Summary
Lymfkörtlar är de immunvävnader som orkestrerar immunsvar och är ett kritiskt mål för vacciner. Biomaterial har använts för att bättre rikta in sig på lymfkörtlar och för att kontrollera leverans av antigener eller adjuvanser. Detta dokument beskriver en teknik som kombinerar dessa idéer för att injicera biokompatierbara polymerpartiklar i lymfkörtlar.
Abstract
Generering av adaptiv immunsvar förlitar sig på effektiv dränering eller handel med antigen till lymfkörtlar för bearbetning och presentation av dessa främmande molekyler till T- och B-lymfocyter. Lymfkörtlar har därmed blivit kritiska mål för nya vacciner och immunterapier. En ny strategi för att rikta in sig på dessa vävnader är direkt lymfkörtelinjektion av lösliga vaccinkomponenter, och kliniska prövningar som involverar denna teknik har varit lovande. Flera biomaterialstrategier har också undersökts för att förbättra lymfkörtelinriktningen, till exempel justering av partikelstorlek för optimal dränering av biomaterialvaccinpartiklar. I detta dokument presenterar vi en ny metod som kombinerar direkt lymfkörtelinjektion med biologiskt nedbrytbara polymerpartiklar som kan lastas med antigen, adjuvans eller andra vaccinkomponenter. I denna metod syntetiseras polymera mikropartiklar eller nanopartiklar genom ett modifierat dubbelemulsionsprotokoll som innehåller lipidstabilisatorer. Partikelegenskaper(t.ex. storlek, lastlastning) bekräftas av laserdiffraktion respektive fluorescerande mikroskopi. Muslymfkörtlar identifieras sedan genom perifer injektion av ett giftfri spårämne som möjliggör visualisering av målinjektionsstället och efterföljande nedfall av polymerpartiklar i lymfkörtlar. Denna teknik möjliggör direkt kontroll över doser och kombinationer av biomaterial och vaccinkomponenter som levereras till lymfkörtlar och kan utnyttjas vid utveckling av nya biomaterialbaserade vacciner.
Introduction
Lymfkörtlarna (LNs) är immunsystemets kommandocentraler. På denna immunologiska plats, antigen presenterar celler prime naiva lymfocyter mot specifika främmande antigener att aktivera cellulära och humorala immunsvar. LNs har därmed blivit ett attraktivt mål för leverans av vacciner och immunterapier. Tyvärr resulterar de flesta vaccinstrategier i ineffektiv, övergående leverans av antigen och adjuvanser till lymfvävnaden1. Metoder som förbättrar inriktningen och kvarhållandet av vaccinkomponenter i LN kan därför ha en betydande inverkan på styrkan och effektiviteten hos nya vacciner.
En strategi för att kringgå utmaningen med LN-inriktning som har visat stort intresse för nya kliniska prövningar är direkt, intra-LN (i.LN.) injektion2-4. Dessa studier använde ultraljud vägledning för att leverera vacciner till LNs som en enkel öppenvården förfarande. Jämfört med traditionella perifera injektionsvägar resulterade detta tillvägagångssätt i betydande dossparande och förbättrad effekt i terapeutiska sammanhang inklusive allergier och cancer2-4. I dessa studier användes i.LN. injektion av lösliga vacciner(dvs. biomaterialfria) som snabbt rensades genom lymfatisk dränering. Därför administrerades flera injektioner- eller cykler av flera injektioner- för att uppnå dessa imponerande terapeutiska effekter. Förbättrad retention i LN kan förbättra interaktionen mellan antigen och/eller adjuvant och immunceller, ytterligare förbättra styrkan i immun cell priming. Denna potential stöds av nyligen genomförda studier som visar kinetik av antigen och adjuvant leverans spelar en avgörande roll för att bestämma det specifika immunsvar somgenereras 5-7. Vidare kan lokalisera och minimera läkemedels- och vaccindoser minska eller eliminera systemiska effekter, såsom kronisk inflammation.
Biomaterial har studerats utförligt för att förbättra styrkan och effektiviteten hos vacciner1,8,9. Inkapsling eller adsorption på biomaterialbärare kan fysiskt skydda lasten från nedbrytning och övervinna löslighetsbegränsningar. Ett annat anmärkningsvärt inslag hos biomaterialbärare, såsom polymera mikro- eller nanopartiklar, är förmågan att lasta flera lastklasser och därefter släppa dessa laster över kontrollerade intervaller. En betydande begränsning som fortsätter att hindra biomaterialvacciner och immunterapier in vivo är dock ineffektiv inriktning på immunceller och begränsad handel med lymfkörtlar. Till exempel uppvisar perifer injektion av biomaterialvacciner genom konventionella vägar(t.ex. intradermal, intramuskulär) vanligtvis dålig LN-inriktning, med upp till 99% av det injicerade materialet kvar på injektionsstället4,10. På senare tid har storleken på biomaterialvaccinbärare justerats för att förbättra förmånshandeln eller dräneringen av dessa vacciner till LN genom interstitielltflöde 8,10. Dessa framsteg har lett till förbättrade cellulära och humorala immunsvar, vilket understryker vikten av att rikta in sig på och konstruera LN-miljön för nya vacciner.
Detta dokument presenterar ett vaccinationsprotokoll som kombinerar lipidstabiliserade polymerpartiklar och i.LN. leverans för att generera kontrollerade frisättningsvaccindepåer5,11. Bygger på nyligen genomförda studier som använder kirurgiska tekniker för i.LN. hos möss6,7,12,13, utvecklade vi en snabb, icke-surgisk strategi för att injicera biomaterialvacciner hos små djur5. Kombinera i.LN. leverans med biomaterial vaccin bärare kraftigt förbättrad CD8 T cell svar inom 7 dagar efter en enda injektion av kontrollerade frisättningvaccindepåer 5. Ett starkt humoristiskt svar (dvs. antikroppstitrar) genererades också; Båda förbättringarna var kopplade till ökad retention av vaccinkomponenter i lymfkörtlar som förmedlades av kontrollerade utsläpp från biomaterial bärare. Intressant nog förändrade storleken på vaccinpartiklar ödet för dessa material en gång i LNs: partiklar i nanoskala visade förhöjd direkt upptag av celler, medan större mikropartiklar förblev i den extracellulära LN-miljön och släppte ut last (t.ex. adjuvans) som togs upp av LN-bosatta antigen som presenterar celler5. Dessa data tyder på två vägar som kan utnyttjas för nya vacciner genom att kontrollera storleken på biomaterial injiceras i.LN.
I denna artikel syntetiseras biologiskt nedbrytbara lipidstabiliserade polymerpartiklar (mikro- och nanoskala) med hjälp av en modifierad dubbel emulsionsstrategi5,11. Partikelegenskaper kännetecknas av laserdiffraktion och mikroskopi. Dessa partiklar injiceras sedan direkt i de inguinala LNs identifieras nonsurgically med hjälp av en gemensam, nontoxic tracer färgämne14. Analys efter injektion av LN genom histologi eller flödescytometri kan användas för att verifiera fördelningen av partiklar inom LN-miljön, samt för att övervaka cellulärt upptag och retention av partiklar över tid. För protokoll som beskriver histologisk bearbetning och flödescytometri hänvisas läsarna till de senaste JoVE-artiklarna och tidskriftsrapporterna15-22. Typiska resultat visar lokala LN inriktning av dessa depåer som kan utnyttjas för att uppnå potenta, effektiva immunsvar eller för att skräddarsy immunitet för mål patogener.
Protocol
Alla djurstudier i detta protokoll slutfördes i enlighet med federala, statliga och lokala riktlinjer och med hjälp av protokoll som granskats och godkänts av University of Marylands Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Syntes av lipidstabiliserade mikro- och nanopartiklar
- Kombinera DOPC, DSPE-PEG och DOTAP lipider med ett 60:20:20 molarförhållande i en 7 ml glasflaska för att förbereda en master lipidblandning.
- För att syntetisera ett enda prov: Överför 242,9 μl, 287,4 μl respektive 71,9 μl av DOPC, DSPE-PEG respektive DOTAP till injektionsflaskan med 2 ml serologiska glaspipetter.
- För att syntetisera flera prover: Multiplicera varje lipidvolym ovan med antalet prover och kombinera till en enda flaska och överför sedan lika många alikvoter av denna lipidblandning till injektionsflaska som motsvarar varje prov som ska beredas.
- Torka lipider under en skonsam ström av kvävegas i 10 minuter, eller placera i vakuumugn över natten.
- Lös upp 80 mg PLGA i 5 ml diklormetan i ett enda, tomt 20 ml glasflaska för varje partikelprov för att generera en polymerlagerlösning på 16 mg/ml.
- Tillsätt 5 ml polymerlösning till injektionsflaskan som innehåller torkade lipider, lock och virvel i 30 sekunder.
- Så här syntetiserar du mikropartiklar:
- Börja ultraljudsförsona den organiska fasen som innehåller polymeren, lipiden och annan vattenlöslig last på is vid 12 W med hjälp av en ljuddatorn.
- Skapa emulsionen av olja (w/o) med hjälp av en pipett för att tillsätta 500 μl destillerad H2O eller H2O som innehåller 1 mg peptid, protein eller annan vattenlöslig last.
- Fortsätt ultraljudsbehandling i 30 sekunder vid 12 W på is, försiktigt gunga injektionsflaskan upp och ner och sida vid sida runt ljuddatorns spets för att säkerställa fullständig emulgering.
- Skapa emulsionen vatten-i-olja-i-vatten (w/o/w) genom att hälla w/o-emulsionen i 40 ml H2O i en 150 ml bägare.
- Homogenisera i 3 min vid 16 000 varv/min med hjälp av en digital homogenisator.
- Tillsätt en magnetisk omrörningsstång, överför bägaren till en omrörningsplatta och låt w/o/w-emulsionen röra om över natten för att avlägsna överskottet av lösningsmedel.
- Så här syntetiserar du nanopartiklar:
- Börja ultraljudsifiera den organiska fasen som innehåller polymeren, lipiden och annan vattenlöslig last på is vid 14 W.
- Skapa w/o-emulsionen med hjälp av en pipett för att tillsätta 500 μl destillerad H2O, eller H2O som innehåller 1 mg peptid, protein eller annan vattenlöslig last.
- Fortsätt sonikera i 30 sekunder vid 14 W på is.
- Skapa w/o/w emulsionen genom att hälla w/o emulsionen till 40 ml H2O i en 150 ml bägare och ultraljudsbehandling i 5 min vid 16 W på is. Vagga försiktigt injektionsflaskan upp och ner och sida vid sida runt ljuddatorns spets för att säkerställa fullständig emulgering.
- Tillsätt en magnetisk omrörningsstång, överför kolven till en omrörningsplatta och låt w/o/w-emulsionen röras över natten för att avlägsna överskottet av lösningsmedel.
- Nästa morgon, tvätta och samla partiklar:
- Häll emulsion genom 40 μm Nylon mesh cellsil i ett 50 ml koniskt rör.
- Centrifugpartiklar i 5 min vid 5 000 x g för mikropartiklar eller 5 min vid 24 000 x g för nanopartiklar.
- Dekantera supernatant och tvätta partiklar genom att återanvända i 1 ml H2O.
- Överför suspenderade partiklar till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Centrifugera i 5 min vid 5 000 x g för mikropartiklar eller 5 min vid 24 500 x g för nanopartiklar.
- Tvätta partiklarna två gånger till genom att avlägsna supernatant, återanvända i 1 ml H2O och centrifugera som i steg 1.6.5. Efter tvättning, suspendera partiklar i 1 ml H2O för omedelbar användning eller lyofilisera för utökad lagring.
2. Mätning av syntesutbyte
- Förvädr en tom 20 ml glasflaska. Tillsätt 100 μl partikelupphängning till den förvätrade injektionsflaskan efter pipettering upp och ner med en mikropipett att blanda.
- Lyofilisera partiklarna eller torka under en mild ström av kväve.
- Väg injektionsflaskan som innehåller den torkade polymeren. Bestäm partikelutbytet i injektionsflaskan genom att subtrahera injektionsflaskats ursprungliga vikt från massan av injektionsflaskan som innehåller de torkade partiklarna.
- Bestäm det totala partikelutbytet genom att multiplicera partikelmassan i injektionsflaskan med utspädningsfaktorn. För att bestämma procentutbyte, dividera partikelmassan med den maximala teoretiska ingångsmassan och multiplicera med 100%.
3. Bestämning av partikelstorlek
- Rengör den medföljande cuvette-stil glasfraktionscellen genom att fylla med avjoniserat vatten och torka med bomullsspetsad bomullspinne. Överför 10 ml destillerat H2O till den rengjorda fraktionscellen, tillsätt magnetisk mikrorörstång och ladda fraktionscellen i cellfästet på partikelstorleksanalysatorn.
- Justera den magnetiska omrörningshastigheten i partikelanalysatorn för att uppnå fullständig blandning i fraktionscellen och stäng fackdörren.
- Rikta in lasrarna på bråkcellen med hjälp av instrumentprogramvarans gränssnitt.
- Använd instrumentprogramvarans gränssnitt för att spela in en baslinjeavläsning med bråkcellen som endast innehåller destillerad H2O.
- Pipett den ursprungliga partikel suspension upp och ner med en mikropipette att blanda.
- Pipett 10 μl partikelupphängning (vanligtvis cirka 0,5 mg) i fraktionen cellen. Se till att volymen partikelprov som tillsätts cellen är tillräcklig för att generera signalstyrka inom lämpligt intervall enligt anvisningarna i instrumentets programvarugränssnitt. Den faktiska massan av partiklar som krävs är beroende av procentutbyte och partikelprovens optiska egenskaper.
- Stäng partikelstorleksanalysatorns kupédörr och mät partikelstorleken med hjälp av ett brytningsindex på 1,60 för PLGA.
- Använd programvarugränssnittet för att beräkna partikeldiametern med hjälp av ett tal.
4. Visualisering av partiklar
- Pipettpartikelupphängning upp och ner med mikropipett att blanda. Späd partikelupphängning till 1 mg/ml i avjoniserat vatten.
- Förbered en mikroskopbild genom att tillsätta 3 μl utspädd partikelupphängning och montera ett locklip i 45° vinkel för att undvika bubbelbildning. Placera bilden på mikroskopstadiet och bilden med hjälp av lämpliga filteruppsättningar för varje fluorescerande last.
5. Förberedelse av möss för i.LN. injektion
- Förbered spårämneslösning:
- Bered en 0,1% (w/v) lösning av spårämne genom att lösa upp 10 mg färgpulver med 10 ml destillerad H2O.
- Sterilisera färglösningen till en glasflaska med ett 0,2 μm sprutfilter.
- En dag före injektionen bedövar musen med isofluran enligt ett IACUC-godkänt djurprotokoll. För att utvärdera anestesidjupet, utför ett tå nypreflextest och övervaka andningshastigheten för att säkerställa en andningshastighet på cirka 100-140 andetag per minut.
- Raka håret vid basen av svansen och bakkvartsparten med hjälp av klippare medan musen bedövas. Ta bort håret från djurets ventrala sida och i sidled runt till dorsala sidan strax ovanför bakbensleden (höften).
- Injicera spårämne.
- För varje färginjektion, använd en mikropipett för att överföra 10 μl färglösning till ett mikrocentrifugrör och aspirera hela 10 μl till en 31G-nål fäst vid en 1 ml spruta.
- Injicera 10 μl färglösning subkutant på varje sida av svansbasen där håret klipptes och ladda om mellan injektionerna.
- Ta bort återstående hår genom att applicera en mild depilatory cream via bomullspinne. Var noga med att täcka området mellan baklår och buk.
- Låt depilatorisk kräm inkubera på huden i 3 minuter. Efter inkubation, våt handske hand med varm H2O och försiktigt gnugga depilatory grädde i huden.
- Ta omedelbart bort depilatorisk grädde genom att blöta handsken med varm H2O och gnugga svansbasen och bakkvartsparten. Upprepa tills överskottet av depilatorium har tagits bort, se till att hålla handen våt för att undvika irritation.
- Ta bort kvarvarande nedpilatorium från musen genom att fukta en mjuk trasa eller pappershandduk med varm H2O och torka av nedre delen av musen i en enda rörelse. Undvik en gnuggrörelse för att förhindra nötning eller hudskador på musen.
- Låt musen återhämta sig under en värmelampa och återgå till att hålla.
6. i.LN. Injektion av partiklar
- Följande dag bedöva musen med isofluran enligt ett IACUC-godkänt djurprotokoll.
- Undersök musen för att bekräfta dränering av spårämne i varje inguinal lymfkörtel. Lymfkörtlar ska vara synliga som en mörk fläck nära baklår och buk.
- Förbered partikelinjektionslösning:
- Återanvända partiklar i destillerad H2O vid önskad injektionskoncentration. För varje injektion, använd en mikropipett för att överföra 10 μl partikellösning till ett mikrocentrifugrör.
- Aspirera hela 10 μl i en 31G insulinnål fäst vid en 1 ml spruta.
- Injicera partikeldos:
- När du har visualiserat LN, dra åt huden runt LN med tumme, pekfinger och långfinger för att dra hud hån och möjliggöra kontrollerad placering av injektionsvolymen.
- Närma dig LN med nålen i 90° vinkel mot huden och penetrera huden över det färgade LN till ett djup av 1 mm.
- Injicera långsamt hela volymen. Under injektionen, observera LN volymen genom huden för att bekräfta injektion genom synlig LN utvidgningen.
- Låt musen återhämta sig under en värmelampa och återgå till att hålla eller utföra ytterligare tester.
För relevanta analystekniker(t.ex. histologi, flödescytometri) se JoVE artiklarna 265, 1743 och 3054 och gällande protokoll inom immunologi,kapitlen 5 och 2115-22.
Representative Results
Förväntade resultat för de protokoll som presenteras i detta manuskript kan delas in i tre kategorier: partikelsyntes, djurberedning och partikelinjektion.
Figur 1 visar syntesen och karakteriseringen av biologiskt nedbrytbara polymerpartiklar, stabiliserade av amfifila lipider. Resultaten av emulsionen/avdunstningssyntesprotokollet för lösningsmedel (figur 1A) kan kvalitativt bedömas genom visuell inspektion av de slutliga emulsioner som genereras. partikelpartier bör vara homogena, stabila emulsioner med ogenomskinligt utseende. Komplikationer inkluderar emulsioner som grädde eller flocculate, ofta på grund av felaktig lagring av lipidstabilisatorer. För att undvika denna instabilitet bör lipider förvaras vid -80 °C i uttorkat tillstånd eller i en förseglad flaska som renas med kväve. Kvantitativ bedömning av partikelsyntesen kan utföras med laserdiffraktion eller dynamisk ljusspridning för att analysera storleksfördelningen (figur 1B). Förväntade resultat inkluderar tätt fördelade, monomodala partikelstorlekar, vilket indikerar en enhetlig population av partiklar. Syntesparametrarna som beskrivs i detta manuskript genererar genomsnittliga fördelningar centrerade till cirka 100 nm respektive 3 μm för nanopartiklar respektive mikropartiklar. Ytterligare kvalitativ bedömning av partikelsyntesen kan uppnås genom ändring av ovanstående protokoll för att införliva flera klasser av fluorescerande last. I figur 1Cbekräftar mikroskopibilder av mikropartiklar laddade med en fluorescerande peptid (FITC, grön), ett lipofila färgämne (DiD, rött) och en överlagringsbild (gul) skapandet av partiklar inom önskat storleksområde och inkapsling av peptid inom partikelns volym.
De två första panelerna i figur 2 sammanfattar de förväntade resultaten av djurberedningen för i.LN. injektionsstrategin som beskrivs i detta dokument. Metoden innebär att man markerar ljumsk-LNs genom perifer injektion av en nontoxisk spårämne för att identifiera platsen för efterföljande i.LN. injektion av partiklar(figur 2A)5. Som nämnts kommer dränering av spårämnet efter subkutan injektion vid svansbasen att möjliggöra visualisering av de inguinala LNs(figur 2B)5. Intag av godkända depilatoriska krämer kan utgöra en fara för mössen. Således bör man vara noga med att noggrant ta bort all kräm som appliceras, med särskild uppmärksamhet på tassar och mössens ventrala sida. Depilatory bör avlägsnas med en våt, mjuk trasa eller våt pappershandduk i en enda, slät rörelse. Undvik att gnugga för att ta bort grädde, eftersom detta kan leda till skrubbsår på mössens exponerade hud.
Bekräftelse av lokal leverans till inguinal LN kan utvärderas genom observation eller histologi. LN-volymen kan övervakas visuellt under injektionen som en indikator på framgångsrik injektion. Förväntade resultat inkluderar effektiv lastfördelning i hela LN-strukturen, utan betydande läckage till intilliggande vävnader eller celler. Dessutom, när injicerad vätska förskjuter/späder spårämnet i LN, bör färgkoncentrationen/färgningen bli mindre intensiv efter injektionen. Observation av vävnaden bör avslöja en intakt, men förstorad LN på grund av vätskeinjektion. Potentiella utmaningar inkluderar att injicera för snabbt eller missa LN, som båda kan orsaka eluering av volymen i omgivande subkutan vävnad. Dessa oönskade resultat kan bekräftas genom obduktion eller histologi, där partikel suspension kommer att observeras spridas till celler och vävnad långt från noder riktade för injektion. Däremot skulle ett förväntat resultat vara identifiering av en förstorad ljumsk-LN på grund av inneslutning av partiklar inom LN-strukturen. Histologisk bearbetning av strukna LNs kan slutgiltigt bekräfta leverans av last till lymfoid vävnad, som visas i figurerna 2C och 2D. Observera att partiklarna i figur 2 innehåller fluorescerande last för att möjliggöra visualisering av last under injektionen, liksom under histologisk bearbetning och fluorescerande mikroskopi.
Figur 1. Syntes och karakterisering av lipidstabiliserade partiklar. A) Schematiskt diagram som beskriver syntesen av lipidstabiliserade partiklar som framställs av emulsion/lösningsmedelsavdunstning. B) Storleksfördelningar av mikropartiklar (heldragen linje, diameter = 2,8 μm) och nanopartiklar (streckad linje, diameter = 113 nm). C) Fluorescerande mikroskopibilder av partiklar laddade med fluorescerande märkt peptid och ett fluorescerande partikelfärgämne. Etiketter: peptid (grön) och partikel (röd). Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 2. i.LN. Injektion och distribution av biologiskt nedbrytbara partiklar inom LN. A) Metodik för i.LN. injektion. B) Visualisering av LNs i en mus genom huden (övre bilden) och följande obduktion (nedre bilden)5. C) Histologisk färgning av ett LN som bekräftar nedfall och fördelning av fluorescerande märkta polymermikropartiklar (partiklar, gröna; T-celler, röda; B-celler, blå). D) Fluorescerande märkta nanopartiklar (50 nm, vänster bild) och mikropartiklar (6 μm, höger bild) i LNs 24 timmar efter injektion. Klicka här om du vill visa större bild.
Discussion
Tekniken som beskrivs i detta protokoll tillåter kontrollerad leverans av vacciner till LNs och till LN-residenta antigen presenterar celler. Biomaterial inkapslad last kan lokaliseras inom LN, vilket möjliggör manipulering av doser av en eller flera typer av last som levereras till LN-mikromiljön. Lokalisering och kontrollerad frisättning från polymerpartiklar har visat sig generera ett potent cellulärt och humoralt immunsvar vid betydligt lägre doser än konventionella metoder. Genom manipulering av biomaterialbärarens storlek kan dessutom det primära cellulära bearbetningssättet moduleras mellan direkt upptag av nanopartiklar eller extracellulär lastfrisättning från större mikropartiklar5. Dessa resultat fastställer genomförbarheten av i.LN. biomaterial leverans som en plattform för terapeutisk vaccin leverans.
Syntesen av PLGA-partiklar genom emulsion/lösningsmedelsavdunstning har använts i stor utsträckningi läkemedelsleveransapplikationer 23,24. Således gäller potentiella utmaningar i samband med denna teknik främst framgångsrik identifiering och deponering av vacciner på LN-målplatsen. Även om användningen av spårämne underlättar visualiseringen av de riktade inguinal LNs, är målstorleken och djupet under huden små. Således rekommenderar författarna allotting tid och möss för att öva beredning och injektioner av möss. Underdjurpreparat (dvs. rakning och applicering av depilatory) bör man vara försiktig så att mössen inte skärs på djurets ventrala sida där vinkeln på benet med buken gör huden mer benägen att skadas av klippare. Dessutom bör alla depilatoriska avlägsnas med varmt vatten för att förhindra att djur intar grädden under normalt groomingbeteende. För att öva LN-injektioner kan en högre färgämneskoncentration administreras och öva djur kan avlivas och sedan injiceras flera gånger. Efter injektion kan möss obduceras och storleken på LN från injicerade djur kan jämföras med en oinsatt kontroll LN. En begränsning av denna teknik är den fysiska gränsen för injektionsvolymen som kan laddas in i LN-strukturen. Vårt protokoll föreslår en injektionsvolym på 10 μl hos möss, även om andra studier har rapporterat större injektionsvolymer som är minst så höga som 20 μl.13 Men direkt leverans av vacciner via i.LN. injektion möjliggör dramatisk dossparning så att dessa vacciner i allmänhet inte bör begränsas av volymbegränsningar.
Som nämnts är förändring av partiklarnas fysiska egenskaper(dvs. storlek) en effektiv mekanism för att ändra den eller de resultat som orsakas av biomaterial och inkapslade laster i LN-vävnad. Emulsions-/lösningsmedelsavdunstningsprotokollet kan enkelt ändras för att ändra fysiska eller kemiska egenskaper såsom ytladdning eller ytfunktionalitet och frekvensen av biologisk nedbrytbarhet/lastfrisättning23,24. Till exempel kan frisättningskinetiken justeras genom alternativa polymerkompositioner, och ytfunktionen kan ändras med modifierade lipidkompositioner eller poly (vinylalkohol). Lasten som lastas i partiklar kan lätt manipuleras för att innehålla olika antigener eller adjuvanser för målpatogener. Fördelen med detta tillvägagångssätt uppnås genom kombinationen av i.LN. leverans med lokal, kontrollerad frisättning av last från biomaterial. Denna synergi etablerar en plattform som kan utnyttjas för att effektivt generera adaptiva immunsvar med hjälp av minutdoser och med minskade ospecificerade/systemiska biverkningar.
Disclosures
Produktionskostnader och tillträdesavgifter för dessa artiklar sponsrades delvis av HORIBA, Ltd.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades delvis av PhRMA foundation och en Research and Scholar Award från University of Maryland, College Park. Vi tackar prof. Darrell Irvine för stöd till det inledande arbetet med att slutföra "In situ engineering of the lymph node microenvironment via intranodal injektion av adjuvansfrisättande polymerpartiklar." 5 (på 5)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | 10 mg/ml stock in chloroform |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] ammonium salt (DSPE-PEG) | Avanti Polar Lipids | 880128 | 10 mg/ml stock in chloroform |
| 1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride salt (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890 | 10 mg/ml stock in chloroform |
| Polylactic-co-glycolic acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | P2191 | Lactide:Glycolide (50:50). MW 30,000-60,000 |
| Dichloromethane (DCM) | VWR | BDH1113 | |
| Isoflurane | Vetone | 502017 | |
| Nair | Nair | ||
| Evans blue tracer dye | VWR | AAA16774-09 | |
| U-100 BD Ultra-Fine Short Insulin Syringes, 31 G 5/16 in needle | VWR | BD328418 | |
| Single-Use Needles, BD Medical, 21 G, 1.5 in needle | VWR | BD305167 | |
| Syringes with BD Luer-Lok Tip, BD Medical, 1 ml | VWR | BD309628 | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning, 40 µm | VWR | 21008-949 | |
| Vybrant DiD Cell-Labeling Solution | Invitrogen | V-22887 | |
| Fluoresbrite YG Microspheres 6.00 µm | Polysciences | 17149 | |
| Fluoresbrite YG Microspheres 0.05 µm | Polysciences | 17156 | |
| Ovalbumin, Purified | Worthington Biochemical | LS003056 | |
| Qsonica Sonicator Ultrasonic Processor Q125 | Qsonica | Q125 | 1/8 in diameter microtip probe |
| Ultra-Turrax T 25 digital homogenizer | IKA | YO-04739-22 | 10 G dispersing element |
| Fluorescent Microscope | Olympus | IX-83 | |
| Laser Diffraction Particle Size Distribution Analyzer | Horiba | LA-950 | Including provided cuvette-style glass fraction cell |
| Professional 8685 Peanut Classic Clippers | Wahl |
References
- Swartz, M. A., Hirosue, S., Hubbell, J. A. Engineering Approaches to Immunotherapy. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Adamina, M., et al. Intranodal immunization with a vaccinia virus encoding multiple antigenic epitopes and costimulatory molecules in metastatic melanoma. Mol. Ther. 18, 651-659 (2010).
- Ribas, A., et al. Intra-Lymph Node Prime-Boost Vaccination against Melan A and Tyrosinase for the Treatment of Metastatic Melanoma: Results of a Phase 1. Clinical Trial. Clin. Cancer Res. 17, 2987-2996 (2011).
- Senti, G., et al. Intralymphatic allergen administration renders specific immunotherapy faster and safer: a randomized controlled trial. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 17908-17912 (2008).
- Jewell, C. M., Lopez, S. C. B., Irvine, D. J. In situ engineering of the lymph node microenvironment via intranodal injection of adjuvant-releasing polymer particles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15745-15750 (2011).
- Johansen, P., et al. Antigen kinetics determines immune reactivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5189-5194 (2008).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat. Rev. Immunol. 5, 617-628 (2005).
- Irvine, D. J., Jewell, C. M. Ch. 132. Comprehensive Biomaterials. Ducheyne, P., et al. , (2011).
- Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. Engineering Nano- and Microparticles to Tune Immunity. Adv. Mater. 24, 3724-3746 (2012).
- Reddy, S. T., et al. Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticle vaccines. Tissue Eng. Part A. 14, 734-735 (2008).
- Bershteyn, A., et al. Polymer-supported lipid shells, onions, and flowers. Soft Matter. 4, 1787-1791 (2008).
- Johansen, P., et al. Direct intralymphatic injection of peptide vaccines enhances immunogenicity. Eur. J. Immunol. 35, 568-574 (2005).
- Mohanan, D., et al. Administration routes affect the quality of immune responses: A cross-sectional evaluation of particulate antigen-delivery systems. J. Controlled Release. 147, 342-349 (2010).
- Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. J. Immunol. Methods. 332, 170-174 (2008).
- He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques. J. Vis. Exp. , 1743 (2010).
- Matheu, M. P., Parker, I., Cahalan, M. D. Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice. J. Vis. Exp. e265. , 265 (2007).
- Salmon, H., et al. Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes. J. Vis. Exp. , 3054 (2011).
- Donaldson, J. G. in Current Protocols in Immunology: Immunofluorescence Staining. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Hofman, F. in Current Protocols in Immunology: Immunohistochemistry. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Holmes, K., Lantz, L. M., Fowlkes, B. J., Schmid, I., Giorgi, J. V. in Current Protocols in Immunology: Preparation of Cells and Reagents for Flow Cytometry. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Sharrow, S. O. in Current Protocols in Immunology: Overview of Flow Cytometry. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Sharrow, S. O. in Current Protocols in Immunology: Analysis of Flow Cytometry Data. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Anderson, J. M., Shive, M. S. Biodegradation and biocompatibility of PLA and PLGA microspheres. Adv. Drug Deliv. Rev. 28, 5-24 (1997).
- Danhier, F., et al. PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications. J. Controlled Release. 161, 505-522 (2012).
