Summary
Быстрое механическая деформация клеток стала перспективный, векторные без метода внутриклеточной доставки макромолекул и наноматериалов. Этот протокол содержит подробные шаги, как использовать систему для широкого спектра приложений.
Abstract
Быстрое механическая деформация клеток стала перспективный, векторные без метода внутриклеточной доставки макромолекул и наноматериалов. Эта технология потенциал показано в решении ранее сложных приложений; включая, доставка в первичных иммунных клеток, перепрограммирования клеток, углеродной нанотрубки, и квантовой поставки точка. Этот вектор свободной Микрожидкостных платформа опирается на механическое разрушение клеточной мембраны, чтобы облегчить доставку цитозольного материала мишени. Здесь мы описываем подробную метод использования для этих микрофлюидных устройств, включая, сборки устройства, клеточного препарата, и работы системы. Этот подход доставка требует краткого оптимизацию типа устройства и условий работы для ранее несообщаемого приложений. Приведенные инструкции распространены на большинстве типов клеток и материалов поставки так как эта система не требует специальных буферов или шаги химическая модификация / сопряжения. Эта работа также обеспечитьсек рекомендации о том, как улучшить производительность устройства и без проблем снимать потенциальные проблемы, связанные к засорению, низкой эффективности доставки и жизнеспособности клеток.
Introduction
Доставка макромолекул в цитоплазме клеток является важным шагом в лечебных и исследовательских приложений. Наночастиц опосредованной доставки, например, показал потенциал в генной терапии 1,2, в то время как доставка белок является перспективным средством влияя на клеточную функцию как клинические, так и лабораторные 3 4 настройки. Другие материалы, такие как низкомолекулярных препаратов, квантовых точек, или наночастиц золота, представляют интерес в приложениях, начиная от лечения рака 5,6 к внутриклеточной маркировки 7,8, и одной молекулы отслеживания 9.
Клеточной мембраны в значительной степени непроницаемой для макромолекул. Многие существующие методы используют полимерные наночастицы 10,11, липосомы 12 или химические модификации 13 для облегчения мембраны разрушение или эндоцитозного доставку. В этих методах, жизнеспособность эффективность доставки и клетки часто зависят от структуры гое молекула-мишень и тип клеток. Эти методы могут быть эффективными при доставке структурно однородных материалов, таких как нуклеиновые кислоты, но часто плохо подходит для доставки более структурно различных материалов, таких как белки и наноматериалов 14,15 7. Кроме того, разрушение эндосомы механизм, что большинство из этих методов полагаться на зачастую является неэффективным, следовательно оставляя много материала в ловушке пузырьков структур 16. Наконец, методы, которые часто разработанные для использования с установленными клеточных линий не очень хорошо переводятся в первичных клеток.
Способы мембранной порации, такие как электропорации 17,18 и 19 sonoporation, являются привлекательной альтернативой в некоторых применений, однако они, как известно, вызывает низкий уровень жизнеспособности клеток и может быть ограничено расхода материала мишени доставки.
Быстрое механическая деформация клеток, микрофлюидных подход к поставке, недавно demonstrованные свои преимущества по сравнению с современными методами в контексте перепрограммирования клеток 20 и доставки наноматериалов 21. Этот метод основан на механическое разрушение о клеточной мембране, чтобы облегчить доставку цитозольного материалов, присутствующих в окружающей буфера. Система продемонстрировала позволяя потенциал в ранее вызов типов клеток (например, первичные иммунные клетки и стволовые клетки) и материалы (например, антитела и углеродных нанотрубок). При этом общий порядок, чтобы использовать эти устройства для внутриклеточной доставки целевых макромолекул описывается. Процедура распространены на большинстве типов клеток и материалов доставки, однако, рекомендуется, чтобы один проводить кратко оптимизацию условий, как подробно в наших ранее описанной конструкции принципов 20, для любых ранее незарегистрированных приложений. На сегодняшний день, система была успешно использована для доставки РНК, ДНК, наночастиц золота, квантовых точек, углеродных нанотрубок, белкас, а декстран полимеры 20,21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Хранение
- Храните водохранилищ, держатели, уплотнительные кольца и микрожидкостных устройств в 70% этаноле. Используйте контейнер (например, банку или мензурки), который имеет крышку для предотвращения испарения и загрязнения частицами пыли или за пределами. Размещать устройства в одном контейнере (1), резервуары и уплотнительные кольца во втором контейнере (2), и держатели в третьем (3).
Примечание: Использование 70% этанола для хранения является поддержание стерильности. Если только компоненты решения являются этанол и вода (т.е. без денатурирующие агенты), все компоненты системы должны быть полностью совместимы и не будет со временем ухудшаться.
- Изменение раствор этанола в контейнерах (2) и (3) перед каждым использованием, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение через экспериментов и минимизации присутствия нежелательных частиц, которые могут вызвать засорение.
2. Эксперимент Подготовка
- Место контейнеры (2) и (3) в ультразвуковой ванне FOг 5-10 мин перед каждым использованием. Это помогает удалить любые загрязняющие частицы из предыдущих экспериментов.
- Чистый рабочее пространство в шкафу биобезопасности с 70% раствором этанола.
- Спрей все материалы (3 контейнеры и пинцеты) с 70% раствором этанола до размещения их внутри шкафа биобезопасности.
3. Сборка
- Установите вниз 2-3 низкой вкусненькое салфетки в рабочей зоне.
- Снимите пластиковые резервуары от их контейнер с пинцетом и установить их на салфетки, чтобы облегчить испарение раствора этанола из внутренних поверхностей. Аккуратно нажмите резервуаров на поверхности или поток воздуха через них, чтобы облегчить удаление раствора этанола.
- Вставьте уплотнительные кольца в их соответствующее гнездо водохранилищ.
- Снимите держатель и чипсы из соответствующих контейнеров и позволяют этанол испаряется (~ 1-2 мин).
- Используйте пинцет, чтобы поместить требуемый чип лицевой стороной вверх (то есть отверстия для доступа вверх) в держателе. Поднимите держательс чип для eyelevel чтобы убедиться, что чип лежит на плоской поверхности в держателе и при необходимости отрегулировать с помощью пинцета. ВАЖНО: Если устройство не соответствует должным образом в держатель, существует риск, что она сломается во время последующих шагов.
- Затем осторожно положите резервуаров на держателе и приведения их в соответствие с клипами. Будьте осторожны, чтобы уплотнительные кольца не выпасть из своих пазов во время этого процесса.
- Осторожно надавите на водоемах, пока они не встанут на место. Убедитесь, что обе стороны водохранилищ находятся в безопасности и что чип, кажется, в правильном положении.
4. Подготовка Сотовый
- Для прикрепленных клеток (первичные или установленные линии): Пластина клеток 1-2 дня до начала эксперимента таковы, что они являются не более чем на 80% сливной на день эксперимента.
- Наведите клеток в суспензии (в ФБР или соответствующего средства массовой информации) и стремиться к операционной концентрации 1,0 × 10 6 клеток / мл до 1,0 х 10 7 челLs / мл. ПРИМЕЧАНИЕ: Мы не наблюдается существенных изменений в производительности поставки из-за концентрации клеток.
- Смешайте клетки и желаемой доставки материала в отдельную пробирку для получения желаемой концентрации материала для эксперимента. ВАЖНО: Поскольку описанный способ доставки зависит от диффузии для облегчения доставки, более высокая концентрация материал даст более высокую доставку. Если это возможно, рекомендуется использовать 1 мкМ раствор желаемого материала для начальных испытаний. Эта концентрация может быть титрованию вниз в будущих экспериментов по мере необходимости. Наименьшее отмеченное концентрация использоваться с данным устройством 10 нМ 21.
5. Операция
- Внесите смесь клеток и доставки материала в резервуар (текущий дизайн имеет максимальное 150 мкл потенциала). ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство проектов устройств полностью обратимы поэтому направление потока через каналы не имеет значения. Образцы могут быть загружены в любой из двух коллекторов. Прикрепите трубки давления к заполненное водохранилище и затянуть гайку, чтобы обеспечить надлежащее уплотнение (палец плотно часто бывает достаточно).
- Отрегулируйте давление до нужного уровня на регуляторе. Это контролирует скорость, с которой клетки перемещаются через устройство. Обратите внимание, что поток клеток не запускается пока не будет нажата кнопка.
Примечание: В предыдущей работе, азот или сжатый воздух работали одинаково хорошо в качестве газа-носителя.
- Поднимите устройство на уровень глаз и ориентировать его так, чтобы жидкость в резервуаре хорошо просматривается. ПРИМЕЧАНИЕ: Отслеживание столба жидкости для отключения системы перед резервуар опорожняется.
- Нажмите кнопку для создания давления в резервуар и начать поток клеток.
- Когда уровень жидкости составляет примерно 2 мм от дна водоема, быстро превратить регулятор до 0 фунтов на квадратный дюйм, чтобы остановить поток. ВАЖНО: Если не удается остановить поток до резервуар опорожняется, есть риск выброса пробы из Collectioн водохранилища. Также отметим, что если в столбце жидкость не движется с заметной скоростью, или существенно замедлилась по сравнению с его первоначальной скорости потока (например 3x медленнее), установленный устройство, вероятно, забит и его необходимо заменить. Операционная забитый устройство может привести к более высокой клеточной смерти.
- Соберите обработанные клетки из соответствующего резервуара и разместить их в нужном коллекция трубки / пластины. ВАЖНО: Не разбавляйте собранные клетки в любых буферов на данном этапе, как же вноситься клетки будут продолжать поглощать материал для до 10 мин 20. После этого окно прошло, развести клетки в нужном СМИ / буфера.
- Чтобы собрать больше обработанные клетки или попробовать альтернативные экспериментальные условия, повторите шаги 5,1 - 5,7 по мере необходимости. Напомним, что чипы являются обратимыми, поэтому образцы могут быть установлены в любом пласте. Будьте уверены, чтобы обменять фишки по мере необходимости, если они забивают. Откажитесь забитые устройств.
6. Разборка
- Поместите каждую часть в соответствующий контейнер для хранения (подробно в разделе 1).
- Наведите используемые чипы в отдельной емкости для утилизации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 содержит описательную схему микрожидкостных системы доставки. Фигуры 2А-В иллюстрируют типичные результаты лечения HeLa клетки различных конструкций устройств в присутствии флуоресцентно конъюгированного 3 кДа декстрана 20. Если процедура выполняется правильно, производительность системы будет чувствителен к типу устройств и рабочей скорости. Таким образом, следует оптимизировать эти условия для данного приложения перед переходом к более сложных экспериментов. В диапазоне рабочих условий, показанных на рисунке, жизнеспособность клеток остается выше 80%, однако, следует отметить, что неоптимальные параметры доставки (типа, например, неуместно чип) может привести к жизнеспособность ниже 30%. Таким образом жизнеспособность и эффективность поставки должны быть оптимизированы одновременно для любого ранее несообщаемого типа клеток. Если дизайн устройства не подходит для данного типа клеток-мишеней, то вы увидите результаты, начиная от не поставки высокой слокоть смерть (например, 10% жизнеспособность). Если условия эксперимента были неуместны, например материал мишени связаны с поверхностью клеток, можно не быть в состоянии измерить доставку точно, как поверхность связывания сигнал может маскировать цитоплазматический сигнал.
Цифры 2с-д иллюстрируют нашу предпочтительный способ измерения эффективности доставки в живой клеточной популяции. Дело контроль в фиг.2с призвано отражать всю поверхность связывания и эндоцитозного эффекты как клетки подвергаются воздействию материала поставки, по крайней мере до тех пор, обработанных случаев. Поставляемый клеточной популяции определяется как незаштрихованной регионе, так что только 1-5% населения управления попадает на этот регион. Обратите внимание, что предыдущая работа установлено, что доставка в этом подходе не опосредовано эндоцитоза 20. Дважды пик распределения наблюдается в поставляемой например не обязательно характеристикой системы, как мы, чпр. наблюдается все больше и меньше равномерного распределения для различных экспериментальных условиях.
Рисунок 1. S chematic полной системы и ее интерфейса к микрожидкостных устройств. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 2. Типичные результаты с HeLa клетками 20. А) эффективность доставки и б) Жизнеспособность клеток HeLa клеток, обработанных на 3 различных конструкций устройств в присутствии каскадного голубой конъюгированного 3 кДа декстрана (0,2 мг / мл). В этих экспериментах клетки сЕШЕНИЕ был в концентрации 10 6 клеток на мл в PBS, содержащем 3% фетальной бычьей сыворотки и 1% F68 Pluronics. Жизнеспособность измеряли окрашиванием пропидийиодидом мертвых клеток и доставки, показаны только для живых клеток. Все данные пункты были работать в трех экземплярах, и планки погрешностей представляют 2 SDS. С) представитель гистограмма для экспериментального контроля, где HeLa клетки подвергали воздействию каскадом синий сопряженную 3 кДа декстран, по крайней мере такое же количество времени, как случае аппаратно лечить. г) Соответствующий случай, когда клетки были переданы через устройство для облегчения доставки. Доля живой клеточной популяции, которая находится в незаштрихованной области гистограммы определяется как "доставлено" населения. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Некоторые аспекты описанной экспериментальной процедурой (т.е. отличной от микросхем и рабочей скорости факторы), возможно, должны быть оптимизированы в зависимости от типа клеток и доставки материала система применяется. В последующем обсуждении рассматриваются некоторые из наиболее распространенных факторов, чтобы рассмотреть при разработке экспериментов.
Для улучшения доставки сигнала для флуоресцентной меченых соединений, необходимо обратиться источники фоновой флуоресценции. Поверхность связывание и эндоцитоз, например, могут быть решены путем промывки ячеек 5-10 мин после родов, чтобы удалить излишки материала перед культуре или дальнейшей обработки. Если избрания отказаться шаг стирки, было бы лучше, чтобы разбавить обработанные клетки на 5-10x в нужном СМИ снизить концентрацию материала мишени в окружающем растворе и, следовательно, уменьшить эндоцитозного ставки. В некоторых случаях, для доставки пример белка, можно счесть необходимым активно блокировать клеток SurfACE (например, с помощью немеченого бычий сывороточный альбумин), чтобы минимизировать неспецифическое связывание материала доставки. В данном приложении, если интенсивность флуоресценции необработанной случае, как измеряется с помощью проточной цитометрии, закончилась одно десятилетие ниже контроля эндоцитоза затем поверхность связывания / эндоцитоз может быть проблемой. Обратите внимание, что проблемы с фонового сигнала имеют значение только для прямого флуоресцентного обнаружения материала поставки, функциональные пробы (например, перепрограммирования клеток), как правило, без изменений, поскольку эндоцитозу или поверхность связанный материал часто неактивным.
В целях повышения жизнеспособности клеток после лечения, необходимо свести к минимуму количество обработки после поставки. Рекомендуется, чтобы один избежать чрезмерного центрифугирования или мыть шаги и передачи клетки в их желаемого СМИ в инкубатор 5-10 мин после комплектность поставки. В прикрепленных линий, клетки часто полностью выполняться и деления в течение 24 ч после обработки. Как обсуждалось предiously 20, мы не наблюдали каких-либо долгосрочных побочных эффектов от использования этой техники.
Микрофлюидных устройства, используемые в этой системе доставки склонны к засорению с течением времени. Сабо часто образуют на сужение, как это самое узкое функция на устройстве. Засорение может быть вызвано поврежденными клетками или загрязнителей окружающей среды. Эффект последнего может быть сведена до минимума чистый, без пыли среды функционирования устройств (например, ухоженный кабинета биобезопасности). Для клеточных линий, мы рекомендуем пассирования клеток 1-2 дней до родов так, чтобы минимизировать присутствие клеточного дебриса в полученной суспензии. При работе с устройством, необходимо помнить о объемной скорости потока жидкости в резервуаре. Если скорость потока падает до менее трети своей первоначальной скорости, устройство может быть причиной чрезмерной клеточной гибели и должен быть заменен, или направление потока наоборот. Потенциальные проблемы загрязненности можно также mitigованные пропусканием суспензии клеток через клеточный фильтр сетки 40 мкм. Этот процесс гарантирует, суспензии отдельных клеток, тем самым предотвращая потенциальные сабо от формирования в более широких, низких участков расхода чипа.
При проектировании эксперименты для доставки различных материалов, необходимо учитывать размеру материала мишени и его концентрации. Поскольку эта технология основана на пассивной диффузии материала через нарушенной клеточной мембраны, молярная концентрация градиент и гидродинамический радиус материала доставки будет регулировать скорость массопереноса - при условии, мембранные нарушения достаточно велики, чтобы вместить материал. Таким образом, целесообразно использовать высокие молярные концентрации (например, 1 мкм) больших материалов мишени относительно своих меньших борьбе частей. Техника продемонстрировала эффективную доставку в таких низких концентрациях, как 10 нМ в случае квантовой поставки точка 21. Кроме того, методика нOT полагают, быть ограничено природы материала целевой доставки, за исключением в контексте материала размером и диффузии (то есть материалы с низкой температуропроводности будет иметь более низкую эффективность доставки и материал больше, чем от размера нарушений, вероятно, не может войти в цитоплазму).
Исследования, проведенные в перепрограммирования клеток и квантовой поставки точка проиллюстрировали сильные стороны ячейки сжимая подход по отношению к электропорации. Исходя из текущей понимания механизмов на разрушение мембраны в этих двух методов, казалось бы, что сотовый сжатие имеет существенное преимущество в приложениях, связанных с белками, малые молекулы и наноматериалы 20,21. Контраст между этими двумя методами в приложениях, включающих нуклеиновые кислоты (которые высоко заряженные сравнению с вышеупомянутыми материалами), неясно.
Это Микрожидкостных подход к доставке опирается на механическое разрушение клеточной мембраны вспособствовать пассивной диффузии материала в клетку и было показано, применимы к ряду типов клеток 20. Система, таким образом, в основной, подходящей для цитозольным поставку почти любого материала к почти любой тип клеток. Мы считаем, преимущества системы наиболее выражены в случаях, связанных традиционно трудными для трансфекции первичных клеток (например, иммунной и стволовых клеток) и условно сложные материалы (например, белки, квантовые точки, углеродные нанотрубки, и РНК). Вышеупомянутый потенциал в приложениях иммунной и стволовых клеток подчеркивается недостатков традиционных методов доставки в решении этих типов клеток. Однако система может потребовать дальнейшего улучшения для облегчения доставки генов по плазмидных векторов, так как эти приложения требуют доставку в ядре. Таким образом, мы считаем, что микрофлюидных деформация подход к доставке может потенциально решают многие существующие проблемы для внутриклеточной доставки. Систенезависимость M'S от химических векторов или электрических полей позволяет его устойчивое приложение к ряду исследований. Инструкции, приведенные в данном документе, должны позволить всем заинтересованным исследователям работать такую систему самостоятельно и адаптировать ее для своих исследовательских целей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы Армон Sharei, Роберт Лангер, и Klavs Ф. Jensen являются акционерами SQZ биотехнологии компаний, которая производит микрожидкостных устройств, используемых в этой статье.
Acknowledgments
Мы благодарим Т. Шатова за полезные обсуждения экспериментального проектирования и анализа данных. Помощь и экспертиза Г. Паради, личный состав проточной цитометрии ядра на Коха, и сотрудники технической лаборатории микросистем Массачусетского технологического института с благодарностью. Эта работа была поддержана Национальными Институтами Здоровья грантов RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351, и частично Национальный институт рака онкологический центр поддержки (ядро) Гранты Р30-CA14051 и MPP-09Call-Лангер-60.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Device Holder & Plastic reservoir | SQZ Biotechnologies | Holder | |
| LSRFortessa Analyzer | Becton Dickinson | N/A | Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities |
| Microfluidic device | SQZ Biotechnologies | Cell Squeeze | |
| O-Rings | McMaster | 9452K311 | |
| Pressure system to operate device | SQZ Biotechnologies | Pressure System | |
| Tweezers | |||
| Ultrasound bath |
References
- Schaffert, D., Wagner, E. Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems. Gene. Ther. 15, 1131-1138 (2008).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 129-138 (2009).
- Leader, B., Baca, Q. J., Golan, D. E. Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 21-39 (2008).
- Kim, D., et al. Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells by Direct Delivery of Reprogramming Proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Dhar, S., Daniel, W. L., Giljohann, D. A., Mirkin, C. A., Lippard, S. J. Polyvalent Oligonucleotide Gold Nanoparticle Conjugates as Delivery Vehicles for Platinum(IV) Warheads. J. Am. Chem. Soc. 131, 14652-14653 (2009).
- Jiang, Z. -X., Zhang, Z. -Y. Targeting PTPs with small molecule inhibitors in cancer treatment. Cancer and Metastasis Reviews. 27, 263-272 (2008).
- Derfus, A. M., Chan, W. C. W., Bhatia, S. N. Intracellular Delivery of Quantum Dots for Live Cell Labeling and Organelle Tracking. Adv. Mater. 16, 961-966 (2004).
- Michalet, X., et al. Quantum Dots for Live Cells in Vivo Imaging, and Diagnostics. Science. 307, 538-544 (2005).
- Dahan, M., et al. Diffusion Dynamics of Glycine Receptors Revealed by Single-Quantum Dot Tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
- Slowing, I. I., Trewyn, B. G., Lin, V. S. Y. Mesoporous Silica Nanoparticles for Intracellular Delivery of Membrane-Impermeable Proteins. J. Am. Chem. Soc. 129, 8845-8849 (2007).
- Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 581-593 (2005).
- Joseph, Z. Cationic lipids used in gene transfer. Advanced Drug Delivery Reviews. 27 (97), 17-28 (1997).
- Verma, A., et al. Surface-structure-regulated cell-membrane penetration by monolayer-protected nanoparticles. Nat. Mater. 7, 588-595 (2008).
- Yan, M., et al. A novel intracellular protein delivery platform based on single-protein nanocapsules. Nat. Nano. 5, 48-53 (2010).
- Shi Kam, N. W., Jessop, T. C., Wender, P. A., Dai, H. Nanotube Molecular Transporters: Internalization of Carbon Nanotube-Protein Conjugates into Mammalian Cells. J. Am. Chem. Soc. 126, 6850-6851 (2004).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
- li, S. Electroporation Gene Therapy: New Developments In Vivo and In Vitro. Current Gene Therapy. 4, 309-316 (2004).
- Fox, M., et al. Electroporation of cells in microfluidic devices: a review. Anal. Bioanal. Chem. 385, 474-485 (2006).
- Miller, D. L., Pislaru, S. V., Greenleaf, J. F. Sonoporation: Mechanical DNA Delivery by Ultrasonic Cavitation. Somatic Cell and Molecular Genetics. 27, 115-134 (2002).
- Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 2082-2087 (2013).
- Lee, J., et al. Nonendocytic Delivery of Functional Engineered Nanoparticles into the Cytoplasm of Live Cells Using a Novel, High-Throughput Microfluidic Device. Nano Lett. 12, 6322-6327 (2012).
