散射光从单颗粒数字图像记录。散射光斑点的图解和其运动速度提供便利的总粒子数和粒径分布的测定数据。这种技术是对小于100纳米的平均直径的粒子分析特别强大。
大小和浓度测量与ZetaView布朗和电泳运动视频分析显微镜进行。这是一种半自动化的桌面纳米颗粒分析仪对液体样品（以下简称为颗粒跟踪仪）。它由粒子追踪分析仪，以及与用于数据分析的软件的笔记本电脑。异质生物样品是作为适合于这种方法，无机颗粒的更均匀的悬浮液。一种激光散射显微镜用摄像机被用于颗粒的检测和用于OBSErvation他们的行动。而在显微镜轴线是水平的，并聚焦到填充有含有外来体的悬浮液的小区的信道时，激光束是垂直取向的。通过激光散射的光，这是根据90°经由显微镜（ 图1）所记录的数字视频相机照射的粒子。的散射光的强度可以观察粒子大60纳米的直径。在这样一种设置的粒子的亮度不粒度的唯一指示。当没有施加电场，粒子运动只有如下布朗运动并且可以用作用于计算粒径的指标。然而，该仪器还能够在整个小区通道施加电场的。当进行这一领域的潜力，极性和离子电荷的悬浮外来体的级成为他们移动的方向的进一步的决定因素。速度和方向，导致电泳莫相容性直方图。
同时发现，分析分离的外泌体的最佳方法是一个问题，另一个位于从不同的媒体，如血液，腹水，尿，乳汁，羊水或细胞培养基的外来体的有效的隔离。不同的方法已被描述迄今，其基于超速离心1，工业分离试剂（如Exoquick）7，磁珠抗原采用分离8或超滤步骤9。
在这个协议中，我们展示的切体隔离，通过超速离心的全过程，并展示了如何通过分析粒子跟踪仪含停牌产生的切体。提供特定的考虑因素的人血浆或细胞培养基衍生的外来体的分析。
Protocol
注：在这项工作中提出的试验已获得杜塞尔多夫大学的机构伦理委员会。
1.外来体的制备
- 通过静脉穿刺采集全血中3柠檬酸管（总共9毫升）中。倾血液入15ml Falcon管中。
- 离心样品在1500×g离心20分钟，在4℃下，从等离子体引发的细胞的分离。上清转移到一个新的15毫升猎鹰管。
- 离心样品在2800×g离心20分钟，在4℃下，以从血浆中除去所有的细胞（无细胞的血浆; CFP）。转移CFP超离心管，每管1毫升。
- 离心机以100,000×g离心90分钟，在4℃下以耗尽外来体。取出900微升上清液。重悬浮沉淀在超速离心管中的剩余的100微升。添加900微升PBS。
- 离心再次以100,000×g离心30分钟，在4℃。取出900微升苏pernatant。重悬浮沉淀与剩余的100微升。
- 转印在40ml蒸馏水洗涤5到20微升的重新悬浮液。通过450nm的过滤器过滤该悬浮液以外来体从较大的颗粒中分离出来。使用这个最终的悬浮液粒子的测量。
粒子跟踪仪器2.启动程序
- 开始通过双击该软件图标的程序。点击各种软件的选项卡（“细胞检查”，“测量”，“分析”），它们之间在整个协议的切换。
- 按照屏幕上的说明启动过程的自动化实现。选择框两种细胞的质量检查和自动对齐。
注：以上任一步骤可以单独在必要时可重复按下“电池检查”选项卡上的按钮（A）或（B）。 - 打开NTA仪器的入口和出口，并注入10米升蒸馏水，用注射器入通过进气口的小区的信道。关闭出口孔作为水的最后量被注入。将在出口的烧杯收集废液。确保测量单元是不含气泡的，并且不注射器气泡进入系统。立即关闭进气口。
- 点击“OK”执行小区质量检查。几秒钟后，该软件会显示电池质量的结果。
- 如果有任何颗粒仍可视化软件的实时取景画面，或如果质量检查的结果是唯一的好或差，重复步骤2.3，直到剩下的颗粒从测量单元中删除。每次测量后，也重复步骤2.3，以避免粒子的聚集。如果重复蒸馏水注射细胞检查不会产生一个“好”的结果，进行2.9。
- 制备含统一200纳米大小的POL控制悬架要使用ystyrene颗粒对准激光器和显微镜的焦点。添加一滴悬浮液浓缩物，由仪器制造商提供的，500毫升蒸馏水，以获得所需的浓度，使得600±100颗粒被在实时取景显示的每个画面。
- 注入对准悬浮到NTA仪器如在步骤2.3中所述。按“OK”，开始自动校准，自动的例行通过该系统会自动找到两个焦点的最佳位置。
- 当出现提示，说明该系统现在准备的实验，点击确定开始测量。
- 偶尔，由冲洗细胞用乙醇30％的溶液手动清洁实验之间的小区的信道。清洁时，软件会显示一个自动错误报告的通道。
3.测定样品的
- 同花顺前EA蒸馏水通道CH样品测量（如在步骤2.3中所述）。
- 注入的外来体悬浮液中的信道（其制备在第1），如在步骤2.3中所述。
- 根据需要调整软件中的以下主要参数：
- 灵敏度。为了找到最优灵敏度范围，按一下按钮“粒子与灵敏度的数量”，以显示一个曲线为每个画面测量的颗粒为不同的灵敏度水平。选择了该曲线的最大斜率前一个灵敏度水平。更高的灵敏度级别允许更多的小颗粒的可视化，但也增加了相关的背景噪音的问题。
- 最低亮度。选择了20的切体测量使用此功能作为过滤器起始亮度。调整这个参数多达空白出强烈的光散射粒子。规范下来放大弱散射的文物。变化的亮度根据需要在整个实验。
注：粒子轻散射太强烈重叠并且可以排除由错误的分析。 - 最小和最大尺寸。设置数字滤波器通过调节的最小和最大尺寸，以消除从过大的颗粒像素噪声和无用飞散。使用范围为10至500个像素为外来的测量。
- 快门。调整的时间，该照相机是打开以1/300秒的周期。
- 住读出参数：
- 通过点击“实时图像”按钮，数字和模拟视图手法在任何点之间切换。
- 在整个实验中，监测散射强度栏，其中显示的样本作为颜色编码表示的饱和度状态。不分析，如果外来体散射条为红色。在这样的情况下进一步稀释样品，以避免这种现象。如果在实验条件禁止的操作的样品悬浮液，下调的敏感性或上调在软件 - S的亮度ettings改善测量结果。
注意：当具有非常高浓度的颗粒的样品进行分析的散射会熔合单个颗粒和它们被计为一个单颗粒。 - 注意从显示在视野计数的粒子数。
- 点击“测量”选项卡上。
- 选择在“运行选项”阵列设置。
- 每次收购之前，选择一个反复检查颗粒漂移测试“检查运动”。在开始整体分析之前进行测试至少一次。如果漂移是高于20微米/秒，持续测量使得样品停止流动之前等待。
- 选择的实验（5）的数量和它们之间的时间延迟（0）。
- 进行“抽样检查”，如果必要的。这个测试是自动对准在启动过程的一部分，并且可以重复之后根据需要。
- 最后点击“运行视频采集”按钮。在新窗口中，定义周期（15）的数量和测量位置的数目（11）。
注：激光头，并在显微镜可以被移动到分析的粒子数在11个不同的位置上。根据实验的需求，决定是否在实验应该在一个单一位置，或在不同的位置上进行。- 确认的最小持续时间的颗粒具有通过设置视频分辨率（低）被跟踪要被计数为一个单独的粒子。较低的分辨率结果在更短的时间跟踪。
- 选择一个文件名，然后单击“确定”开始测量。
4.解读结果
- 查看测量后显示下列结果和参数中的“结果”标签：跟踪粒子（1）的总数目，的部分（2）的平均数目每位置，和（3）颗粒浓度icles。
- 查看结果平均表粒径（直径，表面和体积）的颗粒数的百分比的数值比，以及平均和标准分化的值。
- 如果存在于图形分析多于一个峰使用峰分析表。此表显示的颗粒，比第一或分别第二峰值较小的分布。
- 查看测量后计算看到颗粒通过尺寸分布的曲线图。使用在显示模式和图表上方的图标来改变设置。
Representative Results
用于此示范试样示出了用于测量的85％的灵敏度，所述灵敏度曲线的最大斜率之前（ 图2）的最佳设置。亮度，最小/被选择最大值作为建议的协议。 5.3颗粒/ ml的浓度×10 6个，测定，而颗粒的平均粒径为0.149微米，其中大多数是0.137微米。
测量后收到的值可以保存在一份报告名为.pdf的文件格式或为.txt导出到数据库中。如在协议（第4节）中描述的图形可以调整为优选的。视频序列也被保存并且可以用于购买离线再分析。然而，在这样的离线分析，摄像机的事先取得设置不能追溯改变。
为了找到最佳参数设置用于测量中，我们在这里描述第对100纳米的聚苯乙烯尺寸标准的例子，仪器设置E优化。的两个参数，灵敏度和最大/最小尺寸上的视频图像和粒度分布的影响进行了详细的讨论。所有其他参数总结在表1中 。
的灵敏度（从50至94）上的模拟和数字图像的影响的视觉印象被可视化在图3中，从图像导出定量信息显示在图4中 ，基于表1中的设置，闵尺寸= 5和最大尺寸= 200检测到的颗粒相对于灵敏度的数目的典型关系示于图4A中 。在50和90中，检测到的颗粒的数量增加，灵敏度和急剧上升为灵敏度> 90。 66和86（A）之间发现敏感性的最佳范围。与DIF得到粒度分布同的灵敏度设置如图4B。的粒度分布代表三个独立测量的平均值。对于过低的灵敏度（灵敏度= 62，红色曲线），只有少数粒子进行分析从而导致比较差的统计数据。分析颗粒的数目增加，灵敏度达到70（黄色曲线）和86（棕褐色曲线）之间的最佳。进一步增加了灵敏度引线与颗粒滴和粒度分布朝着更小的尺寸（灵敏度= 94，蓝色曲线）移位的数量粒度分布的恶化。 图4C示出的数量基于X50直径的趋势（50％颗粒比这更小的直径），为灵敏度的函数。在米色间隔，粒径的相对标准偏差小于8％，并对应于最佳间隔A中的红色区域表示RSD> 8％为差统计（灵敏度太低）或宽DISTRI的结果butions与移位到更小的尺寸（灵敏度太高）。
闵尺寸与最大尺寸的设置是应用于数字图像，以便与光斑尺寸小于最小尺寸小，比最大尺寸更大去除颗粒过滤器。由于散射光的能力，一个粒子产生一定大小的一个数字图像的一个点。光点的大小被测量为像素数（像素）。当粒子散射光非常好（ 例如，颗粒> 200纳米或聚集体），光点尺寸是相当大的， 例如，> 500像素。光点尺寸是相当小的（ 例如，<10像素）取决于颗粒材料的小颗粒（ 例如，<20纳米）。光斑大小（像素）可以不互换粒径（nm），因为它们是不相同的，并在这两个变量之间没有直接关系。的最小和最大尺寸的优化，用户可以过滤掉不需要的对象，如结块（最大尺寸）或小的对象，如背景噪声（最小尺寸）。对100nm的大小标准品的粒度分布最小/最大尺寸的影响示于图4D（灵敏度= 82）。当的时间间隔被设定为小的光斑尺寸（ 例如，最小= 1，最大值= 52;橙曲线），所分析的微粒的数目被减少，并且基于数X50直径略微移向较小的尺寸。的设置对于较大的斑点（最小= 40，上限= 1000;红色曲线）的结果是宽的粒度分布转向较大尺寸。为了获得相等的总数目的颗粒，这两个橙色和红色的分布的间隔的边界进行了调整，以匹配80的颗粒。与最佳设置的分布（分= 5，最大= 200;棕褐色曲线）由360粒。
进行了一系列成功的实验与外来体分离超速离心，并使用所提出的系统由NTA测量。所得到的数据是高度一致并确认再现性的高的水平。其他分离方法应该显示类似的结果。然而，稀释步骤被认定为特别关键的步骤和对所算出的总数目颗粒的影响，必须重新评估。
图1.原理图NTA的安装程序 。显微镜/视频轴和激光光束被正交定向为彼此交叉处的单元信道的横截面。光散射粒子会显示在软件的“实时视图”窗口。 请点击此处查看该图的放大版本。
被显示在模拟和数字影像。在实时取景画面上可视颗粒的灵敏度的图3的影响为50至94的灵敏度为模拟（顶行）的D数字（下排）的意见。当灵敏度太低，只有少数的粒子检测（左）。在最佳灵敏度的粒子显示为单一的点彼此（中）以及隔离。在相对 高灵敏度的粒子融合在一起，导致图像质量差（右）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.影响的敏感性最小和最大大小设置为控制100纳米的聚苯乙烯颗粒的样品（A）的敏感性与颗粒的检测数量的情节。最佳间隔是从66至86，前曲线的最大斜率。与几个灵敏度设置（62至94得到的（B）的粒度分布）;图表为过低（62）或太高（94）的灵敏度不捕获为100纳米的聚苯乙烯对照样品的粒度分布。 （C）的数50倍口径与敏感性; X50在米色间隔误差小于8％，最佳的间隔从66到最小值和最大值的粒度分布大小86（D）的影响;最佳参数（分= 5，最大值= 200）捕捉到正确的分布对照样品。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 收购前的参数 | |
| 灵敏度 | 变量 |
| 快门 | 40 |
| 帧速率 | 每秒30帧 |
| 决议案 | 你好GH |
| 周期 | 10 |
| 多个收购 | 3 |
| 位置 | 1 |
| 收购后的参数 | |
| 闵亮度 | 三十 |
| 最大尺寸 | 变量 |
| 闵私迮 | 变量 |
表1的前和后采集参数为粒子跟踪仪器的设定综述。
Discussion
我们证明用于从血液和本纳米粒跟踪外来体分离为一个新颖的和创新的方法来测量在生物流体外来体的大小和浓度的详细协议。在所提出的实验人外周血用作外来体的来源。然而，其他来源，如尿，痰，细胞培养上清等，也可以被用来作为测试材料。
基于在人类中外来体的浓度的生物变异性，从不同的个体测定可设有外泌体的一个显着变化的浓度。然而，在生物测试探针粒子的浓度可能对结果产生影响。因此，需要一种用于探针的稀释的可靠和标准化的方法。在该方法包含外来体血浆9毫升外周血全血中产生。使用差速离心步骤外来体丸粒从分离1毫升血浆并重新悬浮于5ml蒸馏水以产生悬浮外来体的工作示例。此预先定义的设置为我们提供了颗粒的适宜浓度， 即 NTA在适当的散射强度。旁边的体积和稀释的方面，所使用的溶液的组合物也是重要的。我们已经用蒸馏水进行最后再悬浮外来体。当然，也可以使用不同的介质进行最后稀释步骤，根据所述实验设置的要求。然而，在离子的溶液具有缓冲能力测试样品特别是当ζ电势测量的情况下，谨慎的稀释在紊流自由条件是有用的。对多个样品的直接比较，我们建议保持对所有样品相同的稀释程度。除了敏感性和视频分辨率都设置可以事后通过使用ZetaView分析软件来改变。
10等系统。我们相信，有关样品处理结果的可重复性和实用性方面是至关重要的选择方法序列切体的评价。我们还认为，理想的检测系统应该消除可能与测量结果干扰用户取决于因素。即这里介绍的外来体分析方法满足了容易处理，以高度的标准。作为另一个优点，在一个快速的过程中进行样品的半自动化分析，产生的结果在很短的时间。外来体的在线可视化辅助分析仪GA在外来体的特性， 比如，总浓度瞬间的想法。
一个非常简单的，但优雅除了这里介绍的测量技术是利用抗体标记的外来体和散射激光束通过在检测器的前面使用前的过滤器捕获。以这种方式外来体亚群可根据其表面抗原和其它生物的相关特征是技术上可访问的选择性荧光染色来区分。
我们的粒子跟踪仪器的当前版本的一个缺点是，在非常高的灵敏度水平工件诸如背景噪声可能成为本，这是基于该单元沟道壁。一个技术解决方案，并改善当前系统可能在不久的将来变得可用。通过在通道壁上的激光散射光的这种方法反射将被减少，从而增加了测得的信号和获得的数据和降低检出限的准确性。
尽管当前使用的协议，用于外来体分离是公认的和所施加的粒子跟踪仪具有30nm的下部粒度分布的显着精确的分辨率，但不保证所检测的粒子确实完全正确的外来体。其他颗粒，如死细胞碎片或更大的蛋白质复合物也可以存在于外来体悬浮液，并导致假阳性信号。一个可靠的方法，使这种“污染”可排除可能是电子显微镜（EM），无论是传输EM或扫描EM。不幸的是，没有一般和特殊标记的外来已经确定，到目前为止，虽然有一些先前提出的表面标志已获得了越来越多的关注，其中包括四旋（TSPAN），CD81，C63，CD9 等 11。
“>无论对外来体生物，特别是有关外来体特异性标记研究的未来进展，那就是这里介绍的协议将提供一个强有力的方法用于分离和检测外来体。浓度和尺寸可以很容易地在软件辅助确定直接的方式，该加的选择性荧光标记或荧光团偶联的抗体可能会进一步提高NTA的呈现的方法的可能的应用。Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Citrate tube | BD | 364305 | BD Vacutainer |
| Distilled water | Braun | 3880087 | Aqua ad iniectabilia |
| Falcon tube | Greiner Bio One | 188271 | PP Tube, Steril 15 ml |
| Ultracentrifugation tube | Beckman | 357448 | Microfuge Tube Polyallomer 1.5 ml |
| Polybead | Polysciences, Inc. | 07304 | 2.6% Solids-Latex Alignment Solution |
| Syringe (Filter) | Braun | 4617053V | 5 ml |
| Syringe (ZetaView) | Braun | 4606051V | 5 ml |
| Needle | BD | 305180 | BD Blunt Fill Needle |
| Filter | Sartorius Stedim | 16555 | Syringe filter, hydrophilic, 450 µm |
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-M | Rotor: 70Ti Ser. No E21078 |
| ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type 101 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Rotor: A-4-44 |
References
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. Chapter 3. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. . Current protocols in cell biology / editorial board. Bonifacino, J. S. (3.22), (2006).
- Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in molecular biology. 728, 235-246 (2011).
- Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. , e3037 (2012).
- Konokhova, A. I., et al. Light-scattering flow cytometry for identification and characterization of blood microparticles. Journal of biomedical. 17, 057006 (2012).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica et biophysica acta. 1820, 940-948 (2012).
- Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 87, 146-150 (2011).
- Exoquick, ExoQuick-TC and ExoQuick-LP. Polymer-based exosome preciption. System Biosciences. , Available from: http://www.systembio.com/microrna-research/exoquick-exosomes/overview (2015).
- Clayton, A., et al. Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry. Journal of immunological. 247, 163-174 (2001).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Amer. J. Phys. Renal Phys. 292, F1657-1661 (2007).
- Carr, B., Warren, J. Company profile: NanoSight: delivering practical solutions for biological nanotechnology. Nanomedicine. 7, 1129-1132 (2012).
- Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. International immunology. 17, 879-887 (2005).
