Summary
Lymfeknuder er de immunologiske væv, der orkestrerer immunrespons og er et kritisk mål for vacciner. Biomaterialer er blevet anvendt til bedre at målrette lymfeknuder og til at kontrollere leveringen af antigener eller adjuvanser. Dette papir beskriver en teknik, der kombinerer disse ideer til at injicere biokompatible polymerpartikler i lymfeknuder.
Abstract
Generation af adaptiv immunrespons er afhængig af effektiv dræning eller handel med antigen til lymfeknuder til behandling og præsentation af disse fremmede molekyler til T og B lymfocytter. Lymfeknuder er således blevet kritiske mål for nye vacciner og immunterapier. En nylig strategi for at målrette disse væv er direkte lymfeknude injektion af opløselige vaccine komponenter, og kliniske forsøg, der involverer denne teknik har været lovende. Flere biomaterialer strategier er også blevet undersøgt for at forbedre lymfeknude målretning, for eksempel tuning partikelstørrelse for optimal dræning af biomateriale vaccine partikler. I dette papir præsenterer vi en ny metode, der kombinerer direkte lymfeknudeinjektion med bionedbrydelige polymerpartikler, der kan lastes med antigen, adjuvans eller andre vaccinekomponenter. I denne metode syntetiseres polymere mikropartikler eller nanopartikler af en modificeret dobbelt emulsionsprotokol, der indeholder lipidstabilisatorer. Partikelegenskaber(f.eks. størrelse, lastbelastning) bekræftes af henholdsvis laserdiffraktion og fluorescerende mikroskopi. Muselymfeknuder identificeres derefter ved perifer injektion af et ikke-giftigt sporstof, der muliggør visualisering af målinjektionsstedet og efterfølgende aflejring af polymerpartikler i lymfeknuder. Denne teknik giver direkte kontrol over doser og kombinationer af biomaterialer og vaccinekomponenter leveret til lymfeknuder og kan udnyttes i udviklingen af nye biomaterialebaserede vacciner.
Introduction
Lymfeknuderne (LNs) er kommandocentrene i immunsystemet. På dette immunologiske sted, antigen præsentere celler prime naive lymfocytter mod specifikke udenlandske antigener til at aktivere cellulære og humoristisk immunrespons. LNs er således blevet et attraktivt mål for levering af vacciner og immunterapier. Desværre resulterer de fleste vaccinestrategier i ineffektiv, forbigående levering af antigen og adjuvanser til lymfoidvævet1. Tilgange, der forbedrer målretningen og fastholdelsen af vaccinekomponenter i LN'er, kan derfor have en betydelig indvirkning på styrken og effektiviteten af nye vacciner.
En strategi for at omgå udfordringen med LN målretning, der har vist stor interesse i nye kliniske forsøg er direkte, intra-LN (i.LN.) injektion2-4. Disse forsøg ansat ultralyd vejledning til at levere vacciner til LNs som en simpel ambulant procedure. Sammenlignet med traditionelle perifere injektionsveje resulterede denne tilgang i betydelig dosisbesparende og forbedret effekt i terapeutiske sammenhænge, herunder allergier og kræft2-4. Disse undersøgelser anvendte i.LN. injektion af opløselige vacciner(dvs. biomaterialer-fri), som hurtigt blev ryddet ved lymfedrænage. Derfor blev flere injektioner- eller cyklusser af flere injektioner - administreret for at opnå disse imponerende terapeutiske virkninger. Forbedret fastholdelse i LN kan forbedre samspillet mellem antigen og/eller adjuvans- og immunceller, hvilket yderligere forbedrer styrken af immuncellepriming. Dette potentiale understøttes af nylige undersøgelser, der viser kinetik af antigen og adjuvans levering spiller en afgørende rolle i fastsættelsen af den specifikke immunrespons genereret5-7. Yderligere, lokalisere og minimere medicin og vaccine doser kunne reducere eller fjerne systemiske virkninger, såsom kronisk inflammation.
Biomaterialer er blevet undersøgt grundigt for at øge styrken og effektiviteten af vacciner1,8,9. Indkapsling i eller adsorption på biomateriale luftfartsselskaber kan fysisk beskytte last fra nedbrydning og overvinde opløselighed begrænsninger. Et andet bemærkelsesværdigt træk ved biomaterialebærere, såsom polymere mikro- eller nanopartikler, er evnen til at overbelaste flere klasser af last og efterfølgende frigive disse laster over kontrollerede intervaller. Men en betydelig begrænsning, der fortsat hindrer biomateriale vacciner og immunterapi in vivo er ineffektiv målretning af immunceller og begrænset handel med lymfeknuder. For eksempel udviser perifer injektion af biomaterialevacciner gennem konventionelle ruter(f.eks. intradermal, intramuskulær) typisk dårlig LN-målretning, idet op til 99% af det injicerede materiale forbliver på injektionsstedet4,10. For nylig er størrelsen af biomateriale vaccine luftfartsselskaber blevet indstillet til at forbedre præferencehandel eller dræning af disse vacciner til LNs gennem interstitiel flow8,10. Disse fremskridt har ført til øget cellulære og humoristisk immunrespons, understreger betydningen af målretning og teknik LN miljøet for nye vacciner.
Dette papir præsenterer en vaccination protokol, der kombinerer lipid-stabiliseret polymer partikler og i.LN levering til at generere kontrolleret frigivelse vaccine depoter5,11. Baseret på nylige undersøgelser, der anvender kirurgiske teknikker til i.LN. hos mus6,7,12,13, udviklede vi en hurtig, ikke-kirurgisk strategi for injektion af biomaterialevacciner hos små dyr5. Kombination af i.LN. levering med biomaterialevaccinebærere, der kraftigt forbedrede CD8 T-celleresponsen inden for 7 dage efter en enkelt injektion af kontrollerede frigivelsesvaccinedepoter5. Der blev også genereret en stærk humoristisk reaktion(dvs. antistoftitlere); begge forbedringer var forbundet med øget tilbageholdelse af vaccinekomponenter i lymfeknuder, der blev medieret ved kontrolleret frigivelse fra biomaterialebærerne. Interessant nok ændrede størrelsen af vaccinepartikler skæbnen for disse materialer en gang i LNs: nanoskalapartikler viste øget direkte optagelse af celler, mens større mikropartikler forblev i det ekstracellulære LN-miljø og frigivne last(f.eks. adjuvans), der blev taget op af LN-residente antigen, der præsenterede celler5. Disse data tyder på to veje, der kan udnyttes til nye vacciner ved at kontrollere størrelsen af biomaterialer injiceres i.LN.
I denne artikel syntetiseres bionedbrydelige lipidstabiliserede polymerpartikler (mikro- og nanoskala) ved hjælp af en modificeret dobbeltemulsionsstrategi5,11. Partikelegenskaber er kendetegnet ved laser diffraktion og mikroskopi. Disse partikler injiceres derefter direkte i lyskede LNs identificeret nonsurgically ved hjælp af en fælles, ikke-toksisk sporstoffarvestof 14. Efter injektion analyse af LNs ved histologi eller flow cytometri kan bruges til at kontrollere fordelingen af partikler i LN miljøet, samt til at overvåge cellulære optagelse og fastholdelse af partikler over tid. For protokoller beskriver histologiske behandling og flow cytometry, læsere er henvist til de seneste JoVE artikler og tidsskrift rapporter15-22. Typiske resultater viser lokale LN målretning af disse depoter, der kan udnyttes til at opnå potente, effektive immunrespons eller til at skræddersy immunitet for mål patogener.
Protocol
Alle dyreforsøg i denne protokol blev afsluttet i overensstemmelse med føderale, statslige og lokale retningslinjer og ved hjælp af protokoller, der blev gennemgået og godkendt af University of Maryland's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Syntese af Lipid-stabiliserede mikro- og nanopartikler
- I et eller flere glasglas på 7 ml skal du kombinere DOPC- og DSPE-PEG- og DOTAP-lipider ved et 60:20:20-molarforhold for at forberede en master lipidblanding.
- At syntetisere en enkelt prøve: Overførsel 242,9 μl, 287,4 μl og 71,9 μl af henholdsvis DOPC, DSPE-PEG og DOTAP til hætteglasset ved hjælp af 2 ml serologiske rør af glas.
- At syntetisere flere prøver: Multiplicer hvert lipidvolumen ovenfor med antallet af prøver og kombiner til et enkelt hætteglas, og overfør derefter lige aliquots af denne lipidblanding til hætteglas, der svarer til hver prøve, der skal fremstilles.
- Tør lipider under en blid strøm af nitrogengas i 10 minutter, eller sted i vakuumovn natten over.
- I et enkelt, tomt 20 ml glasglas opløses 80 mg PLGA i 5 ml dichlormethan for hver partikelprøve for at generere en 16 mg/ml polymer stamopløsning.
- Der tilsættes 5 ml polymeropløsning til det eller de hætteglas, der indeholder de tørrede lipider, hætten og hvirvlerne i 30 sek.
- Sådan syntetiseres mikropartikler:
- Begynd at sonikere den organiske fase, der indeholder polymer, lipid og anden vanduopløselig last på is ved 12 W ved hjælp af en sonicator.
- Skab emulsionen med vand i olie (w/o) ved at anvende en pipette til tilsætning af 500 μl destilleret H2O eller H2O, der indeholder 1 mg peptid, protein eller anden vandopløselig last.
- Fortsæt sonikering i 30 sek ved 12 W på is, forsigtigt rokke hætteglasset op og ned og fra side til side omkring sonicator spidsen for at sikre fuldstændig emulgering.
- Skab emulsionen med vand i olie i vand (w/o/w) ved at hælde w/o-emulsionen i 40 ml H2O i et 150 ml bægerglas.
- Homogeniser i 3 min ved 16.000 omdrejninger i minuttet ved hjælp af en digital homogenisator.
- Tilsæt en magnetisk rørestang, overfør bægeret til en omrørsplade, og lad w/o/w emulsionen omrøre natten over for at fjerne det overskydende opløsningsmiddel.
- Sådan syntetiseres nanopartikler:
- Begynd at sonikere den organiske fase, der indeholder polymer, lipid og anden vanduopløselig last på is ved 14 W.
- Skab w/o-emulsionen ved at bruge en pipette til at tilsætte 500 μl destilleret H2O eller H2O, der indeholder 1 mg peptid, protein eller anden vandopløselig last.
- Fortsæt sonikering i 30 sek ved 14 W på is.
- W/o/w emulsionen hældes ved at hælde w/o-emulsionen til 40 ml H2O i et 150 ml bægerglas og sonikere i 5 min. ved 16 W på is. Vip forsigtigt hætteglasset op og ned og fra side til side omkring sonicatorspidsen for at sikre fuldstændig emulgering.
- Tilsæt en magnetisk rørestang, overfør kolben til en omrøreplade, og lad w/o/w emulsionen omrøre natten over for at fjerne det overskydende opløsningsmiddel.
- Næste morgen vaskes og opsamles partikler:
- Der hældes emulsion gennem 40 μm Nylon mesh cell si i et 50 ml konisk rør.
- Centrifugepartikler i 5 minutter ved 5.000 x g for mikropartikler eller 5 min ved 24.000 x g for nanopartikler.
- Dekanter supernatant og vask partikler ved genuspending i 1 ml H2O.
- Suspenderede partikler overføres til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Centrifuge i 5 min ved 5.000 x g for mikropartikler eller 5 min ved 24.500 x g for nanopartikler.
- Partiklerne vaskes to gange mere ved at fjerne supernatant, genbruge i 1 ml H2O og centrifugere som i trin 1.6.5. Efter vask suspenderes partikler i 1 ml H2O til øjeblikkelig brug, eller lyophilize til udvidet opbevaring.
2. Måling af det sammenfattende udbytte
- Preweigh en tom 20 ml glas hætteglas. Der tilsættes 100 μl partikelaffjedring til det præweighedglas, efter at der er pipett op og ned med en mikropipette, der skal blandes.
- Lyophilize partiklerne eller tør under en blid strøm af kvælstof.
- Afvejes hætteglasset, der indeholder den tørrede polymer. Partikeludbyttet bestemmes i hætteglasset ved at trække hætteglassets oprindelige vægt fra massen af det hætteglas, der indeholder de tørrede partikler.
- Det samlede partikeludbytte bestemmes ved at multiplicere partikelmassen i hætteglasset med fortyndingsfaktoren. For at bestemme procentydelsen skal partikelmassen divideres med den maksimale teoretiske inputmasse og ganges med 100%.
3. Bestemmelse af partikelstørrelse
- Rengør den medfølgende cuvette-stil glasfraktionscelle ved at fylde med deioniseret vand og tørre med vatpind med bomuldsspids. 10 ml destilleret H2O overføres til den rensede fraktionscelle, der tilsættes magnetisk mikrorørstang, og fraktionscellen lægges i partikelstørrelsesanalysatorens cellebeslag.
- Juster den magnetiske omrøringshastighed i partikelanalysatoren for at opnå fuldstændig blanding i fraktionscellen og lukke rumdøren.
- Juster laserne til brøkcellen ved hjælp af instrumentsoftwaregrænsefladen.
- Brug instrumentsoftwaregrænsefladen til at registrere en baselineaflæsning med brøkcellen, der kun indeholder destilleret H2O.
- Pipette den oprindelige partikel suspension op og ned med en mikropipette til at blande.
- Der pipettes 10 μl partikelsuspension (typisk ca. 0,5 mg) ind i fraktionscellen. Sørg for, at mængden af partikelprøve, der tilsættes cellen, er tilstrækkelig til at generere signalstyrke i det relevante område som angivet på instrumentsoftwaregrænsefladen. Den faktiske masse af partikler, der kræves, afhænger af procentudbyttet og partikelprøvens optiske egenskaber.
- Luk partikelstørrelsesanalysatorrummets dør, og mål partikelstørrelsen ved hjælp af et brydningsindeks på 1,60 for PLGA.
- Brug softwaregrænsefladen til at beregne partikeldiameteren ved hjælp af et talgrundlag.
4. Visualisering af partikler
- Pipette partikel suspension op og ned med micropipette at blande. Partikelaffjedringen fortyndes til 1 mg/ml i deioniseret vand.
- Forbered et mikroskopschebane ved at tilføje 3 μl fortyndet partikelaffjedring og montere et coverlip i en 45°-vinkel for at undgå bobledannelse. Placer diaset på mikroskopstadiet og billedet ved hjælp af de relevante filtersæt for hver fluorescerende last.
5. Forberedelse af mus til i.LN. injektion
- Forbered sporstofopløsning:
- Der fremstilles en 0,1% (w/v) opløsning af røbestof ved at opløse 10 mg farvestofpulver med 10 ml destilleret H2O.
- Farveopløsningen steriliseres i et glasglas ved hjælp af et 0,2 μm sprøjtefilter.
- En dag før injektion bedøves musen ved hjælp af isoflurane i henhold til en IACUC-godkendt dyreprotokol. For at evaluere anæstesidybden skal du udføre en tåklemreflekstest og overvåge åndedrætsfrekvensen for at sikre en åndedrætsfrekvens på ca. 100-140 vejrtrækninger i minuttet.
- Barber hår i bunden af hale og bagfjerding ved hjælp af klippere, mens musen er bedøvet. Fjern hår fra dyrets ventrale side og sideværts rundt til den dorsale side lige over leddet på bagbenet (hofte).
- Injicere sporstof farvestof.
- For hver farvestofindsprøjtning skal der anvendes en mikropipette til at overføre 10 μl farvestofopløsning til et mikrocentrifugerør og suge hele 10 μl ind i en 31G-nål, der er fastgjort til en 1 ml sprøjte.
- Der injiceres 10 μl farvestofopløsning subkutant på hver side af halebasen, hvor håret blev klippet, og der genindlæses mellem injektionerne.
- Fjern resterende hår ved at anvende en mild depilatory creme via vatpinde. Sørg for at belægge området mellem baglåret og maven.
- Lad depilatory creme at inkubere på huden i 3 min. Efter inkubation, våd behandsket hånd med varm H2O og forsigtigt gnide depilatory creme i huden.
- Fjern straks depilatory creme ved betændt behandsket hånd med varm H2O og gnide hale base og bagfjerding. Gentag indtil overskydende depilatory er fjernet, og sørg for at holde hånden våd for at undgå irritation.
- Fjern resterende depilatory fra musen ved at befurde en blød klud eller køkkenrulle med varm H2O og i en enkelt bevægelse, tørre nederste del af musen. Undgå en gnidning bevægelse for at forhindre slid eller hudskader på musen.
- Lad musen komme sig under en varmelampe og vende tilbage til bedriften.
6. i.LN. Injektion af partikler
- Den følgende dag bedøves musen ved hjælp af isoflurane i henhold til en IACUC-godkendt dyreprotokol.
- Undersøg musen for at bekræfte dræning af sporstoffarve i hver lyskelymfeknude. Lymfeknuden skal være synlig som et mørkt sted nær baglåret og maven.
- Forbered partikelindsprøjtningsopløsning:
- Genopstømmede partikler i destilleret H2O ved den ønskede injektionskoncentration. Til hver injektion skal du bruge en mikropipette til at overføre 10 μl partikelopløsning til et mikrocentrifugerør.
- 10 μl ind i en 31G insulinnål, der er fastgjort til en 1 ml sprøjte.
- Indsprøjt partikeldosis:
- Efter visualisering af LN skal du stramme huden omkring LN ved hjælp af tommelfinger, pegefinger og langfinger for at trække hud hån og give mulighed for kontrolleret placering af injektionsvolumen.
- Indflyvning af LN med nålen i en 90° vinkel til huden og trænge ind i huden over den farvede LN til en dybde på 1 mm.
- Injicer langsomt hele lydstyrken. Under injektionen observeres LN-lydstyrken gennem huden for at bekræfte injektionen ved synlig LN-udvidelse.
- Lad musen komme sig under en varmelampe og vende tilbage til at holde eller foretage yderligere test.
For relevante analyseteknikker (f.eks. histologi, flowcytometri) se JoVE-artikel 265, 1743 og 3054 og gældende protokoller i immunologi, kapitel 5 og 2115-22.
Representative Results
Forventede resultater for de protokoller, der præsenteres i dette manuskript, kan opdeles i tre kategorier: partikelsyntese, dyreforberedelse og partikelindsprøjtning.
Figur 1 viser syntesen og karakteriseringen af bionedbrydelige polymerpartikler, stabiliseret af amfitemor lipider. Resultaterne af protokollen for synteseprotokollen for emulsion/opløsningsmiddelfordampning (figur 1A) kan vurderes kvalitativt ved visuel inspektion af de endelige emulsioner, der genereres; partikelpartier skal være homogene, stabile emulsioner med et uigennemsigtigt udseende. Komplikationer omfatter emulsioner, at fløde eller flocculate, ofte på grund af forkert opbevaring af lipid stabilisatorer. For at undgå denne ustabilitet bør lipider opbevares ved -80 °C i dehydreret tilstand eller i et forseglet hætteglas, der renses med nitrogen. Kvantitativ vurdering af partikelsyntese kan udføres ved hjælp af laserdiffraktion eller dynamisk lysspredning for at analysere størrelsesfordelingen (Figur 1B). De forventede resultater omfatter tæt fordelte monomodale partikelstørrelser, hvilket indikerer en ensartet population af partikler. De synteseparametre, der er beskrevet i dette manuskript, genererer nummererede gennemsnitlige fordelinger centreret på henholdsvis ca. 100 nm eller 3 μm for nanopartikler og mikropartikler. Yderligere kvalitativ vurdering af partikelsyntese kan opnås ved ændring af ovennævnte protokol for at indarbejde flere klasser af fluorescerende last. I figur 1Cbekræfter mikroskopibilleder af mikropartikler fyldt med en fluorescerende peptid (FITC, grøn), et lipofilt farvestof (DiD, rødt) og et overlejringsbillede (gul) skabelsen af partikler inden for det ønskede størrelsesområde og indkapsling af peptid i partikelvolumen.
De to første paneler i figur 2 opsummerer de forventede resultater af dyreforberedelsen af i.LN. injektionsstrategien, der er beskrevet i dette dokument. Metoden indebærer mærkning af lyskesyre-LN'er ved perifer injektion af et ikke-giftigt sporstof for at identificere placeringen af efterfølgende i.LN. injektion af partikler (figur 2A)5. Som nævnt vil dræning af sporstoffarvet efter subkutan injektion i halebasen muliggøre visualisering af lyske-LNs (Figur 2B)5. Indtagelse af godkendte depilatoriske cremer kan udgøre en fare for musene. Således skal man sørge for grundigt at fjerne al anvendt creme, idet der lægges særlig vægt på poter og musenes ventrale side. Depilatory skal fjernes ved hjælp af en våd, blød klud eller vådt køkkenrulle i en enkelt, glat bevægelse. Undgå at gnide for at fjerne fløde, da dette kan føre til slid på musens udsatte hud.
Bekræftelse af lokal levering til inguinal LN kan evalueres gennem observation eller histologi. LN-lydstyrken kan overvåges visuelt under injektionen som en indikator for vellykket injektion. Forventede resultater omfatter effektiv lastfordeling i hele LN-strukturen uden væsentlig lækage til tilstødende væv eller celler. Da injiceret væske desuden fortrænger/fortynder røbestof i LN, bør farvekoncentrationen/farvningen blive mindre intens efter injektionen. Observation af vævet bør afsløre en intakt, men udvidet LN på grund af væskeindsprøjtning. Potentielle udfordringer omfatter injektion for hurtigt eller mangler LN, som begge kan forårsage eluering af volumen i omkringliggende subkutane væv. Disse uønskede resultater kan bekræftes ved obduktion eller histologi, hvor partikelaffjedringen vil blive observeret spredes til celler og væv fjernt fra noder målrettet til injektion. I modsætning hertil ville et forventet resultat være identifikationen af en forstørret lyskeal LN på grund af indeslutning af partikler inden for LN-strukturen. Histologiske behandling af punktafgiftspligtige LN'er kan definitivt bekræfte levering af gods til lymfoidvævet, som vist i figur 2C og 2D. Bemærk, at partiklerne i figur 2 indeholder fluorescerende last for at muliggøre visualisering af lasten under injektionen samt under histologisk behandling og fluorescerende mikroskopi.
Figur 1. Syntese og karakterisering af Lipid stabiliserede partikler. A) Skematisk diagram, der beskriver syntesen af lipidstabiliserede partikler fremstillet ved emulsion/opløsningsmiddelfordampning. B)Størrelsesfordelinger af mikropartikler (fast linje, diameter = 2,8 μm) og nanopartikler (stiplet linje, diameter = 113 nm). C) Fluorescerende mikroskopibilleder af partikler fyldt med fluorescerende peptid og et fluorescerende partikelfarvestof. Labels: peptid (grøn) og partikel (rød). Klik her for at se større billede.
Figur 2. i.LN. Injektion og distribution af bionedbrydelige partikler i LN. A)Metode til i.LN. injektion. B) Visualisering af LN'er i en mus gennem huden (øverste billede) og efter obduktion (lavere billede)5. C)Histologiske plettering af en LN, der bekræfter deposition og distribution af fluorescerende mærkede polymermikropartikler (partikler, grøn; T-celler, rød; B-celler, blå). D) Fluorescerende-mærkede nanopartikler (50 nm, venstre billede) og mikropartikler (6 μm, højre billede) i LNs 24 timer efter injektion. Klik her for at se større billede.
Discussion
Den teknik, der er beskrevet i denne protokol giver mulighed for kontrolleret levering af vacciner til LNs og til LN-hjemmehørende antigen præsentere celler. Biomateriale indkapslet last kan lokaliseres inden for LN, hvilket muliggør manipulation af doserne af en eller flere typer gods, der leveres til LN-mikromiljøet. Lokaliseringen og den kontrollerede frigivelse fra polymerpartikler har vist sig at generere en potent cellulær og humoristisk immunrespons ved betydeligt lavere doser end konventionelle tilgange. Gennem manipulation af biomaterialebærerstørrelse kan den primære form for cellulær behandling desuden moduleres mellem direkte optagelse af nanopartikler eller ekstracellulær lastudslip fra større mikropartikler5. Disse resultater fastslår gennemførligheden af i.LN. biomateriale levering som en platform for terapeutisk vaccine levering.
Syntesen af PLGA-partikler ved emulsion/opløsningsmiddelfordampning har i vid udstrækning været anvendt i lægemiddelleveringsapplikationer23,24. Potentielle udfordringer i forbindelse med denne teknik vedrører således hovedsagelig vellykket identifikation og deposition af vacciner på LN-målstedet. Selv om brugen af sporstof letter visualiseringen af de målrettede lyskede LNs, målstørrelsen og dybden under huden er små. Således anbefaler forfatterne tildelingstid og mus til at øve præparatet og injektionerne af mus. Under dyreforberedelse (dvs. barbering og påføring af depilatory) skal man sørge for ikke at skære musene på dyrets ventrale side, hvor vinklen på benet med maven gør huden mere tilbøjelig til skade fra klippere. Derudover bør alle depilatory fjernes med varmt vand for at forhindre dyr i at indtage cremen under normal plejeadfærd. At praktisere LN injektioner, en højere sporstof koncentration kan administreres og praksis dyr kan aflives, og derefter injiceres flere gange. Efter injektion mus kan necropsied og størrelsen af LNs fra injicerede dyr kan sammenlignes med en ikke injiceret kontrol LN. En begrænsning af denne teknik er den fysiske grænse for injektionsvolumen, der kan indlæses i LN-strukturen. Vores protokol foreslår en injektionsvolumen på 10 μl hos mus, selv om andre undersøgelser har rapporteret større injektionsmængder på mindst 20 μl.13 Men direkte levering af vacciner via i.LN. injektion tillader dramatisk dosisbesparende, så disse vacciners funktion generelt ikke bør begrænses af volumenbegrænsninger.
Som nævnt er ændring af partiklernes fysiske egenskab(dvs. størrelse) en effektiv mekanisme til at ændre den eller de resultater, der fremkaldes af biomaterialer og indkapslede laster i LN-væv. Protokollen til fordampning af emulsion/opløsningsmiddel kan let ændres for at ændre fysiske eller kemiske egenskaber såsom overfladeladning eller funktionalitet og hastigheden af bionedbrydning/lastudslip23,24. For eksempel kan frigivelsen kinetik være tunet gennem alternative polymer kompositioner, og overfladefunktion kan ændres ved hjælp af modificerede lipid kompositioner eller poly (vinyl alkohol). Lasten lastet i partikler kan let manipuleres til at indeholde forskellige antigener eller adjuvanser for målpatogener. Fordelen ved denne tilgang opnås gennem kombinationen af i.LN. levering med lokal, kontrolleret frigivelse af gods fra biomaterialer. Denne synergi etablerer en platform, der kan udnyttes til effektivt at generere adaptive immunresponser ved hjælp af små doser og med reducerede uspecifikke / systemiske bivirkninger.
Disclosures
Produktionsomkostningerne og adgangsgebyrerne for disse artikler blev delvist sponsoreret af HORIBA, Ltd.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist finansieret af PhRMA foundation og en Research and Scholar Award fra University of Maryland, College Park. Vi takker prof. Darrell Irvine for støtte til det indledende arbejde, der blev udført i færdiggørelsen af "In situ-konstruktion af lymfeknudemikroenronment via intranodal injektion af adjuvansfri polymerpartikler." 5 1 1 1
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | 10 mg/ml stock in chloroform |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] ammonium salt (DSPE-PEG) | Avanti Polar Lipids | 880128 | 10 mg/ml stock in chloroform |
| 1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride salt (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890 | 10 mg/ml stock in chloroform |
| Polylactic-co-glycolic acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | P2191 | Lactide:Glycolide (50:50). MW 30,000-60,000 |
| Dichloromethane (DCM) | VWR | BDH1113 | |
| Isoflurane | Vetone | 502017 | |
| Nair | Nair | ||
| Evans blue tracer dye | VWR | AAA16774-09 | |
| U-100 BD Ultra-Fine Short Insulin Syringes, 31 G 5/16 in needle | VWR | BD328418 | |
| Single-Use Needles, BD Medical, 21 G, 1.5 in needle | VWR | BD305167 | |
| Syringes with BD Luer-Lok Tip, BD Medical, 1 ml | VWR | BD309628 | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning, 40 µm | VWR | 21008-949 | |
| Vybrant DiD Cell-Labeling Solution | Invitrogen | V-22887 | |
| Fluoresbrite YG Microspheres 6.00 µm | Polysciences | 17149 | |
| Fluoresbrite YG Microspheres 0.05 µm | Polysciences | 17156 | |
| Ovalbumin, Purified | Worthington Biochemical | LS003056 | |
| Qsonica Sonicator Ultrasonic Processor Q125 | Qsonica | Q125 | 1/8 in diameter microtip probe |
| Ultra-Turrax T 25 digital homogenizer | IKA | YO-04739-22 | 10 G dispersing element |
| Fluorescent Microscope | Olympus | IX-83 | |
| Laser Diffraction Particle Size Distribution Analyzer | Horiba | LA-950 | Including provided cuvette-style glass fraction cell |
| Professional 8685 Peanut Classic Clippers | Wahl |
References
- Swartz, M. A., Hirosue, S., Hubbell, J. A. Engineering Approaches to Immunotherapy. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Adamina, M., et al. Intranodal immunization with a vaccinia virus encoding multiple antigenic epitopes and costimulatory molecules in metastatic melanoma. Mol. Ther. 18, 651-659 (2010).
- Ribas, A., et al. Intra-Lymph Node Prime-Boost Vaccination against Melan A and Tyrosinase for the Treatment of Metastatic Melanoma: Results of a Phase 1. Clinical Trial. Clin. Cancer Res. 17, 2987-2996 (2011).
- Senti, G., et al. Intralymphatic allergen administration renders specific immunotherapy faster and safer: a randomized controlled trial. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 17908-17912 (2008).
- Jewell, C. M., Lopez, S. C. B., Irvine, D. J. In situ engineering of the lymph node microenvironment via intranodal injection of adjuvant-releasing polymer particles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15745-15750 (2011).
- Johansen, P., et al. Antigen kinetics determines immune reactivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5189-5194 (2008).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat. Rev. Immunol. 5, 617-628 (2005).
- Irvine, D. J., Jewell, C. M. Ch. 132. Comprehensive Biomaterials. Ducheyne, P., et al. , (2011).
- Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. Engineering Nano- and Microparticles to Tune Immunity. Adv. Mater. 24, 3724-3746 (2012).
- Reddy, S. T., et al. Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticle vaccines. Tissue Eng. Part A. 14, 734-735 (2008).
- Bershteyn, A., et al. Polymer-supported lipid shells, onions, and flowers. Soft Matter. 4, 1787-1791 (2008).
- Johansen, P., et al. Direct intralymphatic injection of peptide vaccines enhances immunogenicity. Eur. J. Immunol. 35, 568-574 (2005).
- Mohanan, D., et al. Administration routes affect the quality of immune responses: A cross-sectional evaluation of particulate antigen-delivery systems. J. Controlled Release. 147, 342-349 (2010).
- Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. J. Immunol. Methods. 332, 170-174 (2008).
- He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques. J. Vis. Exp. , 1743 (2010).
- Matheu, M. P., Parker, I., Cahalan, M. D. Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice. J. Vis. Exp. e265. , 265 (2007).
- Salmon, H., et al. Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes. J. Vis. Exp. , 3054 (2011).
- Donaldson, J. G. in Current Protocols in Immunology: Immunofluorescence Staining. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Hofman, F. in Current Protocols in Immunology: Immunohistochemistry. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Holmes, K., Lantz, L. M., Fowlkes, B. J., Schmid, I., Giorgi, J. V. in Current Protocols in Immunology: Preparation of Cells and Reagents for Flow Cytometry. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Sharrow, S. O. in Current Protocols in Immunology: Overview of Flow Cytometry. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Sharrow, S. O. in Current Protocols in Immunology: Analysis of Flow Cytometry Data. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Anderson, J. M., Shive, M. S. Biodegradation and biocompatibility of PLA and PLGA microspheres. Adv. Drug Deliv. Rev. 28, 5-24 (1997).
- Danhier, F., et al. PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications. J. Controlled Release. 161, 505-522 (2012).
