Summary
세포의 빠른 기계적인 변형은 고분자 나노 물질의 세포 내 전달을위한 약속, 벡터없는 방법으로 떠오르고있다. 이 프로토콜은 다양한 애플리케이션을 위해 시스템을 사용하는 방법에 대한 자세한 정보를 제공.
Abstract
세포의 빠른 기계적인 변형은 고분자 나노 물질의 세포 내 전달을위한 약속, 벡터없는 방법으로 떠오르고있다. 이 기술은 이전에 도전 응용 프로그램을 해결 잠재적 보여 주었다,, 등의 기본 면역 세포, 세포 리 프로그래밍, 탄소 나노 튜브, 양자 도트 배달에 납품 할 수있다. 이 벡터없는 미세 유체 플랫폼은 타겟 재료의 세포질 전달을 용이하게 세포막의 기계적 파괴에 의존한다. 여기서, 우리는 장치의 조립, 세포 준비 및 시스템 운영을 포함하여 이러한 마이크로 유체 장치의 사용의 상세한 방법을 설명합니다. 이 전달 방식은 디바이스 타입 및 이전에보고되지 않은 애플리케이션을위한 작동 조건의 간단한 최적화를 필요로한다. 이 시스템은 전문 버퍼 또는 화학적 변형 / 활용의 단계를 필요로하지 않기 때문에 제공된 지침은 대부분의 세포 유형과 전달 물질에 일반화되어 있습니다. 이 작품은 또한 제공의 장치 성능을 개선하고 막힘, 낮은 전달 효율 및 세포 생존과 관련된 잠재적 인 문제를 문제 촬영하는 방법에 대한 평가.
Introduction
세포의 세포질에 고분자의 배달 치료 및 연구 응용 프로그램에서 중요한 단계입니다. 단백질 전달 임상 3 및 실험실 모두 4 설정에서 세포 기능에 영향을 미치는 유망한 수단 동안 나노 입자 매개 배달, 예를 들어, 유전자 치료 1,2 잠재적 보이고있다. 이러한 작은 분자 약물, 양자 도트 또는 금 나노 입자와 같은 다른 재료는, 5,6 암 치료제 9 추적 세포 내 라벨 7,8, 단일 분자에 이르기까지 다양한 응용 프로그램에 관심이 있습니다.
세포막은 거대 분자에 크게 불 투과성이다. 많은 기존의 기술은 막 중단 또는 세포 내로 전달을 용이하게하는 고분자 나노 입자 10, 11, 리포좀 (12), 또는 화학 물질 수정 (13)를 사용합니다. 이러한 방법에서, 전달 효율 및 세포 생존율 번째의 구조에 종종 의존전자 표적 분자 및 세포 유형. 이러한 방법은 핵산과 같은 구조적으로 균일 한 물질의 전달에 효율적이 될 수 있지만, 종종 단백질 (14, 15) 및 나노 물질 7과 같은 더 구조적으로 다양한 물질의 전달을 위해 아픈 적합합니다. 또한, 이러한 방법의 대부분에 의존하는 엔도 좀의 파괴 메커니즘은 따라서 소포 구조 16에 갇혀 많은 소재를 떠나, 종종 비효율적이다. 마지막으로, 자주 설립 세포 라인과 함께 사용하기 위해 개발 된 방법은 일차 전지에 잘 번역하지 않습니다.
이러한 일렉트로 17,18 및 sonoporation 19 같은 멤브레인 poration 방법은 일부 애플리케이션에서 매력적인 대안이다 있지만, 이들은 낮은 세포 생존율을 일으키는 것으로 알려져 있으며 목표 전달 물질의 전하에 의해 제한 될 수있다.
세포의 빠른 기계적 변형, 배달 미세 유체 접근 방식은, 최근에이 demonstr세포 리 프로그래밍 (20)과 나노 물질 전달 (21)의 맥락에서 현재의 기술에 장점을 ated. 이 방법은 주위의 버퍼에 존재하는 물질의 세포 내 전달을 용이하게 세포막 O를 기계적 파괴에 의존한다. 이 시스템은 이전에 세포 유형에 도전 (예 일차 면역 세포와 줄기 세포) 및 물질 (예 : 항체와 탄소 나노 튜브)에 전위를 가능하게 보여 주었다. 여기서, 대상 고분자의 세포 내 전달을 위해 이러한 장치를 사용하는 일반적인 절차가 설명된다. 그러나, 그것은 이전에보고되지 않은 응용 프로그램에 대해, 우리의 이전에보고 된 설계 가이드 라인 (20)에 설명 된대로 하나의 조건에 대한 간단한 최적화를 수행 할 것을 권장하며이 절차는 대부분의 세포 유형과 전달 물질에 일반화이다. 지금까지, 시스템은 RNA, DNA, 금 나노 입자, 양자점, 탄소 나노 튜브, 단백질의 전달을 위해 성공적으로 사용되어왔다S 및 덱스 트란 중합체 20,21.
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Protocol
1. 저장
- 70 % 에탄올에 저수지, 홀더, O-링과 미세 유체 장치를 저장합니다. 먼지 나 외부 입자에 의해 증발 및 오염을 방지하기 위해 뚜껑이있는 용기 (예를 들어, JAR 또는 비커)를 사용합니다. 셋째로 한 용기 (1), 저수지와 O-링 제 2 용기 (2)의 한 홀더에 장치를 위 (3).
주 : 스토리지 70 % 에탄올의 사용은 불임을 유지하는 것이다. 용액의 성분 만이 에탄올 및 물 (즉 명 변성 에이전트)되는 경우에, 모든 시스템 구성 요소가 완전하게 호환되어야하고 시간이 지남에 따라 열화하지 않을 것이다.
- 용기 (2)의 에탄올 용액을 변경하고 (3) 실험을 통해 교차 오염을 방지하고 막힘의 원인이 원하지 않는 입자의 존재를 최소화하기 위해 각 사용하기 전에.
2. 실험 준비
- 이쪽 용기 (2) 및 (3) 초음파 배스 FO각 사용하기 전에 R 5 ~ 10 분. 이것은 이전의 실험에서 어떤 오염 입자를 제거하는 데 도움이됩니다.
- 70 % 에탄올 용액으로 바이오 안전성 캐비닛 청소 작업 공간.
- 생물 안전 캐비닛 내부를하기 전에 70 %의 에탄올 용액으로 모든 자료 (3 컨테이너 및 핀셋)를 스프레이.
3. 조립
- 작업 영역에서 2 ~ 3 저 보풀 와이프를 설정합니다.
- 핀셋과의 컨테이너에서 플라스틱 저수지를 제거하고 내부 표면에서 에탄올 용액의 증발을 촉진하기 위해 잎사귀에 그들을 설정합니다. 부드럽게 표면 저수지 누르거나 에탄올 용액의 제거를 용이하게하기 위해 그들을 통해 공기를 불어.
- 저수지에서 자신의 해당 슬롯에 O-링을 삽입합니다.
- 각각의 용기에서 홀더와 칩을 제거하고 에탄올 (~ 1 ~ 2 분) 증발 할 수 있습니다.
- 홀더에 원하는 칩 앞면 (최대 즉, 액세스 구멍)을 배치 핀셋을 사용합니다. 홀더를 올립니다이 칩은 확인 칩이 홀더에 납작하게되어 있는지 확인하고 필요한 경우 핀셋으로 조정 eyelevel하기로. 중요 : 디바이스 홀더에 적절하게 맞지 않는 경우,이 이후의 단계에서 중단 것이라는 위험이있다.
- 다음, 부드럽게 홀더에 저수지를 배치하고 클립을 맞 춥니 다. O-링은이 과정에서 자신의 슬롯에서 떨어지지 않도록주의하십시오.
- 딸깍 소리가 나면서 고정 될 때까지 조심스럽게 저수지 아래로 누릅니다. 저수지의 양쪽이 안전하고 칩이 올바른 위치에 나타납니다 있는지 확인합니다.
4. 휴대 준비
- 부착 세포 (기본 또는 설립 라인)의 경우 : 1-2 일 전에 실험에 플레이트 세포가 실험의 날에는 80 % 이상 합류 없는지 등.
- (PBS 또는 관련 미디어) 서스펜션에 세포를 넣고 1.0 × 10 6 세포 / ml 7 CEL 10 × 1.0의 작동 농도를 목표로LS / ㎖. 참고 : 우리는 인해 세포 농도에 전달 성능에 큰 변화가 관찰되지 않았다.
- 실험 목적 물질의 농도를 구하는 분리 튜브에 세포 및 원하는 전달 물질을 혼합한다. 중요 : 설명 배송 방법 전달을 용이하게하기 위해 확산에 의존하기 때문에, 더 높은 물질 농도가 높은 배달을 얻을 것입니다. 가능한 경우, 초기 임상 시험에 대해 원하는 재료의 1 μm의 솔루션을 사용하는 것이 좋습니다. 필요에 따라이 농도는 향후 실험에서 아래로 적정 할 수있다. 이 장치와 함께 사용보고 최저 농도는 10 nM의 21이다.
5. 조작
- 피펫 저수지 (현재의 디자인은 최대 150 ㎕의 용량을 가지고)에 세포 전달 물질의 혼합물. 주 : 대부분의 장치 디자인 때문에 채널을 통해 흐름의 방향이 중요하지 않습니다 완전히 되돌릴 수 있습니다. 샘플은 두 개의 저수지 중 하나에로드 할 수있다. 채워진 탱크에 압력 튜브를 연결하고 적절한 밀봉 (손가락 꽉 충분한 경우가 많습니다)를 보장하기 위해 너트를 조입니다.
- 레귤레이터에 원하는 수준으로 압력을 조정합니다. 이것은 세포가 장치를 통해 이동하는 속도를 제어한다. 버튼을 누를 때까지 세포의 흐름이 시작되지 않습니다.
참고 : 이전의 연구에서, 질소 또는 압축 공기가 캐리어 가스로 동일하게 일했다.
- 눈 높이에 장치를 올리고 저수지에서 액체가 쉽게 볼 수 있도록 방향을. 참고 : 저장 비우는 전에 시스템을 차단하기 위해 액체 열을 추적합니다.
- 저수지를 가압 세포의 흐름을 시작하는 버튼을 누릅니다.
- 액면은 저장조의 바닥으로부터 약 2mm 일 때, 신속하게 흐름을 중지 0 PSI에 레귤레이터를 돌려. 중요 : 탱크가 비워지기 전에 하나의 흐름을 중단하지 않을 경우, 하나는 collectio에서 샘플을 배출 위험N 저수지. 또한 유체의 열이 감지 할 수있을 정도의 속도로 이동되지 않았거나 초기 유량 (예를 들어 3 배 느린)에 실질적으로 상대적으로 둔화 한 경우, 장착 된 장치가 아마 막혀 교환 할 필요가 있음을 유의하십시오. 막힌 장치를 작동하면 높은 세포의 죽음으로 이어질 수 있습니다.
- 해당 저장소에서 처리 된 세포를 수집하고 원하는 컬렉션 튜브 / 플레이트에 배치합니다. 중요 : porated 세포가 최대 10 분 (20)에 대한 자료를 통풍 관하는 것 등이 단계에서 어떤 버퍼에 수집 된 세포를 희석하지 마십시오. 이 윈도우가 경과 한 후, 원하는 미디어 / 버퍼에 세포를 희석.
- 필요에 따라 5.7 - 더 많은 처리 된 세포를 수집하거나 다른 실험 조건을 실행하려면 반복 5.1 단계를 반복합니다. 칩을 뒤집을 수 있다는 것을 기억하라, 그러므로 샘플 저수지 중 하나에 장착 할 수 있습니다. 그들이 방해 할 경우 필요에 따라 칩을 교환해야합니다. 막힌 장치를 폐기하십시오.
6. 분해
- (1 절에 설명) 적절한 저장 용기의 각 부분을 놓습니다.
- 폐기를 위해 별도 용기에 사용되는 칩을 놓습니다.
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Representative Results
그림 1은 마이크로 유체 전달 시스템의 개략적 인 설명이 포함되어 있습니다. 2A-B 피규어 찬란 복합 3 kDa의 덱스 트란 (20)의 존재에서 다른 장치의 디자인으로 HeLa 세포 치료의 일반적인 결과를 보여줍니다. 절차가 올바르게 수행 될 경우, 시스템 성능은 디바이스의 종류와 작동 속도에 민감 할 것입니다. 따라서, 하나는 좀 더 복잡한 실험을 진행하기 전에 주어진 애플리케이션에 대한 이러한 조건을 최적화한다. 도면에 도시 된 작동 조건의 범위에서, 세포 생존하지만, 하나는 30 % 생존 정도 아래에 이어질 수 있다고 차선 대금 파라미터 (예를 들어 내용에 대해 칩 분류)을주지해야하며, 80 % 이상 남아있다. 따라서 생존 능력 및 전달 효율은 이전에보고되지 않은 세포 유형 동시에 최적화해야합니다. 장치 설계 대상 세포 유형에 부적절한 경우, 하나없이 배달에서 높은 C까지의 결과를 볼 것이다엘 죽음 (예를 들어, 10 %의 가능성). 실험 조건은 내용에 대해라면, 예를 들어 세포 표면에 결합한 표적 물질은, 하나는 표면 결합 신호가 세포질 신호를 마스크 할 수 정확하게 배달을 측정 할 수없는 경우가 있습니다.
그림 2C-D는 살아있는 세포 인구 내 전달 효율을 측정하기위한 우리의 선호하는 방법을 보여줍니다. 도 2C에서 제어 케이스는 세포 적어도 긴 처리를위한 케이스로서 전달 물질에 노출 될 때 모든 결합 표면 및 세포 내로의 효과를 반영하는 것을 의미한다. 배달 된 세포 집단은 제어 인구의 1-5% 그 영역 내에 있도록 음영 영역으로 정의된다. 이전 작업이 방법에서 배달 엔도 시토 시스 (20)에 의해 중재되지 않음을 설립합니다. 전달 된 예에서 관찰 더블 피크 분포는 반드시 시스템의 특징이 아닙니다 우리 시간으로AVE는 서로 다른 실험 조건에 대한 더 적은 균일 한 분포를 관찰했다.
마이크로 유체 장치의 전체 시스템과 인터페이스의 그림 1. S의 chematic은. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. HeLa 세포를 가진 주제 결과 20.) 전달 효율 및 캐스케이드 블루 공액 3 kDa의 덱스 트란 (0.2 ㎎ / ㎖)의 존재하에 3 개의 다른 장치의 디자인에 의해 처리 된 HeLa 세포의 b) 세포 생존율. 이들 실험에서, 세포들olution 3 % 소 태아 혈청과 1 %의 F68 pluronics를 함유하는 PBS로 10 mL를 기준으로 10 세포의 농도로했다. 생존 능력이 죽은 세포 및 배달 결과의 요오드화 프로피 듐 염색하여 측정 하였다는 살아있는 세포에만 표시됩니다. 모든 데이터 포인트는 세중의에서 실행 및 오류 막대는 2 표준 편차를 표현했다. C) 헬라 세포는 장치 처리 사례로 시간의 적어도 같은 양의 블루 복합 3 kDa의 덱스 트란을 계단식으로 노출 된 실험적인 제어를위한 대표 히스토그램. d) 세포 전달을 용이하게하기 위해 장치를 통해 전달 된 대응하는 케이스. 히스토그램의 음영 지역에 살아있는 세포 인구의 비율은 '전달'인구로 정의된다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
설명 된 실험 절차 (칩 설계 및 동작 속도 이외 즉 인자)의 특정 양상은 시스템에 적용되는 세포 유형 및 전달 재료에 따라 최적화 될 필요가있다. 주소에게 실험을 설계 할 때 고려해야 할 가장 일반적인 요소 중 일부를 다음과 토론.
형광 표지 화합물의 배달 신호를 개선하기 위해, 하나는 배경 형광의 원인을 해결하기 위해 필요합니다. 표면 바인딩 및 엔도 시토 시스, 예를 들면, 문화 또는 추가 처리를하기 전에 여분의 물질을 제거하는 출산 후 세포에게 5 ~ 10 분 세척에 의해 해결 될 수있다. 세척 단계를 포기하도록 선출하면, 주위 용액 중에 표적 물질의 농도를 낮추기 위하여 원하는 매체의 5 배에 의해 처리 된 세포를 희석하고 따라서 세포 내로 요금을 줄이기 위해 유용한 것이다. 어떤 경우에는, 예를 들어 단백질 전달을 위해, 하나는 필요한 능동적 셀 하던가을 차단하는 찾을 수도세륨 (예, 표지되지 않은 소 혈청 알부민을 사용) 전달 물질의 비 - 특이 적 결합을 최소화. 미처리 된 경우의 형광 강도는, 유동 세포 계측법에 의해 측정 한, 엔도 시토 시스 제어 이상의 볼수 낮은 경우 주어진 애플리케이션에서, 다음 바인딩 / 엔도 시토 시스는 문제가 될 수있다 표면. 배경 신호에 문제가 전달 물질의 직접 형광 검출에 대해서만 관련이 있습니다 endocytosed 또는 표면 결합 물질이 자주 비활성 상태로, 기능 분석 (예를 들면 세포 리 프로그래밍)은 일반적으로 영향을받지 않습니다.
치료 후 세포의 생존 능력을 향상시키기 위해, 하나는 인도 후 처리의 양을 최소화 할 필요가있다. 그것은 하나가 과도한 원심 분리를 피하거나 배달 완료 후 배양기 5 ~ 10 분에 자신의 원하는 미디어로 단계 및 전송 세포를 세척하는 것이 좋습니다. 부착 라인에서, 세포는 종종 완전히 준수하고 치료 후 24 시간 이내에 분할. 논의 이전으로iously (20)는, 우리는이 기술의 사용에서 장기적인 부작용을 관찰하지 않았습니다.
이 전달 시스템에 사용되는 마이크로 유체 장치는 시간에 막히는 경향이있다. 이 장치의 좁은 기능을 그대로 나막신 자주 수축에 형성한다. 막힘은 손상된 세포 나 환경 오염 물질에 의해 발생할 수 있습니다. 후자의 효과는 장치 (예 : 잘 유지 생물 안전 캐비닛) 운영을위한 깨끗하고 먼지가없는 환경을 보장함으로써 최소화 할 수있다. 현탁액에있는 세포 파편의 존재를 최소화하기 위해 세포주를 들어, 우리는 배달 1 ~ 2 일 전에 계대 세포를 추천합니다. 장치를 작동 할 경우, 하나는 저수지 유체의 체적 유량을 염두해야합니다. 유동 속도가 초기 속도의 제 아래로 떨어질 경우, 장치는 과도한 세포 사멸을 야기 할 수 있고, 교환되어야하거나, 흐름의 방향이 역전. 잠재적 막힘 문제도 mitig 할 수 있습니다40 μm의 셀 스트레이너 메쉬를 통해 세포 현탁액을 전달하여 ated. 이 프로세스함으로써 칩의 더 넓은, 낮은 유량 부에 형성되는 전위 막힘 방지 단일 세포 현탁액을 보장한다.
다른 전달 물질에 대한 실험을 설계 할 때, 하나의 타겟 재료의 크기와 농도를 설명한다. 이 기술은 파쇄 세포막 물질의 수동적 확산에 의존 같이, 몰 농도 구배 및 전달 물질의 유체 역학적 반경은 물질 전달의 속도를 제어하는 것 - 멤브레인 차질이 물질을 수용하기에 충분히 크다 가정. 그것은 자신의 작은 대향 부에 대하여 넓은 타겟 물질의 높은 몰 농도 (예를 들어 1 μM)을 사용하는 것이 바람직하다. 이 기술은 양자점의 배달 (21)의 경우 10 nm의 최저 농도에서 효과적인 전달을 보여 주었다. 또한, 기술은 N이다OT 재료 크기 및 확산도의 컨텍스트에서 제외 목표 전달 물질의 성질에 의해 제한되는 것으로 생각 (즉, 낮은 확산 성 재료는 낮은 전달 효율과 중단의 크기보다 큰 물질은 아마도 세포질을 입력 할 수있을 것이다).
세포 프로그래밍 및 양자점 배달 연구는 일렉트로에 셀 압착 방식 상대의 장점을 설명했다. 이 두 기술에 막 붕괴 메커니즘의 현재의 이해에 기초하여, 셀 압착 단백질, 작은 분자, 나노 물질 (20, 21)을 포함하는 애플리케이션에서 중요한 장점을 가지고 있음을 표시한다. (매우 상기 재료에 비해 청구됩니다) 핵산을 포함하는 응용 프로그램의 두 가지 방법 사이의 대비가 명확하지 않다.
배달이 마이크로 유체 접근 방식에 세포막의 기계적 중단에 의존세포 내로 물질의 수동적 확산을 촉진하고 세포 유형 (20)의 범위에 해당되는 것으로 밝혀졌다. 이 시스템은 거의 모든 세포 유형에 거의 모든 물질의 세포 내 전달을위한 주요 적절한에 따라서입니다. 우리는 시스템의 장점은 가장 전통적으로 (예를 들어 면역 세포 및 줄기) 세포 주를 형질 어려운 종래 도전 물질 (예 : 단백질, 양자점, 탄소 나노 튜브, 및 RNA)를 포함하는 경우에 두드러진다 믿는다. 면역 및 줄기 세포 응용 프로그램에서 언급 한 잠재력은 이러한 세포 유형을 다루는 전통적인 전달 방법의 단점을 강조했다. 그러나 시스템은 이러한 응용 프로그램이 핵에 납품을 요구하는 플라스미드 벡터로 유전자 전달을 용이하게하기 위해 더 개선해야 할 수도 있습니다. 요약하면, 우리는 납품에 미세 변형 방식은 잠재적으로 세포 내 전달을 기존의 많은 문제를 해결할 수 있습니다 생각합니다. syste에화학 벡터 또는 전기 분야의 M의 독립은 연구의 범위에 자사의 강력한 응용 프로그램을 수 있습니다. 여기에서 제공하는 지침은 독립적으로 이러한 시스템을 운영하는 관심있는 연구자를 활성화하고 자신의 연구 목적을 위해 그것을 적용해야합니다.
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Disclosures
저자 아르 몬 Sharei, 로버트 랭거 및 Klavs F. 젠슨은이 문서에서 사용되는 마이크로 유체 장치를 생산 SQZ 생명 공학 회사의 주주입니다.
Acknowledgments
우리는 실험 설계와 데이터 분석에 도움이 논의 T. Shatova 감사합니다. G. 파라의 지원과 전문 지식, 기술의 매사 추세 츠 공과 대학에서 코흐 연구소의 핵심 유동 세포 계측법 및 마이크로 기술 연구소의 직원의 인사에 대해 감사의 말을 전한다. 이 작품은 건강 보조금 RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351의 국립 연구소에 의해 지원되고, 부분적으로 국립 암 연구소 암 센터 지원 (코어)에 의해 P30-CA14051 및 MPP-09Call-랭거-60을 부여했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Device Holder & Plastic reservoir | SQZ Biotechnologies | Holder | |
| LSRFortessa Analyzer | Becton Dickinson | N/A | Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities |
| Microfluidic device | SQZ Biotechnologies | Cell Squeeze | |
| O-Rings | McMaster | 9452K311 | |
| Pressure system to operate device | SQZ Biotechnologies | Pressure System | |
| Tweezers | |||
| Ultrasound bath |
References
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