Summary
細胞の急速な機械的な変形は高分子およびナノ物質の細胞内送達のための有望な、ベクトルフリー法として浮上している。このプロトコルは、幅広いアプリケーションのためのシステムを使用する方法の詳細な手順を提供しています。
Abstract
細胞の急速な機械的な変形は高分子およびナノ物質の細胞内送達のための有望な、ベクトルフリー法として浮上している。この技術は、以前は困難な用途に対処する電位を示した;を含む一次免疫細胞、細胞の再プログラミング、カーボンナノチューブ、量子ドット送達への送達。このベクターを含まないマイクロ流体プラットフォームは、ターゲット材料のサイトゾル送達を容易にするために、細胞膜の機械的破壊に依存している。ここで、我々は、デバイス組み立て、細胞調製物、およびシステム動作を含むこれらのマイクロ流体デバイスのための使用の詳細な方法を記載している。このアプローチは、送達装置タイプ、以前に報告されていないアプリケーションの動作条件の簡単な最適化を必要とする。このシステムは、特殊な緩衝剤または化学修飾/コンジュゲーション工程を必要としないように提供される命令は、ほとんどの細胞型および送達物質に一般化される。この作品も提供Sデバイスの性能を向上させ、目詰まり、低配信効率、および細胞の生存率に関連する潜在的な問題をトラブルシュートする方法に関する推奨事項。
Introduction
細胞の細胞質への巨大分子の送達は、治療および研究用途における重要なステップである。タンパク質送達は、臨床検査室3と4の両方の設定で細胞機能に影響を与える有望な手段であるが、ナノ粒子媒介送達は、例えば、遺伝子治療の1,2のポテンシャルを示している。そのような小分子薬物、量子ドット、金ナノ粒子などの他の材料は、5,6癌治療からの細胞内標識7,8、および9を追跡単一分子までの範囲の用途において重要である。
細胞膜は、巨大分子の大部分は不透過性である。多くの既存の技術が膜破壊やエンドサイトーシスの配信を容易にするために、ポリマーナノ粒子10,11、リポソーム12、または化学修飾13を使用しています。これらの方法では、送達効率および細胞生存率は、多くの場合、目の構造に依存する電子標的分子および細胞型。これらの方法は、核酸のような構造的に均一な材料の配達時に効率的になりますが、多くの場合、そのようなタンパク質14,15ナノ材料7など、より構造的に多様な材料の配信のために病気に適している。さらに、これらの方法のほとんどはに依存しているエンドソーム破壊メカニズムは、したがって、小胞構造16に捕捉された多くの素材を残し、多くの場合、非効率的である。最後に、多くの場合、確立された細胞株を使用するために開発されている方法は、一次細胞にうまく変換されません。
例えば、エレクトロポレーション17,18および19ソノポレーションのような膜ポレーション法は、いくつかの用途において魅力的な代替物であるが、それらは、低い細胞生存率を引き起こすことが知られており、標的デリバリー材料の電荷によって制限され得る。
細胞の急速な機械的変形、納品までのマイクロ流体アプローチは、最近になっていますdemonstr細胞の再プログラミング20とナノマテリアルの配信21のコンテキストで現在の技術に比べてその利点をated。この方法は、周囲の緩衝液中に存在する物質のサイトゾル送達を促進する細胞膜oを機械的な破壊に依存している。システムが以前に挑戦的細胞型において潜在的に可能にする（ 例えば、一次免疫細胞および幹細胞）を実証し、物質（ 例えば 、抗体およびカーボンナノチューブ）している。ここで、標的巨大分子の細胞内送達のためにこれらのデバイスを使用するための一般的な手順を説明する。しかし、それは以前に報告されていないアプリケーションのために、私たちの以前に報告された設計指針20で詳述するように1が、条件の簡単な最適化を実施することをお勧めします。手順は、ほとんどの細胞型および送達物質に一般化される。今日までに、システムは、RNA、DNA、金ナノ粒子、量子ドット、カーボンナノチューブ、タンパク質の送達のために首尾よく使用されているS、およびデキストランポリマー20,21。
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Protocol
1。ストレージ
- 70％エタノール中貯水池、ホルダー、Oリングやマイクロ流体デバイスに保管してください。ほこりや外部粒子による蒸発や汚染を防止するための蓋を持っているコンテナ（ 例えば瓶やビーカー）を使用します。 （3）第三の内の1つの容器（1）と、第2の容器内のリザーバとO-リング（2）と、ホルダー内のデバイスを置く。
注：ストレージのための70％エタノールの使用は、無菌性を維持することである。ソリューションのコンポーネントのみがエタノールと水（ すなわち無変性剤）がある場合は、すべてのシステム·コンポーネントは、完全に互換性がなければならず、時間の経過とともに低下することはありません。
- 実験にわたって交差汚染を防止し、目詰まりを起こすことができ、望ましくない粒子の存在を最小にするために、各使用前に、エタノール中の溶液の容器（2）と（3）を交換してください。
2。実験の準備
- foの超音波浴に置き容器（2）及び（3）各使用前にR 5〜10分。これは、前の実験から任意の汚染粒子を除去するのに役立ちます。
- 70％エタノール溶液でバイオセーフティーキャビネット中できれいなワークスペース。
- 生物学的安全キャビネット内に置く前に、70％エタノール溶液ですべての材料（3容器、及びピンセット）を噴霧する。
3。アセンブリ
- 作業領域に2〜3の低リントワイプ上下セット。
- ピンセットでそのコンテナからプラスチック製のリザーバーを取り外し、内面からのエタノール溶液の蒸発を促進するためにワイプ上に設定してください。穏やかに表面上のリザーバをタップまたはエタノール溶液の除去を容易にするために、それらを介して空気を吹き込む。
- 貯水池上での適切なスロットにOリングを挿入します。
- それぞれの容器からホルダーとチップを取り外し、エタノールを蒸発させる（〜1〜2分）。
- ホルダーに必要なチップフェイスアップ（最大すなわちアクセスホール）を配置するためにピンセットを使用してください。ホルダーを上げる必ずチップをホルダーに平らに置かれていることを確認し、必要に応じてピンセットで調整するeyelevelにチップを搭載した。重要：デバイスがそのホルダ内に正しくフィットしない場合、それはその後の工程中に破損する危険性がある。
- 次に、そっとホルダーに貯水池を置き、クリップでそれらを合わせます。 Oリングは、このプロセスの間に、そのスロットから落ちないように注意してください。
- 彼らは、カチッと音がするまで静かに貯水池を下に押します。貯水池の両側は、セキュアチップが正しい位置にあるように見えるということであることを確認してください。
4。細胞調製
- 接着細胞（プライマリまたは確立された行）の場合：1〜2日前に、実験にプレート細胞彼らは実験日には80％以上コンフルエントないようにする。
- （PBSまたは関連するメディアに）懸濁液中の細胞を置き、1.0×10 6個/ ml 7 CEL 10 X 1.0へのオペレーティング濃度を目指すlsの個/ ml。注：我々は、セル濃度に配信性能に大きな変化は確認されていません。
- 実験に必要な物質濃度を得るために、別のチューブに細胞や配送希望の材料を混ぜる。重要：記載の送達方法は、送達を容易にするために、拡散に依存しているため、より高い物質の濃度がより高い送達をもたらす。可能な場合は、最初の試験のために必要な材料の1μMのソリューションを使用することをお勧めします。必要に応じて、この濃度は、将来の実験でダウン滴定することができる。このデバイスに使用される最低報告された濃度は、10 nMで21です。
5。操作
- ピペットリザーバ（現在の設計は、最大150μlの容量を有している）への細胞および送達物質との混合物。注：ほとんどのデバイスの設計は、そのためのチャネルを通る流れの方向は重要ではありません、完全に可逆的である。サンプルは、2つのリザーバのいずれかにロードされてもよい。 満たされたタンクに圧力チューブを取り付け、（指のタイトが十分であることが多い）適切なシールを確保するために、ナットを締めます。
- レギュレータ上の所望のレベルに圧力を調整します。これは、細胞が装置を通って移動する速度を制御する。ボタンが押されるまで、セルの流れが開始されないことに注意してください。
注：前作では、窒素または圧縮空気をキャリアガスとしても同様に取り組んできました。
- 目の高さにデバイスを高め、リザーバ内の液体が簡単に見えるようにそれを向けます。注：貯水池が空になる前にシステムを遮断する液柱を追跡します。
- リザーバを加圧すると、セルの流れを開始するためにボタンを押してください。
- 液面がリザーバの底部から約2mmである場合には、速やかに流れを停止させる0 psiまでレギュレータを向ける。重要：リザーバが空になる前に、1つの流れを停止しなかった場合、一方はcollectioから試料を排出するリスクn個の貯水池。また、流体カラム（ 例えば 3倍遅い）かなりのペースで移動していない、又は実質的にその初期流量に対して鈍化していることに注意した場合、車載器は、おそらく詰まると交換する必要がある。詰まったデバイスを動作させると、より高い細胞死につながることができます。
- 適切なリザーバから処理された細胞を収集し、必要なコレクションチューブ/プレートに配置します。重要：porated細胞は最大10分20のための材料を取り込みしていきますように、この段階で任意のバッファに採取した細胞を希釈しないでください。このウィンドウが経過した後、所望の培地/緩衝液で細胞を希釈する。
- 必要に応じて5.7 - より多くの処理された細胞を収集したり、代わりの実験条件を試してみてくださいするには、手順5.1を繰り返します。チップは可逆的であることを思い出して、そのための試料は、リザーバーのどちらかに取り付けることができます。彼らが目詰まりした場合、必要に応じてチップを交換してください。詰まったデバイスを廃棄します。
6。解体
- （セクション1で詳述）適切な貯蔵容器内の各部品を配置します。
- 廃棄のために別の容器に使用されるチップを置きます。
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Representative Results
図1は、微小流体送達システムの概略的記述を含んでいる。 図2a〜図bは蛍光共役3 kDaのデキストラン20の存在下で、異なるデバイスの設計でHeLa細胞を処理することから、典型的な結果を示す。手順が正しく実行された場合、システム性能は、デバイスタイプと動作速度に敏感であろう。そのため、人はより複雑な実験に進む前に、特定のアプリケーションにこれらの条件を最適化する必要があります。同図に示す運転条件の範囲において、細胞生存率は、しかし、一つは次善の配信パラメータ（ 例えば、不適切なチップタイプ）を30％未満の生存率につながる可能性があることに注意する必要があり、80％を超えたまま。このように生存率および送達効率は、以前に報告されていない細胞型を同時に最適化する必要があります。デバイス設計は、標的細胞型に不適切な場合、人は配達より高いCの範囲の結果を見るエル死（ 例えば 、10％の生存率）。実験条件は、例えば、細胞表面に結合した標的物質な写真であった場合は、一方が表面結合信号として正確に送達を測定することができない場合があり、細胞質の信号をマスクすることができる。
図面図2c-dは 、生細胞集団内の送達効率を測定するための我々の好ましい方法を示す。 図2cは 、制御ケースは細胞が少なくとも同じ長ケースとして扱わための送達物質に曝露されるように、すべての表面結合及びエンドサイトーシスの効果を反映することを意味する。送達された細胞集団は、コントロール集団の1〜5％のみがその領域内になるように陰影領域として定義される。前作は、このアプローチでは配信がエンドサイトーシス20によって仲介されていないことを確立していることに注意してください。納入例で観察されたダブルピーク分布は、必ずしもシステムの特徴ではない、我々hとAVEは、さまざまな実験条件のためのより少ない均一な分布を観察した。
図1。のS システム全体のchematicおよびマイクロ流体デバイスへのインタフェース。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。 HeLa細胞との代表的な結果20。A）配信の効率化とカスケードブルー共役3 kDaのデキストラン（0.2 mg / mLの）の存在下で3つの異なるデバイス設計により処理したHeLa細胞のB）の細胞生存率。これらの実験において、細胞のolution 3％ウシ胎児血清および1％のプルロニックF68を含有するPBS中でmL当たり10 6個の細胞の濃度であった。生存率は、死細胞のヨウ化プロピジウム染色により測定した、配信結果が生細胞のみのために示されている。全てのデータ点は3回実行され、エラーバーは、2のSDを表した。c）の HeLa細胞をデバイス処理した場合と時間の少なくとも同量の青の共役3 kDaのデキストランをカスケードに暴露した実験対照のための代表的なヒストグラム。 d）の細胞は、送達を容易にする装置を通過した場合に対応する。ヒストグラムの陰影のない領域にある生きた細胞集団の一部は「配信」の人口と定義されます。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
記載の実験方法（チップ設計及び動作速度以外、すなわち因子）の特定の局面では、システムが適用される細胞タイプおよび送達材料に応じて最適化される必要があり得る。アドレスに実験を設計する際に考慮すべき最も一般的な要因のいくつかを以下の考察。
蛍光標識された化合物のための送出信号を改善するためには、バックグラウンド蛍光の供給源に対処する必要がある。表面結合及びエンドサイトーシスは、例えば、培養物またはさらなる処理の前に余分な材料を除去するために細胞送達後5〜10分間洗浄することによって対処することができる。洗浄工程を差し控えることを選択する場合には、周囲の溶液中の標的物質の濃度を低下させるために、所望の媒体中で5〜10倍に処理した細胞を希釈し、従って、エンドサイトーシス率を低減することが最善であろう。いくつかの場合において、例えば、タンパク質送達のために、人はそれが必要な能動的セルsurfaをブロックするかもしれないCEの（ 例えば、非標識ウシ血清アルブミンを使用して）送達物質の非特異的結合を最小限に抑えること。未処理の場合の蛍光強度は、フローサイトメトリーによって測定されるように、エンドサイトーシス制御つ以上の十年以上低い場合には、所与の用途においては、次いで、結合/エンドサイトーシスが問題になることがあり、表面。バックグラウンド信号に問題がデリバリー材料の直接蛍光検出のためにのみ関連していることに注意してくださいエンドサイトーシスまたは表面に結合した物質は、多くの場合、非アクティブであるように、機能的アッセイ（ 例えば 、細胞のリプログラミング）は、通常、影響を受けません。
処理後の細胞の生存率を向上させるためには、出産後の処理の量を最小限に抑える必要がある。それは1が過剰な遠心分離を回避または配達が完了した後に、インキュベーター5〜10分で、希望のメディアにステップと転送細胞を洗浄することをお勧めします。接着性の株では、細胞は、しばしば完全に接着され、治療後24時間以内に割る。議論前のようにiously 20、我々は、この技術の使用によって任意の長期の副作用を観察していない。
この送達システムにおいて使用されるマイクロ流体デバイスは、経時的に目詰まりを起こしやすい。それは、デバイス上の最も狭い機能ですとして下駄は、多くの場合、くびれの形成。目詰まりが損傷を受けた細胞によって、あるいは環境汚染物質によって引き起こされる場合があります。後者の効果はデバイス（ 例えばよく維持バイオセーフティキャビネット）を動作させるために、清潔でほこりのない環境を確保することによって最小限に抑えることができます。細胞株に関しては、得られた懸濁液中の細胞デブリの存在を最小にするように、送達前に1〜2日の細胞を継代することをお勧めします。デバイスを動作させる場合、1は、リザーバ内の流体の体積流量に留意する必要があります。流量がその初期速度の下で第三に低下した場合、デバイスは、過剰な細胞死を引き起こすことができ、交換、又は流れの方向を逆にされるべきである。潜在的な詰まりの問題もmitigすることができます40μmのセルストレーナーメッシュを通して細胞懸濁液を通過させることによってated。このプロセスは、それによって、チップの広い、低流量セクションで形成されるの潜在的な目詰まりを防止する単一細胞懸濁液を確実にする。
異なる送達材料のための実験を設計する場合、一方はターゲット材料の大きさ及びその濃度を考慮しなければならない。この技術は破壊された細胞膜を横切る物質の受動拡散に依存しているように、モル濃度勾配および送達物質の流体力学的半径は、物質移動速度を支配する - の膜破壊は、材料を収容するのに十分な大きさであると仮定する。それは彼らの小さいカウンター部に対して大きなターゲット材料の高モル濃度（ 例えば 、1μM）を使用することが賢明である。技術は、量子ドット21の送達の場合に10 nMの程度の低い濃度で有効な送達を実証した。さらに、この技術は、nはOT材料サイズと拡散率との関連を除いてターゲット送出素材の性質によって限定されると考えられて（ すなわち 、低拡散率材料が低く、配信効率と混乱のサイズよりも大きい材料はおそらく、細胞質を入力することはできませんがあります）。
細胞の再プログラミングおよび量子ドット·デリバリーの研究は、エレクトロポレーションによる細胞スクイーズアプローチの相対的な強さを説明しました。これら二つの手法で膜破壊メカニズムの現在の理解に基づいて、セル圧搾、タンパク質、小分子、及びナノ材料20,21を含む用途において重要な利点を有するように思われる。 （非常に上記の材料と比較して充電される）核酸を含むアプリケーションにおける2つの方法の間のコントラストが不明である。
納品まで、このマイクロ流体アプローチは、細胞膜の機械的破壊に依存しています細胞への物質の受動拡散を促進し、細胞型20の範囲に適用可能であることが示されている。このシステムは、ほぼすべての細胞型にほぼすべての材料の細胞質ゾルデリバリーのための主要な適切にことである。我々は、システムの利点は、最も伝統的に（ 例えば、免疫および幹細胞）、一次細胞をトランスフェクトすることが困難で、従来困難な材料（ 例えば 、タンパク質、量子ドット、カーボンナノチューブ、およびRNA）を含む場合に顕著であると考えている。免疫および幹細胞の用途において、上述の電位は、これらの細胞型に対処する従来の送達方法の欠点によって強調される。ただし、システムはこれらのアプリケーションは、核への送達を必要とするプラスミドベクターによって遺伝子送達を容易にするために更なる改善を必要とし得る。要約すると、我々は、納品まで、マイクロ流体変形のアプローチは、潜在的に細胞内送達に多くの既存の課題を解決できると信じています。 syste化学ベクトルや電界からMの独立は、研究の範囲に、その堅牢なアプリケーションを可能にします。ここに提供された指示は、独立して、そのようなシステムを運用し、その研究目的のためにそれを適応させるために利害関係の研究者を有効にする必要があります。
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Disclosures
著者アーモンSharei、ロバート·ランガー、及びKlavs F·ジェンセンは、この記事で使用するマイクロ流体デバイスを製造SQZバイオテクノロジー会社の株主である。
Acknowledgments
我々は、実験デザインとデータ分析の有用な議論のために、T. Shatovaに感謝します。 G·パラディの支援と専門知識は、マサチューセッツ工科大学のコッホ研究所のコアフローサイトメトリー、およびマイクロシステム技術研究所のスタッフの人が感謝して承諾されます。この作品は、健康補助金RC1 EB011187-02、DE013023、DE016516、EB000351の国立研究所によってサポートされ、部分的に国立がん研究所がんセンターサポート（コア）で、P30-CA14051およびMPP-09Call-ランガー-60を付与した。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Device Holder & Plastic reservoir | SQZ Biotechnologies | Holder | |
| LSRFortessa Analyzer | Becton Dickinson | N/A | Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities |
| Microfluidic device | SQZ Biotechnologies | Cell Squeeze | |
| O-Rings | McMaster | 9452K311 | |
| Pressure system to operate device | SQZ Biotechnologies | Pressure System | |
| Tweezers | |||
| Ultrasound bath |
References
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