Zellzusammendrücken als Robust, Mikrofluidik Intrazelluläre Delivery Platform

Summary

Schnelle mechanische Verformung von Zellen als vielversprechender, Vektor-freie Methode für intrazellulären Transport von Makromolekülen und Nanomaterialien entstanden. Dieses Protokoll bietet detaillierte Schritte auf, wie das System für eine breite Palette von Anwendungen.

Abstract

Schnelle mechanische Verformung von Zellen als vielversprechender, Vektor-freie Methode für intrazellulären Transport von Makromolekülen und Nanomaterialien entstanden. Diese Technologie hat bei der Bewältigung zuvor anspruchsvolle Anwendungen Potenzial gezeigt, einschließlich der Lieferung in primären Immunzellen, Zell Umprogrammierung, Kohlenstoff-Nanoröhrchen und Quantenpunkt-Lieferung. Dieser vektorfreien mikrofluidischen Plattform stützt sich auf mechanische Zerstörung der Zellmembran zu cytosolische Abgabe des Zielmaterials zu erleichtern. Hier beschreiben wir die detaillierte Verfahren für die Verwendung dieser Mikrofluidvorrichtungen einschließlich Vorrichtungsanordnung, Zellpräparation und den Systembetrieb. Dieser Liefer Ansatz erfordert eine kurze Optimierung von Gerätetyp und Betriebsbedingungen für die zuvor gemeldet Anwendungen. Die Anweisungen gelten verallgemeinerbar zu den meisten Zelltypen und Liefer Materialien wie dieses System nicht spezialisierten Puffer oder chemische Modifikation / Konjugation Schritte erfordern. Diese Arbeiten stellen auchs Empfehlungen, wie die Geräteleistung zu verbessern und störungs schießen mögliche Probleme zu Verstopfung, geringe Liefer Effizienz und die Lebensfähigkeit der Zellen zusammen.

Introduction

Freisetzung von Makromolekülen in die Zelle Zytoplasma ist ein kritischer Schritt in der therapeutischen und Forschungsanwendungen. Nanopartikel-vermittelte Abgabe, zum Beispiel, hat Potenzial in der Gentherapie ^1,2 gezeigt, während Protein-Lieferung ist ein vielversprechendes Mittel beeinflussen die Zellfunktion sowohl in klinischen und Labor ^{3 4} Einstellungen. Andere Materialien, wie zum Beispiel Medikamente aus kleinen Molekülen, Quantenpunkte oder Gold-Nanopartikel, sind von Interesse in Anwendungen von Krebstherapeutika ^5,6 bis ^7,8 intrazelluläre Markierung und ^{Einzelmolekül-Tracking-9.}

Die Zellmembran weitgehend undurchlässig für Makromoleküle. Viele existierende Techniken verwenden, polymere Nanopartikel ^10,11, Liposomen ¹² oder chemische Modifikationen ¹³ bis Membran Störung oder endozytotische Lieferung zu erleichtern. Bei diesen Verfahren sind die Abgabeeffizienz und die Lebensfähigkeit der Zellen oft abhängig von der Struktur der the Zielmolekül und der Zelltyp. Diese Verfahren können bei der Lieferung von strukturell einheitlichen Materialien wie Nukleinsäuren effizient sein, aber für die Lieferung von mehr strukturell unterschiedlichen Materialien, wie Proteinen und ^14,15 Nano ⁷ sind oft ungeeignet. Darüber hinaus ist der Mechanismus, der Endosomen Störung meisten dieser Verfahren beruhen auf häufig ineffizient vor, sodass viel Material in Vesikel-Strukturen ¹⁶ gefangen. Schließlich, Methoden, die oft für die Verwendung mit etablierten Zelllinien entwickelt, sind nicht gut zu übersetzen, um Primärzellen.

Membranporenbildung Methoden wie Elektroporation ^17,18 Sonoporation und ^19, sind eine attraktive Alternative in einigen Anwendungen, jedoch sind sie bekannt, die Lebensfähigkeit der Zellen gering verursachen und kann durch die Ladung der Ziel Lieferung Material begrenzt werden.

Schnelle mechanische Verformung von Zellen, einer mikrofluidischen Ansatz zur Lieferung, hat vor kurzem, EinzelhandelATED seine Vorteile gegenüber aktuellen Techniken im Rahmen der Neuprogrammierung Zelle ²⁰ und ²¹ Nanomaterial Lieferung. Dieses Verfahren beruht auf mechanischen Störung o der Zellmembran zu cytosolische Abgabe von in der Umgebung vorhandenen Materialien Puffer erleichtern. Das System hat gezeigt, wodurch Potenzial in zuvor Herausforderung Zelltypen (zB primäre Immunzellen und Stammzellen) und Materialien (zB Antikörper und Kohlenstoffnanoröhren). Hierbei wird die allgemeine Vorgehensweise, um diese Geräte für intrazellulären Transport von Makromolekülen Ziel verwenden beschrieben. Das Verfahren ist verallgemeinerbar zu den meisten Zelltypen und Liefer Materialien, jedoch ist es empfehlenswert, dass man führen eine kurze Optimierung der Bedingungen, wie in unserem zuvor berichtet, Design-Richtlinien ²⁰ beschrieben, für alle bisher nicht gemeldet Anwendungen. Bisher hat das System erfolgreich für die Lieferung von RNA-, DNA-, Gold-Nanopartikel, Quantenpunkte, Kohlenstoff-Nanoröhren, Protein verwendets und Dextran-Polymere ^20,21.

Protocol

1. Lagerung

1. Lagern Sie die Behälter, Halter, O-Ringe und mikrofluidischen Systemen in 70% Ethanol. Verwenden Sie einen Behälter (zB Glas oder Becher), die einen Deckel, um Verdunstung und Kontamination durch Staub oder Partikel zu verhindern außen hat. Zeigen die Geräte in einem Behälter (1), Vorratsbehälter und O-Ringe in einem zweiten Behälter (2), in dem dritten Halter (3).

Anmerkung: Die Verwendung von 70% Ethanol für die Lagerung ist, um die Sterilität aufrechtzuerhalten. Wenn die einzigen Komponenten der Lösung sind Ethanol und Wasser (dh keine Denaturierung Agenten), sollten alle System-Komponenten kompatibel sein und wird nicht im Laufe der Zeit verschlechtern.

2. (3) vor jedem Gebrauch, um eine Kreuzkontamination zu verhindern und über Experimente minimieren die Anwesenheit von unerwünschten Partikeln, die dazu führen können verstopfen ändern Ethanol-Lösung in Behältern (2) und.

2. Experiment Vorbereitung

1. Ort Behälter (2) und (3) im Ultraschallbad for 5-10 Minuten vor jedem Gebrauch. Dies hilft, entfernen Sie alle Schmutzpartikel aus früheren Experimenten.
2. Saubere Arbeitsbereich in Biosicherheitswerkbank mit 70% Ethanol-Lösung.
3. Spray alle Materialien (3 Behälter und Pinzette) mit einer 70% igen Ethanollösung, bevor Sie sie in der biologischen Sicherheitsschrank.

3. Montage

1. Stellen Sie nach unten 2-3 fusselarm Tücher in den Arbeitsbereich.
2. Entfernen Sie die Plastikbehältern aus ihrem Behälter mit einer Pinzette und legen Sie sie auf den Tüchern um die Verdunstung von Ethanol-Lösung von inneren Oberflächen erleichtern. Klopfen Sie die Behälter auf der Oberfläche oder blasen Luft durch sie hindurch, um das Entfernen der Ethanollösung zu erleichtern.
3. Legen Sie die O-Ringe in ihre entsprechenden Steckplatz auf der Reservoirs.
4. Entfernen Sie den Halter und Chips von den jeweiligen Behältern werden und Ethanol verdampfen (~ 1-2 min).
5. Pinzette, um die gewünschte Spanfläche-up (dh Zugangslöcher oben) in den Halter zu platzieren. Heben Sie den Haltermit der Chip auf Augenhöhe, um sicherzustellen, dass der Chip flach liegt in der Halterung und stellen Sie gegebenenfalls mit der Pinzette. WICHTIG: Wenn das Gerät nicht korrekt in der Halterung passen, besteht die Gefahr, dass es während der nachfolgenden Schritte zu brechen.
6. Weiter ist, setzen die Stauseen auf der Halterung und richten Sie sie mit den Clips. Achten Sie darauf, dass die O-Ringe nicht aus ihren Schlitzen während dieses Prozesses fallen.
7. Drücken Sie vorsichtig auf den Reservoirs, bis sie einrastet. Damit beide Seiten der Behälter sicher sind und dass der Chip wird in der richtigen Position befinden.

4. Zellpräparation

1. Für adhärente Zellen (primäre oder etablierte Linien): Platte-Zellen 1-2 Tage vor dem Experiment, dass sie nicht mehr als 80% konfluent auf dem Tag des Experiments sind.
2. Platzieren Zellen in Suspension (in PBS oder relevanten Medien) und Ziel für eine Betriebskonzentration von 1,0 x 10 ⁶ Zellen / ml bis 1,0 x 10 ⁷ cells / ml. HINWEIS: Wir haben keine signifikanten Änderungen in der Lieferleistung durch Zellkonzentration beobachtet.
3. Mischen Zellen und die gewünschte Freisetzungsmaterial in einem separaten Röhrchen, um die gewünschte Stoffkonzentration für den Versuch zu erhalten. WICHTIG: Durch die beschriebene Lieferung Methode beruht auf Diffusion, die Lieferung zu erleichtern, wird eine höhere Materialkonzentration höhere Liefer ergeben. Wenn möglich, empfiehlt es sich, eine 1 uM Lösung des gewünschten Material für erste Versuche zu verwenden. Diese Konzentration kann dann nach unten in zukünftigen Experimenten nach Bedarf titriert werden. Die niedrigste Konzentration berichtet, mit diesem Gerät verwendet wird, ist 10 nM ^21.

5. Betrieb

1. Pipette Mischung von Zellen und Lieferung Material in einem Behälter (aktuelle Design hat eine maximale Kapazität 150 ul). HINWEIS: Die meisten Gerät Entwürfe sind vollständig reversibel daher Strömungsrichtung durch die Kanäle spielt keine Rolle. Proben können in einem der beiden Behälter geladen werden. Bringen Druckschlauch auf die gefüllte Behälter und ziehen Sie die Mutter um die richtige Dichtung (handfest ist oft ausreichend) zu gewährleisten.
2. Stellen Sie den Druck auf das gewünschte Niveau auf dem Regler. Dies steuert die Geschwindigkeit, mit der Zellen durch die Vorrichtung zu reisen. Beachten Sie, dass Zellstrom nicht beginnen, bis die Taste gedrückt wird.

HINWEIS: In früheren Arbeiten wurden Stickstoff oder Druckluft ebenso gut als Trägergas gearbeitet.

4. Heben Gerät auf Augenhöhe und so ausrichten, dass die Flüssigkeit in dem Behälter gut sichtbar ist. HINWEIS: Verfolgen Sie die Flüssigkeitssäule zum Abschalten des Systems, bevor der Behälter geleert.
5. Drücken Sie die Taste, um das Reservoir unter Druck und beginnen Zelle fließen.
6. Wenn der Flüssigkeitspegel beträgt ca. 2 mm vom Boden des Behälters, schnell drehen den Regler auf 0 psi to Fluss zu stoppen. WICHTIG: Wenn einer ausfällt, um den Fluss zu stoppen, bevor der Behälter geleert wird, riskiert ein Auswerfen der Probe aus dem collection-Reservoir. Beachten Sie auch, dass, wenn die Flüssigkeitssäule bewegt sich nicht in einer nennenswerten Geschwindigkeit oder im Wesentlichen gegenüber ihrer Ausgangsstrom (Beispiel 3x langsamer) verlangsamt wird, wird das montierte Gerät wahrscheinlich verstopft und muss ausgetauscht werden. Der Betrieb eines verstopften Gerät kann zu höheren Zelltod führen.
7. Sammeln Sie die behandelten Zellen aus dem entsprechenden Behälter und legen Sie sie in der gewünschten Sammelrohr / Platte. WICHTIG: die gesammelten Zellen in beliebigen Puffern verdünnen zu diesem Zeitpunkt nicht, wie die porated Zellen wird weiterhin Material für bis zu 10 min ²⁰ Aufnahme. Nachdem dieses Fenster verstrichen ist, verdünnt, die Zellen in dem gewünschten Medium / Puffer.
8. Um mehr behandelten Zellen sammeln oder versuchen alternative Versuchsbedingungen, wiederholen Sie die Schritte von 5,1 bis 5,7, wie gebraucht. Erinnern, dass die Chips reversibel sind, kann daher Proben entweder Behälter montiert werden. Achten Sie darauf, Chips austauschen, wie gebraucht, wenn sie verstopfen. Entsorgen verstopft Geräte.

6. Demontage

1. Legen Sie jedes Teil in der entsprechenden Vorratsbehälter (in Abschnitt 1 dargestellt).
2. Zeigen verwendeten Chips in einem separaten Behälter zur Entsorgung bringen.

Representative Results

Fig. 1 enthält eine schematische beschreibende des mikrofluidischen Zufuhrsystem. Figuren 2a-b veranschaulichen typische Ergebnisse der Behandlung von HeLa-Zellen mit unterschiedlichen Geräteausführungen in Gegenwart von fluoreszenz konjugierten 3 ^{kDa-Dextran-20.} Wenn das Verfahren korrekt befolgt, wird die Systemleistung empfindlich auf Gerätetyp und Betriebsgeschwindigkeit. Daher sollte man diese Bedingungen für eine bestimmte Anwendung, bevor zu anspruchsvollen Versuchen zu optimieren. Im Bereich der in der Figur dargestellten Betriebsbedingungen bleibt die Lebensfähigkeit der Zellen über 80%, jedoch muss man beachten, dass suboptimale Liefer Parameter (z. B. unangebracht Chip-Typ) konnte Bewohnbarkeit unter 30% führen. So Lebensfähigkeit und Lieferung Effizienz müssen gleichzeitig für jede zuvor unbekannten Zelltyp optimiert werden. Wenn ein Gerät Design ungeeignet für die Zielzelltyp ist, wird man Ergebnisse, die von keinem Liefer hohe c zu sehenell Tod (zB 10% Lebensfähigkeit). Wenn die Versuchsbedingungen unangemessen wäre, beispielsweise die an die Zelloberfläche gebundenen Zielmaterial, kann man nicht in der Lage, die Lieferung genau zu messen, wie die Oberflächenbindungssignal die cytoplasmatische Signal Maske.

Figuren 2c-d veranschaulichen unsere bevorzugte Methode für die Messung Lieferung Effizienz innerhalb der Live-Zellpopulation. Der Steuerfall in 2c sollte alle Oberflächenbindung und endozytotische Wirkungen reflektieren als die Zellen in dem Freisetzungsmaterial mindestens so lang wie der behandelten Fälle ausgesetzt. Die gelieferte Zellpopulation als der nicht-schattierten Region, so dass nur 1-5% der Kontrollgruppe innerhalb dieses Bereichs fällt, definiert ist. Beachten Sie, dass die bisherigen Untersuchungen haben ergeben, dass die Lieferung in diesem Ansatz nicht durch Endozytose ²⁰ vermittelt. Die Doppelspitzenverteilung in der gelieferten Beispiel beobachtet nicht unbedingt Eigenschaft des Systems, wie wir have beobachtet mehr und weniger gleichmäßige Verteilung für verschiedene Versuchsbedingungen.

Abbildung 1. S Chematic des gesamten Systems und seiner Schnittstelle zu den mikrofluidischen Bauteilen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

2. Repräsentative Ergebnisse mit HeLa-Zellen ^20. A) Liefereffizienz und b) Zelllebensfähigkeit von HeLa-Zellen von 3 verschiedenen Geräteausführungen in Gegenwart von Cascade blue konjugierten 3 kDa Dextran (0,2 mg / ml) behandelt. In diesen Experimenten wurde die Zell slösung wurde in einer Konzentration von 10 ⁶ Zellen pro ml in PBS, das 3% fötales Rinderserum und 1% Pluronic F68. Die Lebensfähigkeit wurde durch Propidiumiodid-Färbung von toten Zellen und Liefer Ergebnissen gemessen werden nur lebende Zellen gezeigt. Alle Datenpunkte wurden dreifach ausgeführt und die Fehlerbalken stellen 2 SDs. C) Ein Vertreter Histogramm für eine experimentelle Kontrolle, wo HeLa-Zellen wurden ausgesetzt blau konjugierten 3 kDa Dextran für mindestens die gleiche Menge an Zeit Kaskade als ein Gerät behandelt Fall. d) Der entsprechende Fall, in dem die Zellen durch das Gerät, die Lieferung zu erleichtern geleitet. Der Anteil der Live-Zellpopulation, die in der nicht-schattierten Region des Histogramms wird als "geliefert" Population definiert. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Discussion

Bestimmte Aspekte der beschriebenen experimentellen Verfahren (dh andere als Chip-Design-und Betriebsgeschwindigkeit Faktoren) müssen je nach Zellentyp und Freisetzungsmaterial das System angewendet wird, um optimiert werden. Die Adressen, die folgt einige der häufigsten Faktoren, die bei der Gestaltung Experimente Diskussion.

Um die Liefersignal für fluoreszenzmarkierten Verbindungen zu verbessern, muss man zu den Quellen der Hintergrundfluoreszenz zu adressieren. Oberflächenbindung und Endozytose, z. B. durch Waschen der Zellen 5-10 min nach der Lieferung, um überschüssiges Material vor der Kultur oder der Weiterverarbeitung zu entfernen adressiert werden. Wenn die Wahl auf einen Waschschritt zu verzichten, wäre es am besten, um die behandelten Zellen zu verdünnen, indem 5-10-fach in dem gewünschten Medium, um die Konzentration des Targetmaterials in der umgebenden Lösung zu senken und damit reduzieren endozytotische Raten. In einigen Fällen, zum Beispiel Protein Lieferung, kann man es für notwendig, sich aktiv in die Zelle blockieren surface (z. B. mit unmarkierter Rinderserumalbumin) nicht-spezifische Bindung des zu applizierenden Wirkstoffs zu minimieren. In einer bestimmten Anwendung, wenn die Fluoreszenzintensität der unbehandelten Fall, wie Durchflusszytometrie gemessen, ist über eine Dekade niedriger als die Endozytose Steuer dann Oberflächenbindung / Endozytose kann ein Problem sein. Beachten Sie, dass Probleme mit der Hintergrundsignal sind nur für direkte Fluoreszenz-Detektion der Lieferung Material relevant ist, sind Funktionstests (zB Zell Umprogrammierung) in der Regel nicht betroffen, wie Endozytose oder Oberflächenmaterial gebunden sind oft inaktiv.

Um die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Behandlung zu verbessern, muss man die Menge der Verarbeitung nach der Lieferung zu minimieren. Es wird empfohlen, dass man vermeiden übermäßige Zentrifugation oder Waschschritte und Transferzellen in ihre gewünschte Medium in einem Inkubator 5-10 Minuten nach der Geburt abgeschlossen ist. Bei adhärenten Linien werden die Zellen oft vollflächig verklebt und Teilen innerhalb von 24 Stunden nach der Behandlung. Wie besprochen zurückiously ^20, haben wir keine Langzeitnebenwirkungen, die aus der Verwendung dieser Technik beobachtet.

Die Mikrofluidik-Vorrichtungen in diesem Abgabesystem verwendet werden, sind anfällig für Verstopfungen im Laufe der Zeit. Verstopfungen bilden oft an der Einschnürung, wie es der schmalsten Funktion des Geräts. Verstopfung kann durch beschädigte Zellen oder durch Umweltschadstoffe verursacht werden. Deren Wirkung kann durch Sicherstellung einer sauberen, staubfreien Umgebung für den Betrieb der Geräte (z. B. ein gepflegtes Biosicherheitswerk) minimiert werden. Für Zelllinien, empfehlen wir Passagierung Zellen 1-2 Tage vor der Auslieferung so das Vorhandensein von Zelltrümmern in der erhaltenen Suspension zu minimieren. Beim Betrieb des Geräts, einer Erwägung der Volumendurchsatz des Fluids in dem Reservoir sein müssen. Wenn die Strömungsgeschwindigkeit sinkt auf unter ein Drittel des Anfangsgeschwindigkeit kann die Vorrichtung verursacht übermäßige Zelltod und sollte ausgetauscht werden, oder die Strömungsrichtung umgekehrt wird. Mögliche Probleme können auch Verstopfung mitig werdenATED, indem die Zellsuspension durch ein 40 um Zellsieb Mesh. Dieser Prozess stellt eine Einzelzellsuspension damit potenzielle Clogs verhindert die Bildung von in den breiteren, geringe Durchflussrate Abschnitte des Chips.

Bei der Gestaltung von Experimenten für verschiedene Freisetzungsmaterialien, muß man für die Größe des Zielmaterials und dessen Konzentration zu berücksichtigen. Da diese Technologie beruht auf der passiven Diffusion von Material über die Zellmembran gestört wird, wird das molare Konzentrationsgefälle und der hydrodynamische Radius der Freisetzungsmaterial das Massentransferrate regeln - vorausgesetzt, die Membran Störungen groß genug, um das Material aufzunehmen sind. Es ist daher ratsam, hohe molare Konzentrationen (zB 1 uM) von großen Zielmaterialien in Bezug auf ihre kleineren Gegenstücke zu verwenden. Die Technik hat sich als wirksam Lieferung in Konzentrationen so gering wie 10 nm im Fall von Quantenpunktliefer ²¹ gezeigt. Darüber hinaus ist die Technik not gedacht, durch die Art der Ziel Lieferung Material, außer im Rahmen von Material und Größe Diffusionsvermögen beschränkt werden (zB bei niedriger Diffusions Materialien haben niedrigere Liefer Effizienz und Material größer ist als die Größe der Störungen können sich wahrscheinlich nicht in das Zytoplasma).

Studien in Zell Umprogrammierung und Quantenpunkt-Lieferung haben die Stärken der Zelle Quetschen Ansatz in Bezug auf die Elektroporation dargestellt. Basierend auf dem aktuellen Verständnis der Membranzerstörung Mechanismen in diesen beiden Techniken, scheint es, dass Zellen Quetschung hat einen signifikanten Vorteil bei Anwendungen, die Proteine, kleine Moleküle und Nano ^20,21. Der Kontrast zwischen den beiden Verfahren bei Anwendungen, die Nukleinsäuren (die im Vergleich zu den vorgenannten Materialien stark geladen sind), ist unklar.

Mikrofluid-Ansatz beruht auf der Lieferung mechanische Zerstörung der Zellmembran zuerleichtern passive Diffusion von Material in die Zelle und ist gezeigt worden für eine Reihe von Zelltypen ²⁰ zu sein. Das System ist somit im Prinzip angemessen für die cytosolische Lieferung von nahezu allen Materialien zu fast jedem Zelltyp. Wir glauben, dass die Vorteile des Systems sind die meisten in Fällen, die traditionell schwer zu Primärzellen transfizieren (zB Immun-und Stammzellen) und konventionell anspruchsvollen Materialien (zB Proteine, Quantenpunkte, Kohlenstoff-Nanoröhrchen und RNA) ausgeprägt. Die oben genannte Potenzial in Immun-und Stammzell-Applikationen wird durch die Mängel der traditionellen Versandmethoden bei der Behandlung dieser Zelltypen hervorgehoben. Jedoch kann das System eine weitere Verbesserung erforderlich, um Gen-Lieferung von Plasmidvektoren zu erleichtern, wie diese Anwendungen Lieferung an den Zellkern erforderlich. Zusammenfassend glauben wir, die mikrofluidischen Verformung Ansatz zur Lieferung kann potenziell viele bestehende Herausforderungen für die intrazelluläre Lieferadresse. Die system Unabhängigkeit von Vektoren, chemische oder elektrische Felder können die robuste Anwendung auf eine Reihe von Studien. Die hierin bereitgestellten Anweisungen sollten alle interessierten Forschern ermöglichen, ein solches System unabhängig arbeiten und passen sie für ihre Forschungszwecke.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Device Holder & Plastic reservoir	SQZ Biotechnologies	Holder
LSRFortessa Analyzer	Becton Dickinson	N/A	Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities
Microfluidic device	SQZ Biotechnologies	Cell Squeeze
O-Rings	McMaster	9452K311
Pressure system to operate device	SQZ Biotechnologies	Pressure System
Tweezers
Ultrasound bath