Summary
Lymfeknuter er det immunologiske vevet som orkestrerer immunrespons og er et kritisk mål for vaksiner. Biomaterialer har blitt brukt til bedre å målrette lymfeknuter og for å kontrollere levering av antigener eller adjuvanser. Dette papiret beskriver en teknikk som kombinerer disse ideene for å injisere biokompatible polymerpartikler i lymfeknuter.
Abstract
Generering av adaptiv immunrespons er avhengig av effektiv drenering eller smugling av antigen til lymfeknuter for behandling og presentasjon av disse fremmede molekylene til T- og B-lymfocytter. Lymfeknuter har dermed blitt kritiske mål for nye vaksiner og immunterapier. En nylig strategi for å målrette disse vevene er direkte lymfeknuteinjeksjon av løselige vaksinekomponenter, og kliniske studier som involverer denne teknikken har vært lovende. Flere biomaterialestrategier er også undersøkt for å forbedre lymfeknutemålrettingen, for eksempel tuning av partikkelstørrelse for optimal drenering av biomaterialevaksinepartikler. I dette papiret presenterer vi en ny metode som kombinerer direkte lymfeknuteinjeksjon med biologisk nedbrytbare polymerpartikler som kan lades med antigen, adjuvans eller andre vaksinekomponenter. I denne metoden syntetiseres polymere mikropartikler eller nanopartikler av en modifisert dobbel emulsjonsprotokoll som inkorporerer lipidstabilisatorer. Partikkelegenskaper(f.eks. størrelse, lastlasting) bekreftes av henholdsvis laserdiffraksjon og fluorescerende mikroskopi. Muselymfoder identifiseres deretter ved perifer injeksjon av et ikke-giftig sporstoff som tillater visualisering av målinjeksjonsstedet og etterfølgende avsetning av polymerpartikler i lymfeknuter. Denne teknikken tillater direkte kontroll over doser og kombinasjoner av biomaterialer og vaksinekomponenter levert til lymfeknuter og kan utnyttes i utviklingen av nye biomaterialebaserte vaksiner.
Introduction
Lymfeknuter ( LNer) er kommandosentrene i immunsystemet. På dette immunologiske stedet presenterer antigen som presenterer celler naive lymfocytter mot spesifikke fremmede antigener for å aktivere cellulære og humorale immunresponser. NOM har dermed blitt et attraktivt mål for levering av vaksiner og immunterapi. Dessverre resulterer de fleste vaksinestrategier i ineffektiv, forbigående levering av antigen og adjuvanser til lymfoidvevet1. Tilnærminger som forbedrer målrettingen og oppbevaringen av vaksinekomponenter i LN-er, kan derfor ha en betydelig innvirkning på styrken og effektiviteten til nye vaksiner.
En strategi for å omgå utfordringen med LN-målretting som har vist stor interesse for nye kliniske studier er direkte, intra-LN (i.LN.) injeksjon2-4. Disse studiene benyttet ultralydveiledning for å levere vaksiner til LN-er som en enkel poliklinisk prosedyre. Sammenlignet med tradisjonelle perifere injeksjonsruter, resulterte denne tilnærmingen i betydelig dosesparende og forbedret effekt i terapeutiske sammenhenger, inkludert allergier og kreft2-4. Disse studiene benyttet i.LN. injeksjon av løselige vaksiner (dvs. biomaterialefri) som raskt ble ryddet av lymfatisk drenering. Derfor ble flere injeksjoner - eller sykluser av flere injeksjoner - administrert for å oppnå disse imponerende terapeutiske effektene. Forbedret oppbevaring i LN kan forbedre samspillet mellom antigen og/eller adjuvans og immunceller, noe som ytterligere forbedrer styrken til immuncellepriming. Dette potensialet støttes av nyere studier som viser kinetikk av antigen og adjuvant levering spiller en kritisk rolle i å bestemme den spesifikke immunresponsen generert5-7. Videre kan lokalisering og minimering av legemiddel- og vaksinedoser redusere eller eliminere systemiske effekter, for eksempel kronisk betennelse.
Biomaterialer har blitt studert mye for å forbedre styrken og effektiviteten til vaksiner1,8,9. Innkapsling i eller adsorpsjon på biomaterialer kan fysisk beskytte lasten mot nedbrytning og overvinne løselighetsbegrensninger. Et annet bemerkelsesverdig trekk ved biomaterialer, som polymere mikro- eller nanopartikler, er evnen til å coload flere klasser av last og deretter frigjøre disse lastene over kontrollerte intervaller. Imidlertid er en betydelig begrensning som fortsetter å hindre biomaterialer vaksiner og immunterapi in vivo ineffektiv målretting av immunceller og begrenset smugling til lymfeknuter. For eksempel viser perifer injeksjon av biomaterialevaksiner gjennom konvensjonelle ruter(f.eks. intradermal, intramuskulær) vanligvis dårlig LN-målretting, med opptil 99% av det injiserte materialet som gjenstår på injeksjonsstedet4,10. Mer nylig har størrelsen på biomaterialer vaksinebærere blitt innstilt for å forbedre preferansehandel eller drenering av disse vaksinene til LNer gjennom interstitiell strømning8,10. Disse fremskrittene har ført til forbedrede cellulære og humorale immunresponser, noe som understreker viktigheten av å målrette og konstruere LN-miljøet for nye vaksiner.
Dette papiret presenterer en vaksinasjonsprotokoll som kombinerer lipidstabiliserte polymerpartikler og i.LN. levering for å generere kontrollerte utslippsvaksinedepoter5,11. Bygger på nyere studier som benytter kirurgiske teknikker for i.LN. i mus6,7,12,13, utviklet vi en rask, ikke-urgisk strategi for injeksjon av biomaterialevaksiner hos små dyr5. Kombinere i.LN. levering med biomateriale vaksine bærere kraftig forbedret CD8 T celle respons innen 7 dager etter en enkelt injeksjon av kontrollert utgivelsen vaksine depoter5. En sterk humoral respons (dvs. antistofftitrer) ble også generert; begge forbedringene var knyttet til økt oppbevaring av vaksinekomponenter i lymfeknuter som ble mediert ved kontrollert frigjøring fra biomaterialebærere. Interessant nok endret størrelsen på vaksinepartikler skjebnen til disse materialene en gang i BN-ene: nanoskalapartikler viste økt direkte opptak av celler, mens større mikropartikler forble i det ekstracellulære LN-miljøet og frigjort last(f.eks. adjuvans) som ble tatt opp av LN-resident antigen som presenterer cellene5. Disse dataene antyder to veier som kan utnyttes for nye vaksiner ved å kontrollere størrelsen på biomaterialer injisert i.LN.
I denne artikkelen syntetiseres biologisk nedbrytbare lipidstabiliserte polymerpartikler (mikro- og nanoskala) ved hjelp av en modifisert dobbel emulsjonsstrategi5,11. Partikkelegenskaper er preget av laserdiffraksjon og mikroskopi. Disse partiklene injiseres deretter direkte i inguinale LNer identifisert ikke-urgisk ved hjelp av et vanlig, ikke-giftig tracerfargestoff14. Etterinjeksjonsanalyse av LNer ved histologi eller strømningscytometri kan brukes til å verifisere fordelingen av partikler i LN-miljøet, samt til å overvåke cellulært opptak og oppbevaring av partikler over tid. For protokoller som beskriver histologisk behandling og flytcytometri, blir leserne henvist til nylige JoVE-artikler og journalrapporter15-22. Typiske resultater viser lokal LN-målretting av disse depotene som kan utnyttes for å oppnå potente, effektive immunresponser eller for å skreddersy immunitet for målpatogener.
Protocol
Alle dyrestudier i denne protokollen ble fullført i samsvar med føderale, statlige og lokale retningslinjer, og ved hjelp av protokoller gjennomgått og godkjent av University of Maryland's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Syntese av Lipidstabiliserte mikro- og nanopartikler
- I et hetteglass med 7 ml kombinerer du DOPC-, DSPE-PEG- og DOTAP-lipider med forholdet 60:20:20 molar for å lage en master lipidblanding.
- For å syntetisere en enkelt prøve: Overfør 242,9 μl, 287,4 μl og 71,9 μl, av henholdsvis DOPC, DSPE-PEG og DOTAP, inn i hetteglasset ved hjelp av 2 ml glass serologiske pipetter.
- For å syntetisere flere prøver: Multipliser hvert lipidvolum ovenfor med antall prøver og kombiner til et enkelt hetteglass, og overfør deretter like aliquots av denne lipidblandingen til hetteglass som tilsvarer hver prøve som skal tilberedes.
- Tørk lipider under en skånsom strøm av nitrogengass i 10 min, eller plasser i vakuumovn over natten.
- I et enkelt, tomt 20 ml hetteglass, oppløs 80 mg PLGA i 5 ml dichlorometan for hver partikkelprøve for å generere en 16 mg / ml polymerbestandsoppløsning.
- Tilsett 5 ml polymeroppløsning til hetteglasset(e) som inneholder de tørkede lipidene, hetten og virvelen i 30 sek.
- Slik syntetiserer du mikropartikler:
- Begynn å sonikere den organiske fasen som inneholder polymer, lipid og annen vannløselig last på is ved 12 W ved hjelp av en soniker.
- Lag vann-i-olje (w / o) emulsjonen ved å bruke en pipette for å tilsette 500 μl destillert H2O, eller H2O som inneholder 1 mg peptid, protein eller annen vannløselig last.
- Fortsett sonikeringen i 30 sek ved 12 W på is, og gyng hetteglasset forsiktig opp og ned og fra side til side rundt sonikerspissen for å sikre fullstendig emulgering.
- Lag vann-i-olje-i-vann (m/o/w) emulsjonen ved å helle m/o-emulsjonen i 40 ml H2O i et 150 ml beger.
- Homogeniser i 3 minutter ved 16 000 o/min ved hjelp av en digital homogenisator.
- Tilsett en magnetisk rørestang, overfør begeret til en røreplate, og la m / o / w-emulsjonen røre over natten for å fjerne overflødig løsningsmiddel.
- Slik syntetiserer du nanopartikler:
- Begynn å sonikere den organiske fasen som inneholder polymer, lipid og annen vannløselig last på is ved 14 W.
- Lag m/o-emulsjonen ved å bruke en pipette til å tilsette 500 μl destillert H2O, eller H2O som inneholder 1 mg peptid, protein eller annen vannløselig last.
- Fortsett sonikering i 30 sek ved 14 W på is.
- Lag m/o/w-emulsjonen ved å helle m/o-emulsjonen til 40 ml H2O i et 150 ml beger og sonikere i 5 minutter ved 16 W på is. Gyng hetteglasset forsiktig opp og ned og fra side til side rundt sonikerspissen for å sikre fullstendig emulgering.
- Tilsett en magnetisk rørestang, overfør kolben til en røreplate og la w / o / w-emulsjonen røre over natten for å fjerne overflødig løsningsmiddel.
- Neste morgen, vask og samle partikler:
- Hell emulsjonen gjennom 40 μm Nylon nettingcellesil i et 50 ml konisk rør.
- Sentrifugerpartikler i 5 min ved 5000 x g for mikropartikler eller 5 min ved 24 000 x g for nanopartikler.
- Dekanter supernatant og vask partikler ved å resuspendere i 1 ml H2O.
- Overfør suspenderte partikler til et 1,5 ml mikrosenterrør.
- Sentrifuge i 5 min ved 5000 x g for mikropartikler eller 5 min ved 24 500 x g for nanopartikler.
- Vask partikler to ganger til ved å fjerne supernatant, resuspending i 1 ml H2O, og sentrifugering som i trinn 1.6.5. Etter vask, suspendere partikler i 1 ml H2O for umiddelbar bruk, eller lyofilisere for utvidet lagring.
2. Måling av synteseutbytte
- Forvekt et tomt hetteglass med 20 ml glass. Tilsett 100 μl partikkelfjæring til det forhåndsveide hetteglasset etter pipettering opp og ned med en mikropipette for å blande.
- Lyofiliser partiklene eller tørk under en mild strøm av nitrogen.
- Vei hetteglasset som inneholder den tørkede polymeren. Bestem partikkelutbyttet i hetteglasset ved å trekke den opprinnelige vekten av hetteglasset fra massen av hetteglasset som inneholder de tørkede partiklene.
- Bestem det totale partikkelutbyttet ved å multiplisere partikkelmassen i hetteglasset med fortynningsfaktoren. For å bestemme prosentutbyttet, del partikkelmassen med maksimal teoretisk inngangsmasse og multipliser med 100%.
3. Bestemmelse av partikkelstørrelse
- Rengjør den medfølgende glassfraksjonscellen i cuvette-stil ved å fylle med deionisert vann og tørke med bomullspinne. Overfør 10 ml destillert H2O til den rensede fraksjonscellen, tilsett magnetisk mikrorørestang og last brøkcellen inn i cellebraketten til partikkelstørrelsesanalysatoren.
- Juster den magnetiske rørehastigheten i partikkelanalysatoren for å oppnå fullstendig blanding i brøkcellen og lukk romdøren.
- Juster laserne til brøkcellen ved hjelp av instrumentets programvaregrensesnitt.
- Bruk instrumentets programvaregrensesnitt til å registrere en grunnlinjeavlesning med brøkcellen som bare inneholder destillert H2O.
- Pipette den opprinnelige partikkelfjæringen opp og ned med en mikropipette for å blande.
- Pipette 10 μl partikkeloppheng (vanligvis ca. 0,5 mg) inn i brøkcellen. Forsikre deg om at volumet av partikkelprøve lagt til cellen er tilstrekkelig til å generere signalstyrke i riktig område som angitt på instrumentets programvaregrensesnitt. Den faktiske massen av partikler som kreves er avhengig av prosentutbytte og de optiske egenskapene til partikkelprøven.
- Lukk døren til partikkelstørrelsesanalysatorrommet og mål partikkelstørrelsen ved hjelp av en brytningsindeks på 1,60 for PLGA.
- Bruk programvaregrensesnittet til å beregne partikkeldiameter ved hjelp av et tallgrunnlag.
4. Visualisering av partikler
- Pipettepartikkelfjæring opp og ned med mikropipette for å blande. Fortynn partikkelfjæringen til 1 mg/ml i deionisert vann.
- Forbered et mikroskopskred ved å tilsette 3 μl fortynnet partikkeloppheng og montere en dekslelip i en 45° vinkel for å unngå bobledannelse. Plasser lysbildet på mikroskopstadiet og bildet ved hjelp av de riktige filtersettene for hver fluorescerende last.
5. Forberedelse av mus for i.LN. innsprøytning
- Forbered tracer fargestoffløsning:
- Forbered en 0,1% (w / v) løsning av tracerfarge ved å oppløse 10 mg fargepulver med 10 ml destillert H2O.
- Steriliser fargestoffoppløsningen til et hetteglass med et 0,2 μm sprøytefilter.
- En dag før injeksjon, bedøvet mus ved hjelp av isofluran i henhold til en IACUC godkjent dyreprotokoll. For å evaluere dybden av anestesi, utfør en tå klype reflekstest og overvåk pustefrekvensen for å sikre en åndedrettsfrekvens på ca. 100-140 pust per minutt.
- Barber håret ved foten av halen og bakkvarteret ved hjelp av clippers mens musen er bedøvet. Fjern hår fra dyrets ventrale side og sidelengs rundt til dorsalsiden like over leddet på bakbenet (hofte).
- Injiser tracer fargestoff.
- For hver fargeinjeksjon, bruk en mikropipette for å overføre 10 μl fargestoffoppløsning til et mikrocentrifugerør, og aspirer hele 10 μl til en 31G nål festet til en 1 ml sprøyte.
- Injiser 10 μl fargestoffoppløsning subkutant på hver side av halebasen der håret ble klippet, og last inn mellom injeksjoner.
- Fjern gjenværende hår ved å bruke en mild depilatorisk krem via bomullspinne. Pass på å belegge området mellom baklåret og magen.
- La depilatorisk krem inkubere på huden i 3 min. Etter inkubasjon, våt hansket hånd med varm H2O og forsiktig gni depilatorisk krem inn i huden.
- Fjern umiddelbart depilatorisk krem ved å fukte hansket hånd med varm H2O og gni halebunnen og bakkvarteret. Gjenta til overflødig depilatorium er fjernet, sørg for å holde hånden våt for å unngå irritasjon.
- Fjern gjenværende depilatorium fra musen ved å fukte en myk klut eller papirhåndkle med varmH2O og i en enkelt bevegelse, tørke nedre del av musen. Unngå en gnidningsbevegelse for å forhindre slitasje eller hudskader på musen.
- La musen komme seg under en varmelampe og gå tilbake til å holde.
6. i.LN. Injeksjon av partikler
- Neste dag bedøver du musen ved hjelp av isofluran i henhold til en IACUC-godkjent dyreprotokoll.
- Undersøk musen for å bekrefte drenering av sporstoff i hver inguinal lymfeknute. Lymfeknuten skal være synlig som et mørkt sted nær baklåret og magen.
- Forbered partikkelinjeksjonsløsning:
- Resuspendpartikler i destillert H2O ved ønsket injeksjonskonsentrasjon. For hver injeksjon, bruk en mikropipette for å overføre 10 μl partikkeloppløsning til et mikrocentrifugerør.
- Aspirer hele 10 μl inn i en 31G insulinnål festet til en 1 ml sprøyte.
- Injiser partikkeldose:
- Etter å ha visualisert LN, stram huden rundt LN ved hjelp av tommel, pekefinger og langfinger for å trekke hud hån og tillate kontrollert plassering av injeksjonsvolumet.
- Nærmer seg LN med nålen i en 90 ° vinkel mot huden og trenger inn i huden over farget LN til en dybde på 1 mm.
- Injiser hele volumet langsomt. Under injeksjonen må du observere LN-volumet gjennom huden for å bekrefte injeksjonen ved synlig LN-forstørrelse.
- La musen komme seg under en varmelampe og gå tilbake til å holde eller utføre ytterligere testing.
For relevante analyseteknikker(f.eks. histologi, flowcytometri) se JoVE-artikkel 265, 1743 og 3054 og gjeldende protokoller i immunologi, kapittel 5 og 2115-22.
Representative Results
Forventede resultater for protokollene som presenteres i dette manuskriptet kan deles inn i tre kategorier: partikkelsyntese, dyreforberedelse og partikkelinjeksjon.
Figur 1 viser syntesen og karakteriseringen av biologisk nedbrytbare polymerpartikler, stabilisert av amfifile lipider. Resultatene av emulsjons-/løsningsmiddelfordampningssynteseprotokollen (figur 1A) kan kvalitativt vurderes ved visuell inspeksjon av de endelige emulsjonene som genereres; partikkelpartier skal være homogene, stabile emulsjoner med ugjennomsiktig utseende. Komplikasjoner inkluderer emulsjoner som krem eller flocculate, ofte på grunn av feil lagring av lipidstabilisatorer. For å unngå denne ustabiliteten, bør lipider lagres ved -80 °C i dehydrert tilstand eller i et forseglet hetteglass som er renset med nitrogen. Kvantitativ vurdering av partikkelsyntese kan utføres ved hjelp av laserdiffraksjon eller dynamisk lysspredning for å analysere størrelsesfordeling (figur 1B). Forventede resultater inkluderer tett fordelte, monomodale partikkelstørrelser, noe som indikerer en jevn populasjon av partikler. Synteseparametrene som er beskrevet i dette manuskriptet genererer gjennomsnittlige fordelinger sentrert på henholdsvis ca. 100 nm eller 3 μm for nanopartikler og mikropartikler. Ytterligere kvalitativ vurdering av partikkelsyntese kan oppnås gjennom modifikasjon av ovennevnte protokoll for å inkorporere flere klasser av fluorescerende last. I figur 1Cbekrefter mikroskopibilder av mikropartikler lastet med et fluorescerende peptid (FITC, grønn), et lipofilt fargestoff (DiD, rødt) og et overleggsbilde (gult) opprettelsen av partikler innenfor ønsket størrelsesområde og innkapsling av peptid innenfor partikkelens volum.
De to første panelene i figur 2 oppsummerer de forventede resultatene av dyreforberedelse for i.LN.-injeksjonsstrategien som er beskrevet i dette dokumentet. Metodikken innebærer merking av inguinale LNer ved perifer injeksjon av en ikke-giftig tracer for å identifisere plasseringen for etterfølgende i.LN. injeksjon av partikler (Figur 2A)5. Som nevnt vil drenering av sporstoffet etter subkutan injeksjon ved halebasen muliggjøre visualisering av inguinale LNer (figur 2B)5. Inntak av godkjente depilatoriske kremer kan utgjøre farer for musene. Dermed bør det tas hensyn til å fjerne all krem som påføres grundig, spesielt oppmerksom på poter og musenes ventrale side. Depilatoriet bør fjernes med en våt, myk klut eller vått papirhåndkle i en enkelt, jevn bevegelse. Unngå å gni for å fjerne krem, da dette kan føre til slitasje på musenes eksponerte hud.
Bekreftelse av lokal levering til inguinal LN kan evalueres gjennom observasjon eller histologi. LN-volumet kan overvåkes visuelt under injeksjon som en indikator på vellykket injeksjon. Forventede resultater inkluderer effektiv lastdistribusjon i hele LN-strukturen, uten betydelig lekkasje til tilstøtende vev eller celler. Videre, som injisert væske fortrenger / fortynner tracer i LN, farge konsentrasjon / farging bør bli mindre intens etter injeksjon. Observasjon av vevet skal avsløre en intakt, men forstørret LN på grunn av væskeinjeksjon. Potensielle utfordringer inkluderer å injisere for raskt eller gå glipp av LN, som begge kan forårsake elution av volumet i omkringliggende subkutant vev. Disse uønskede resultatene kan bekreftes av nekropsi eller histologi, hvor partikkelfjæringen vil bli observert som sprer seg til celler og vev fjernt fra noder som er målrettet for injeksjon. I motsetning til dette vil et forventet resultat være identifisering av en forstørret inguinal LN på grunn av inneslutning av partikler i LN-strukturen. Histologisk behandling av utskilte LNer kan definitivt bekrefte levering av last til lymfoidvevet, som vist i figur 2C og 2D. Merk at partiklene i figur 2 inkorporerer fluorescerende last for å muliggjøre visualisering av last under injeksjon, samt under histologisk prosessering og fluorescerende mikroskopi.
Figur 1. Syntese og karakterisering av lipidstabiliserte partikler. A) Skjematisk diagram som beskriver syntesen av lipidstabiliserte partikler fremstilt ved emulsjon/løsningsmiddelfordampning. B) Størrelsesfordelinger av mikropartikler (solid linje, diameter = 2,8 μm) og nanopartikler (stiplet linje, diameter = 113 nm). C) Fluorescerende mikroskopibilder av partikler lastet med fluorescerende merket peptid og fluorescerende partikkelfargestoff. Etiketter: peptid (grønn) og partikkel (rød). Klikk her for å vise større bilde.
Figur 2. i.LN. Injeksjon og distribusjon av biologisk nedbrytbare partikler innen LN. A) Metodikk for i.LN. injeksjon. B) Visualisering av LNer i en mus gjennom huden (øvre bilde) og etter nekropsi (nederste bilde)5. C) Histologisk farging av en LN som bekrefter avsetning og distribusjon av fluorescerende merkede polymermikropartikler (partikler, grønne; T-celler, røde; B-celler, blå). D) Fluorescerende merkede nanopartikler (50 nm, venstre bilde) og mikropartikler (6 μm, høyre bilde) i LNer 24 timer etter injeksjon. Klikk her for å vise større bilde.
Discussion
Teknikken beskrevet i denne protokollen tillater kontrollert levering av vaksiner til LNer og til LN-hjemmehørende antigen som presenterer celler. Biomateriale innkapslet last kan lokaliseres innenfor LN, slik at manipulering av doser av en eller flere typer last levert til LN mikromiljøet. Lokaliseringen og kontrollert frigjøring fra polymerpartikler har vist seg å generere en potent cellulær og humoral immunrespons ved betydelig lavere doser enn konvensjonelle tilnærminger. Videre, gjennom manipulering av biomaterialebærerstørrelse, kan den primære modusen for cellulær behandling moduleres mellom direkte opptak av nanopartikler eller ekstracellulær lastutløsning fra større mikropartikler5. Disse resultatene etablerer muligheten for i.LN. biomaterialelevering som en plattform for terapeutisk vaksinelevering.
Syntesen av PLGA-partikler ved emulsjon/løsningsmiddelfordampning har vært mye brukt i søknader om legemiddellevering23,24. Dermed er potensielle utfordringer knyttet til denne teknikken hovedsakelig knyttet til vellykket identifisering og avsetning av vaksiner på LN-målstedet. Selv om bruken av tracerfarge letter visualiseringen av de målrettede inguinale ALT-ene, er målstørrelsen og dybden under huden liten. Dermed anbefaler forfatterne å tildele tid og mus for å praktisere forberedelse og injeksjoner av mus. Under dyreforberedelse(dvs. barbering og påføring av depilatorisk), bør det tas hensyn til ikke å kutte musene på den ventrale siden av dyret der vinkelen på benet med magen gjør huden mer utsatt for skade fra clippers. I tillegg bør all depilatorium fjernes med varmt vann for å forhindre at dyr inntar kremen under normal grooming oppførsel. For å praktisere LN-injeksjoner kan en høyere sporstoffkonsentrasjon administreres og praktisere dyr kan avlives, og deretter injiseres flere ganger. Etter injeksjon mus kan være nekropsied og størrelsen på LNer fra injiserte dyr kan sammenlignes med en uinjisert kontroll LN. En begrensning ved denne teknikken er den fysiske grensen for injeksjonsvolumet som kan lastes inn i LN-strukturen. Vår protokoll antyder et injeksjonsvolum på 10 μl hos mus, selv om andre studier har rapportert større injeksjonsvolumer minst så høyt som 20 μl.13 Imidlertid tillater direkte levering av vaksiner via i.LN. injeksjon dramatisk dosesparing, slik at funksjonen til disse vaksinene generelt ikke bør begrenses av volumbegrensninger.
Som nevnt er endring av partiklenes fysiske egenskap (dvs. størrelse) en effektiv mekanisme for å endre banen eller resultatene forårsaket av biomaterialer og innkapslede last i LN-vev. Fordampningsprotokollen for emulsjon/løsningsmiddel kan enkelt modifiseres for å endre fysiske eller kjemiske egenskaper som overflatelading eller funksjonalitet, og hastigheten på biologisk nedbrytning /lastutløsning23,24. For eksempel kan frigjøringskinetikken justeres gjennom alternative polymersammensetninger, og overflatefunksjonen kan endres ved hjelp av modifiserte lipidblandinger eller poly (vinylalkohol). Lasten lastet i partikler kan lett manipuleres til å inneholde forskjellige antigener eller adjuvanser for målpatogener. Fordelen med denne tilnærmingen oppnås gjennom kombinasjonen av i.LN. levering med lokal, kontrollert frigjøring av last fra biomaterialer. Denne synergien etablerer en plattform som kan utnyttes til effektivt å generere adaptive immunresponser ved hjelp av minuttdoser og med reduserte ikke-spesifikke / systemiske bivirkninger.
Disclosures
Produksjonskostnader og tilgangsgebyrer for disse artiklene ble delvis sponset av HORIBA, Ltd.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis finansiert av PhRMA foundation og en Research and Scholar Award fra University of Maryland, College Park. Vi takker prof. Darrell Irvine for støtte til det første arbeidet som ble utført i ferdigstillelsen av "In situ engineering av lymfeknutemikromiljøet via intranodal injeksjon av adjuvant-frigjørende polymerpartikler." 5
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | 10 mg/ml stock in chloroform |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] ammonium salt (DSPE-PEG) | Avanti Polar Lipids | 880128 | 10 mg/ml stock in chloroform |
| 1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride salt (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890 | 10 mg/ml stock in chloroform |
| Polylactic-co-glycolic acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | P2191 | Lactide:Glycolide (50:50). MW 30,000-60,000 |
| Dichloromethane (DCM) | VWR | BDH1113 | |
| Isoflurane | Vetone | 502017 | |
| Nair | Nair | ||
| Evans blue tracer dye | VWR | AAA16774-09 | |
| U-100 BD Ultra-Fine Short Insulin Syringes, 31 G 5/16 in needle | VWR | BD328418 | |
| Single-Use Needles, BD Medical, 21 G, 1.5 in needle | VWR | BD305167 | |
| Syringes with BD Luer-Lok Tip, BD Medical, 1 ml | VWR | BD309628 | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning, 40 µm | VWR | 21008-949 | |
| Vybrant DiD Cell-Labeling Solution | Invitrogen | V-22887 | |
| Fluoresbrite YG Microspheres 6.00 µm | Polysciences | 17149 | |
| Fluoresbrite YG Microspheres 0.05 µm | Polysciences | 17156 | |
| Ovalbumin, Purified | Worthington Biochemical | LS003056 | |
| Qsonica Sonicator Ultrasonic Processor Q125 | Qsonica | Q125 | 1/8 in diameter microtip probe |
| Ultra-Turrax T 25 digital homogenizer | IKA | YO-04739-22 | 10 G dispersing element |
| Fluorescent Microscope | Olympus | IX-83 | |
| Laser Diffraction Particle Size Distribution Analyzer | Horiba | LA-950 | Including provided cuvette-style glass fraction cell |
| Professional 8685 Peanut Classic Clippers | Wahl |
References
- Swartz, M. A., Hirosue, S., Hubbell, J. A. Engineering Approaches to Immunotherapy. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Adamina, M., et al. Intranodal immunization with a vaccinia virus encoding multiple antigenic epitopes and costimulatory molecules in metastatic melanoma. Mol. Ther. 18, 651-659 (2010).
- Ribas, A., et al. Intra-Lymph Node Prime-Boost Vaccination against Melan A and Tyrosinase for the Treatment of Metastatic Melanoma: Results of a Phase 1. Clinical Trial. Clin. Cancer Res. 17, 2987-2996 (2011).
- Senti, G., et al. Intralymphatic allergen administration renders specific immunotherapy faster and safer: a randomized controlled trial. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 17908-17912 (2008).
- Jewell, C. M., Lopez, S. C. B., Irvine, D. J. In situ engineering of the lymph node microenvironment via intranodal injection of adjuvant-releasing polymer particles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15745-15750 (2011).
- Johansen, P., et al. Antigen kinetics determines immune reactivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5189-5194 (2008).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat. Rev. Immunol. 5, 617-628 (2005).
- Irvine, D. J., Jewell, C. M. Ch. 132. Comprehensive Biomaterials. Ducheyne, P., et al. , (2011).
- Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. Engineering Nano- and Microparticles to Tune Immunity. Adv. Mater. 24, 3724-3746 (2012).
- Reddy, S. T., et al. Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticle vaccines. Tissue Eng. Part A. 14, 734-735 (2008).
- Bershteyn, A., et al. Polymer-supported lipid shells, onions, and flowers. Soft Matter. 4, 1787-1791 (2008).
- Johansen, P., et al. Direct intralymphatic injection of peptide vaccines enhances immunogenicity. Eur. J. Immunol. 35, 568-574 (2005).
- Mohanan, D., et al. Administration routes affect the quality of immune responses: A cross-sectional evaluation of particulate antigen-delivery systems. J. Controlled Release. 147, 342-349 (2010).
- Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. J. Immunol. Methods. 332, 170-174 (2008).
- He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques. J. Vis. Exp. , 1743 (2010).
- Matheu, M. P., Parker, I., Cahalan, M. D. Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice. J. Vis. Exp. e265. , 265 (2007).
- Salmon, H., et al. Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes. J. Vis. Exp. , 3054 (2011).
- Donaldson, J. G. in Current Protocols in Immunology: Immunofluorescence Staining. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Hofman, F. in Current Protocols in Immunology: Immunohistochemistry. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Holmes, K., Lantz, L. M., Fowlkes, B. J., Schmid, I., Giorgi, J. V. in Current Protocols in Immunology: Preparation of Cells and Reagents for Flow Cytometry. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Sharrow, S. O. in Current Protocols in Immunology: Overview of Flow Cytometry. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Sharrow, S. O. in Current Protocols in Immunology: Analysis of Flow Cytometry Data. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Anderson, J. M., Shive, M. S. Biodegradation and biocompatibility of PLA and PLGA microspheres. Adv. Drug Deliv. Rev. 28, 5-24 (1997).
- Danhier, F., et al. PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications. J. Controlled Release. 161, 505-522 (2012).
