Summary
نحن تصف النهج التصوير التي نستخدمها لتحقيق توزيع والتنقل من البروتينات الفلورية transfected المقيمين في الشبكة الإندوبلازمية (ER) عن طريق التصوير متحد البؤر الخلايا الحية. نحن أيضا تحليل ultrastructurally تأثير التعبير عنها على بنية هذا الحيز التحت خلوية.
Abstract
الدهون والبروتينات في الخلايا حقيقية النواة يتم تبادل مستمر بين المقصورات الخلية، على الرغم من أن هذه تحتفظ تكوينها مميزة وظائف على الرغم من مرور interorganelle الجزيئية مكثفة. التقنيات الموضحة في هذه الورقة هي وسيلة قوية لدراسة البروتين والدهون التنقل والاتجار في الجسم الحي في بيئتهم والفسيولوجية. مضان الانتعاش بعد photobleaching من (FRAP) وخسارة في مضان photobleaching من (FLIP) وتستخدم على نطاق واسع تقنيات التصوير الخلية الحية لدراسة الاتجار داخل الخلايا عن طريق إكسو التقامي المسار، والاستمرارية بين العضيات أو subcompartments، وتشكيل مجمعات البروتين، والبروتين التعريب في microdomains الدهون، والتي يمكن ملاحظتها في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية. القيود المفروضة على هذه المناهج هي أساسا نتيجة لاستخدام البروتينات الانصهار الفلورسنت، وتشمل سلبياتها المحتملة مصطنعة الإفراط في التعبير عنايون في الخلايا وإمكانية الاختلافات في للطي والتعريب من البروتينات الموسومة والأم. أخيرا، وكما الحد من قرار المجهر الضوئي (حوالي 200 نانومتر) لا يسمح التحقيق في هيكل غرامة من ER أو subcompartments المحددة التي يمكن أن تنشأ في الخلايا تحت الضغط (أي نقص الأكسجة، وإدارة المخدرات، والإفراط في التعبير من عبر الغشاء البروتينات ER المقيم) أو في ظل ظروف مرضية، ونحن الجمع بين التصوير الخلية الحية من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مثقف مع التركيبية يحلل على أساس نقل الإلكترون المجهري.
Introduction
اكتشاف بروتين الفلورية الخضراء (GFP) ومشتقاته الطيفية، وتطور مواز من مضان المجهري، وفتحت آفاقا جديدة تماما للتحقيق في سلوك البروتين في الخلايا. تقنيات مثل الانتعاش بعد مضان photobleaching من (FRAP) وخسارة في مضان photobleaching من (FLIP)، والتي هي ممكنة بسبب القدرة الذاتية للfluorophores لإطفاء مضان بهم تحت إضاءة مكثفة، تقوم على مبائر التصوير الخلية الحية واستخدام transfected البروتينات الفلورية الانصهار 1-3. وتستخدم على نطاق واسع لتقييم ليس فقط توطين البروتينات، ولكن أيضا قدرتهم على التنقل والنقل الحويصلي، والتي يمكن أن تكشف عن أدلة مهمة بشأن وظيفتها 4.
ميزة فريدة من الخلايا حقيقية النواة هو وجود حجرات داخل الخلايا التي تحتوي على الدهون والبروتين التراكيب محددة. على الرغم من العضيات هي isolat جسدياإد، فإنها تحتاج إلى التواصل مع بعضهم البعض وتبادل المكونات الجزيئية من أجل الحفاظ على التوازن الخلوية. تضمن مسار إفرازية أن البروتينات والدهون توليفها في ER وصول إلى الوجهة النهائية الصحيحة التي تمارس وظيفتها. يمكن أيضا أن تكون متصلا عضيات داخل الخلايا عن طريق مواقع الاتصال الديناميكية التي تسمح الجزيئات (الدهون) التي يتم تبادلها مباشرة بين المقصورات. علاوة على ذلك، العديد من البروتينات قد لتجميعها في مجمعات مغايرة التغصن كبيرة أو المرتبطة بالأنواع الدهون محددة (الطوافات الدهنية / microdomains) لكى تصبح نشطة وظيفيا أو ليتم نقلها إلى وجهتها النهائية. كل هذه الجوانب البيولوجية تؤثر بشكل كبير على الخصائص الحركية للبروتينات، وبالتالي يمكن أن يتم التحقيق بشكل مناسب عن طريق التقنيات الموضحة أدناه.
وقد استخدمت على نطاق واسع مجموعتنا FRAP والوجه جنبا إلى جنب مع المجهر الإلكتروني من أجل دراسة الهندسة المعمارية لائحة وشبه المختلفةالمجالات. لائحة هي المحطة الأولى من مسار إفرازية، ويلعب دورا رئيسيا في البروتين والدهون الفرز 5. بل هو عضية ديناميكية للغاية التي تعكس وظائف عديدة ومختلفة (أي البروتين والدهون والاتجار الحيوي والبروتين للطي، كا 2 + تخزين والإفراج عنهم، والتمثيل الغذائي أجنبي بيولوجيا) نطاقات فرعية متميزة. ومع ذلك، على الرغم من أنها شكليا، مكانيا، ومتميزة وظيفيا، وهذه المجالات هي مستمرة مع بعضها البعض، ويمكن تعديل الوفرة النسبية في الخلايا تحت الظروف الفسيولوجية والمرضية. أشهرها والمجالات عادة منفصلة مكانيا من ER هي المغلف النووية، وER ناعمة وخشنة، ولكن نحن وآخرون أظهرت أن هناك هياكل ER مع بنية أكثر تفصيلا وتنظيم ثلاثية الأبعاد في مختلف أنواع الخلايا و الأنسجة تحت الظروف الفسيولوجية التي يمكن أيضا أن يتسبب من خلال محفزات المجهدة مثل نقص الأكسجة، المخدراتالإدارة، أو الإفراط في التعبير عن-ER المقيمين البروتينات عبر الغشاء 2،6 (والمراجع فيه).
كما أننا أظهرنا مؤخرا وجود مثل هذه الهياكل في نماذج خلية من الأمراض التي تصيب الإنسان 1،7. تنشأ من صهاريج مكدسة من ER على نحو سلس، قدمت لهم اسم الجماعية من الشبكة الإندوبلازمية الملساء تنظيم (OSER) في عام 2003 6، على الرغم من أنها معروفة أيضا باسم karmellae، صفاحات، وبلوراني ER على أساس الهندسة المعمارية الخاصة بهم والتي، مثل بهم الحجم، ويمكن أن تختلف. بعد و transfected الخلايا مع GFP تنصهر إلى المنطقة عصاري خلوي من (TA) البروتينات-ER المقيمين (د EGFP-ER) رست الذيل، والميل dimerizing ضعيفة من GFP في العابرة يغير بشكل كبير من تنظيم وهيكل ER. وأظهرت التجارب FRAP وFLIP أن د EGFP-ER هو حر لنشر ضمن OSERs، وحقيقة أنه ينتقل من لائحة شبكي لOSER والعكس بالعكس <م /> يشير إلى أن المجاميع مستمرة مع شبكي ER المحيطة بها. وقد سمح لنا التحليل التركيبية لربط البيانات مضان مع وصفا مفصلا لOSER العمارة وتنظيم على مستوى النانو: تصنع دائما OSERs تتكون من أكوام من صهاريج تقرن من ER نحو سلس ولكن قد يكون لها أشكال مختلفة من التنظيم المكاني، مثل ترتيب بانتظام الجيبية صفائف أو جدلات، أو سداسية "بلوراني" صفائف أنبوبي. هذه تؤدي إلى إعادة ترتيب الأشكال التضاريسية مكعب 8 الذي، كما تم العثور في الخلايا تحت الظروف الفسيولوجية 9 والضغوط التالية مثل نقص الأكسجة 10، 11 العلاج من تعاطي المخدرات، والسرطان 9، قد تنطوي على إمكانات كبيرة كعلامات التركيبية.
بعد هذه المظاهرة الأولى باستخدام GFP البروتينات الانصهار، استخدمنا تجارب التصوير لتحليل انتشار المجالات ER استجابة للعلاجات الدوائية 12، ASSESS ميل البروتينات الفلورية لoligomerise 13 في الخلايا، والتحقيق في دور متحولة، ALS المرتبطة البروتين TA في تشكيل المجاميع داخل الخلايا ER المنشأ التي قد تكون ذات صلة 1،8 المرضية لها. فقد قيل أن تشكيل المجاميع داخل الخلايا (والذي يحدث في كثير من الأمراض العصبية 14) قد تكون آلية وقائية تهدف إلى منع التفاعلات بين البروتينات متحولة السامة ومكونات الخلية المحيطة 15.
ما يلي هو وصف لمجموعة من الأساليب المجهر الضوئي والإلكترون عن التحقيق الذي يبني-C محطة تندس المجالات مسعور في غشاء من لائحة، وتحليل سلوكهم دينامية وآثار على مدى تعبير على نطاق ER الهندسة المعمارية في الخلايا المستزرعة (انظر الشكل 1 لمخطط انسيابي للبروتوكول التجريبية).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. البلازميد، زراعة الخلايا، وترنسفكأيشن مع ER نيون البروتينات
- البلازميد المستخدمة في هذه الدراسة يتكون من نسخة محسنة من GFP تنصهر في دورته C-محطة للمنطقة الذيل من الإسوي ER من الفئران السيتوكروم ب (5) (مختصر هنا ب (5)) عبر تسلسل رابط. يحتوي على منطقة الذيل تسلسل كامل (Pro94-Asp134) الذي لا يزال الغشاء المرتبطة بعد انشقاق التربسين من الأم ب (5)، بما في ذلك انظمة الدفاع الصاروخى التكتيكى 17 بقايا (المجال عبر الغشاء)، ويحيط بها سلاسل القطبية المنبع والمصب (يو بي اس وDPS) . يتكون رابط من حاتمة MYC تليها [(الغليسين) 4 سر] 3، ويتم إدراج [كدنا بأكمله في مواقع Hind3-Xba1 من الثدييات ناقلات التعبير pCDNA3. وقد وصفت تفاصيل بناء هذا البلازميد في منشور السابقة التي يشار إليها باسم GFP-ER 16.
- تنمو الخلايا COS-7 في Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ فيتامصل ل البقري، 2 مم L-الجلوتامين، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 10٪ CO 2.
- ترنسفكأيشن. لوحة 3 × 10 5 الخلايا على ساترة الزجاج جولة في لوحة 6 جيدا و، في اليوم التالي، بالنقل مع نظام JetPEI كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة. نلاحظ أن نسبة JetPEI / DNA الأمثل وقد تم اختبار من أجل تحديد الحد الأقصى لكفاءة ترنسفكأيشن اعتمادا على البلازميد وخط الخلية المستخدمة: في حالتنا، وJetPEI: نسبة الحمض النووي 2:1 يؤدي إلى 70-80٪ كفاءة ترنسفكأيشن.
2. يعيش الإسفار متحد البؤر المجهري الضوئي
- التصوير الخلية الحية. وضع ساترة التي كانت المصنفة على الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل إلى غرفة خلية ثقافة الصلب لمدة 24 ملم coverslips مليئة DMEM ث / س الفينول الأحمر، على أن تستكمل مع FBS 10٪، 2 مم L-الجلوتامين، 1٪ القلم / بكتيريا، 25 ملي HEPES ، 50 ميكروغرام / مل سيكلوهيكسيميد و1:100 OxyFluor لمنع عينات من photobleaching من. وmicroscop SP5 مبائريستخدم البريد مجهزة CO 2 الحاضنة التي تسيطر عليها درجة الحرارة (37 درجة مئوية و 5٪ CO 2) لتجارب التصوير الخلية الحية، مع د GFP-ER يجري تصور باستخدام الليزر 488 نانومتر، ومرشح 525/50 تمريرة الفرقة الانبعاثات.
- مضان الانتعاش بعد photobleaching من (FRAP). رسم المنطقة ذات الاهتمام (ROI)، المقابلة لبنية OSER، والتبييض باستخدام التكرارات و20 مجموعة من 488 نانومتر (100٪ من ليزر الأرجون 30 ميغاواط، أي ما يعادل 5.5-6 μW في العينة) و 405 نانومتر (60٪ من 30 ميغاواط ديود ليزر 405، المقابلة ل11.6 μW في العينة) الليزر الذي يؤدي في تجربتنا لphotobleaching من كفاءة وسرعة.
- تسجيل انتعاش مضان في رويس ابيض من خلال اتخاذ إطار واحد كل 10 ثانية لمدة 10 دقيقة (بالتوقيت بكسل = 1.61 μsec / مقصف).
- فقدان مضان في photobleaching من (FLIP). رسم ROI المقابلة لبنية OSER، والتبييض كما هو موضح أعلاه. يتم تكرار تبيض كل 30 ثانية،وتسجل الصور آخر التبييض كل 10 ثانية لمدة 30 دقيقة (بالتوقيت بكسل = 1.61 μsec / مقصف).
- FRAP FLIP وتحليل. ويتم تحليل كافة الصور باستخدام برنامج ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html ). في التجارب FRAP، يتم قياس الانتعاش مضان من العائد على الاستثمار ابيض مع مرور الوقت وتطبيع مضان مجموعه خلية ابيض، والتي يتم التحقق دائما أن تكون ثابتة على مر الزمن.
- للتجارب FLIP، رسم العائد على الاستثمار خارج OSER ابيض وتغطي الخلية بأكملها. قياس كثافة مضان بمرور الوقت وتطبيع إلى مستويات مضان من العائد على الاستثمار مرسومة على خلية غير مقصور من أجل تصحيح أي انخفاض في مضان الناجمة عن التصوير نفسها.
- في جميع التجارب، تطرح إشارة الخلفية (تحديد في منطقة خارج الخلايا) من شدة الفلورسنت من رويس. أخيرا، رسم النتائج باستخدام غرامaphPad بريزم البرمجيات.
3. تحليل التركيبية بواسطة وسائل نقل المجهر الإلكتروني
نظرا لسمية كثير من الكواشف، وجميع الإجراءات ينبغي أن يتم ارتداء مختبر المناسبة. معطف وقفازات تحت غطاء الدخان.
- بعد إزالة ساترة من طبق بيتري، وإصلاح الخلايا المتبقية نمت على الجزء السفلي من الطبق كما أحادي الطبقة باستخدام تصفيتها 2٪ في غلوتارالدهيد 0.1 M العازلة كاكوديلات، ودرجة الحموضة 7.4، لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تتخلص من الخلايا باستخدام مكشطة تفلون ونقلها إلى 1.5 مل أنابيب إيبندورف. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 9000 ز لمدة 10 دقيقة. إزالة طاف، إضافة تثبيتي الطازجة، وترك بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- غسل الكريات مع المخزن المؤقت، ثم إصلاح آخر مع محلول 1٪ رباعي أكسيد الأوزميوم في المخزن كاكوديلات لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- شطف مع المياه MilliQ، وككل وصمة عار مع1٪ خلات اليورانيل في الماء المقطر لمدة تتراوح بين 20-60 دقيقة.
- يذوى العينات في زيادة سلسلة الايثانول (70٪، 80٪، 90٪، 100٪، و 100٪ لمدة 10 دقيقة لكل منهما)، ويغسل مرتين لفترة وجيزة في أكسيد البروبيلين (15 دقيقة لكل منهما).
- التسلل العينات في خليط من أكسيد البروبيلين + EPON (1:1) (من 2 ساعة ليلة وضحاها).
- تغرس في EPON راتنجات الايبوكسي الشفاء عند 60 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 24 ساعة.
- القسم الكتل الراتنج قلص يدويا باستخدام مشراح مستدق LEICA UC6 مجهزة 45 درجة الماس سكين للحصول على أقسام مع سمك 60-70 نانومتر. جمع المقاطع على شبكات النحاس 300 شبكة.
- وصمة عار المقاطع على الشبكة مع محلول مشبع من خلات اليورانيل (20 دقيقة) وتؤدي سترات (7 دقائق)، ويغسل جيدا للشبكات عن طريق غمر في الماء المقطر تصفيتها ثنائية، والسماح لهم لتجف في درجة حرارة الغرفة.
- ويلاحظ شبكات الملون باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ TECNAI G2، ويتم التقاط الصور باستخدام بوتام محمولة على كاميرا CCD في تكبير النهائية مختلفة (تتراوح عادة من 6،000-39،000 X).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 2 دراسة FRAP سبيل المثال التنقل البروتين. ويتجلى تنقل د البروتين EGFP-ER من الانتعاش السريع بعد مضان photobleaching من OSERs في المبيض. للتحليل الكمي، وقد استمدت النصف الساعة وجزء المحمول من البيانات المقاسة معمليا عن طريق تركيب المعادلة monoexponential التالية:
F (ر) = F + آخر (آخر جمعة تفصيل-F) (ر 1 ه / τ)
حيث F هي آخر إشارة مضان بعد photobleaching من، F تفصيل هو الحد الأقصى لقيمة الانتعاش مضان التي يتم التوصل بعد التبييض، ور وقت التسجيل وτ ثابت الوقت.
يرجى ملاحظة أهمية الحصول على الصور من دون بكسل المشبعة يمكن أن يغير من الانتعاش مضان، وبالتالي، فإن التحليل التنقل البروتين. طق أيضا ضرورية لتطبيع دائما إشارة مضان في العائد على الاستثمار مبيضة على مضان مجموعه نفس الخلية من أجل النظر في الاختلافات كثافة مضان بسبب تبيض خلال الحصول على الصور أو تغييرات صغيرة في الطائرة التركيز.
ويرد مثال على التجربة FLIP لدراسة الاستمرارية بين المقصورات داخل الخلايا في الشكل 3. ترتبط OSERs جسديا مع بقية ER كما يدل على ذلك إفراغ التدريجي للER عندما يتم تبييضها المجال OSER باستمرار.
لتحليل سليم، يجب تجنب اقتناء بكسل المشبعة (انظر أعلاه)، علاوة على ذلك، يجب أن يتم تعيين المعلمات الاستحواذ مع القوى الليزر عند أدنى مستوى ممكن من أجل تجنب photobleaching من المقرر أن الحصول على الصور. لهذا السبب ينصح بشدة لصورة خلية غير مقصور في نفس المجال الذي سيتم استخدامه لتطبيع إشارة مضان من ج ابيضالذراع.
جميع التجارب يجب أن تؤديها في وجود سيكلوهيكسيميد، مثبط الترجمة، من أجل تجنب أي زيادة في إشارة ER مضان (وبالتالي مجموع مضان) بسبب البروتين الحيوي.
أظهرت المجهر انتقال الإلكترون أن المجاميع الفلورسنت لوحظ في الخلايا المستزرعة transfected مع د EGFP-ER تمثل بقع على نحو سلس وبالارض صهاريج ER التي نظمت مكانيا أنفسهم في هندستها 3D محددة جيدا تصنف على أساس أنماطها: خطية أو منحنية أكوام (غالبا ما المرتبطة المغلف النووية، لا يظهر) (الشكلان 4A وباء) التي قد تكون مستمرة مع مناطق ER الجيبية (الشكل 4A)؛ يتم تنظيم الأغشية في بعض المناطق في السياج مع التماثل مربعة أو سداسية (بلوراني ER، لا يظهر ). يتم فصل صهاريج المجاورة من خلال طبقة رقيقة من الإلكترون، قليلاالسيتوبلازم الكثيفة حوالي 11 نانومتر سميكة الذي هو مستمر مع السيتوبلازم المحيطة المجاميع.
الشكل 1. تدفق الرسم البياني لإجراء التجارب. و transfected والخلايا المستزرعة الأولى مع jetPEI (انظر البروتوكول) من أجل الإفراط في التعبير عن انصهار بروتين فلوري من الفائدة. بعد 24 ساعة، يتم تصور الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل الحي ويتم تنفيذ FRAP FLIP والتجارب باستخدام المجهر متحد البؤر مجهزة التحكم في درجة حرارته CO 2 الحاضنة، ويتم تصدير الصور المسجلة وتحليلها باستخدام البرنامج المناسب (على سبيل المثال يماغيج). لتحليل التركيبية، يتم إصلاح الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل، مكعبات وجزءا لا يتجزأ في EPON الايبوكسي الكتل الراتنج. ويتم الحصول على أقسام سامسونج باستخدام سكين الماس، تم جمعها على جopper شبكات، ولاحظ تحت المجهر الإلكتروني النافذ. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 2. التجربة FRAP باستخدام COS-7 خلايا عابر مع د EGFP-ER. A) واثنين من الهياكل ابيض OSER (رويس الحمراء)، وكانت قد سجلت الانتعاش مضان بمرور الوقت. الانتعاش مضان واضحة يمكن أن يتم الكشف عن 1 دقيقة آخر التبييض، وإشارة زيادات أخرى في وقت لاحق 4 دقيقة (شريط نطاق 10 ميكرون) B): التحليل الكمي للتجربة FRAP تظهر انتعاش الشوط الأول وجزء المحمول من د EGFP -ER البروتين. الكلورينإك هنا لعرض أكبر شخصية
الرقم 3. التجربة FLIP باستخدام COS-7 خلايا عابر مع د EGFP-ER. أ) تبيض المستمر لOSER (المشار إليها بواسطة ROI الحمراء) يؤدي إلى انخفاض تدريجي في مضان في بقية ER وفي هياكل OSER أخرى داخل نفس الخلية (المشار إليها بواسطة ROI الأصفر). السهم الأصفر يشير إلى وجود جزء من خلية غير مقصور فيه إشارة مضان هو ثابت على مر الزمن. (شريط مقياس 10 ميكرون). ب) التحليل الكمي من التجربة FLIP. انقر هنا لعرض أكبر شخصية
الشكل 4. بعد التثبيت والتضمين، لوحظت الخلايا معربا عن مستويات عالية من د EGFP-ER التي يمكن من خلالها الكشف عن هياكل OSER بواسطة المجهر الضوئي مضان من خلال المجهر الإلكتروني النافذ. أ) عرض التكبير أدنى من جزء من السيتوبلازم من خلية تحتوي على OSER تتألف من صهاريج مكدسة والأغشية الجيبية متموجة. الميتوكوندريا (M) يمكن أن ينظر تتجمع حول الهياكل OSER، في حين ريبوسوم تزيين فقط الأغشية من صهاريج الأبعد (السهام وأقحم). مساحة الإلكترون الكثيفة 11 نانومتر سميكة بين الأغشية مستمر مع السيتوبلازم (السهم وأقحم) (L = الجسيمات الحالة / (السيارات) phagosomes) (مقياس شريط 1.5 ميكرومتر؛ أقحم 0.25 ميكرون). ب) OSER يمكن تشكيلها بواسطة رقائقي ER: أي رزمة من بالارض ER صهاريج التي يمكن أن تكون مستمرة أو fragmented في ظهورها في أقسام رقيقة. حويصلات في مهدها من صهاريج الأبعد من المكدس يمكن ملاحظتها في بعض الأحيان (النجمة) (مساء، غشاء البلازما) (شريط مقياس 150 نانومتر).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد استخدمت البروتوكولات والنهج التصوير وصفها في هذه الورقة للتحقيق في التوزيع والتنقل من transfected TA البروتينات الفلورية المقيمين في لائحة من الخلايا الحية. قمنا بتحليل أيضا تأثير الإفراط في التعبير من هذه البروتينات على بنية هذا الحيز التحت خلوية من خلال التحليلات التركيبية.
الجمع بين الخلية الحية التصوير متحد البؤر المجهر الإلكتروني ويمثل هو وسيلة قوية جدا من التحقيق في الخصائص الحيوية للبروتينات، ويمكن أن توفر معلومات هامة بشأن وظيفة البروتين. الأساليب المذكورة ليست مضيعة للوقت (عادة ثلاثة أيام عمل)، وتطوير العديد من التطبيقات البرمجية سهلة الاستخدام لالتقاط صور والتحليل يجعل مقرها photobleaching من، التصوير الخلية الحية بسيط نسبيا.
القيد الرئيسي من هذه التقنيات هو استخدام البروتينات الانصهار الفلورسنت لأنالعلامة الفلورسنت يمكن أن تؤثر على للطي السليم و / أو تجميع البروتين من الفائدة. بالإضافة إلى ذلك، الإفراط في التعبير يمكن أن يغير سلوك transfected والبروتينات الموسومة fluorescently، وبالتالي قد لا تعكس الخصائص الحقيقية من البروتينات الذاتية، ولكن هذا يمكن التغلب عليها باستخدام الخلايا محرض وستابلي فيه مستوى التعبير يمكن أن يكون التضمين على وجه التحديد للحصول على مستويات قابلة للمقارنة مع تلك من البروتين 1،7 الذاتية. وقد تم توثيق ميل ضباط لoligomerise على نطاق واسع، ويمكن أن يغير كثيرا من السلوك (أي حركية، غير المرغوب فيها تفاعلات البروتين البروتين وتشكيل المجاميع) من البروتينات خيالية. لذا ينبغي النظر في استخدام الأمثل البروتينات الفلورية أحادى 17.
الجانب الحاسم آخر من الدراسات التصويرية الديناميكية باستخدام مضان وphotobleaching من هو الوقت اللازم لتبييض مضان بكفاءة وقياس مضان إعادةcovery (وبالتالي التنقل البروتين) على وجه التحديد، والذي يعتمد أيضا على المنطقة من العائد على الاستثمار وسمك خلية محلية. إذا كان البروتين GFP الموسومة نظرا لديها معامل الانتشار عالية، يمكن أن تحدث خلال نشر تبيض وبالتالي تتداخل مع قياسات وقت الانتعاش. من أجل الحصول على تبيض سريعة وفعالة، فمن المستحسن أن "تكبير" وظيفة (إن وجد) وخط ليزر أكثر من استخدامها. على الرغم من أن استخدام وحدة نمطية مسح سريع (أي ماسح ضوئي الرنانة) يمكن أن تحسن كثيرا من سرعة التصوير خلال مرحلة الانتعاش من تجربة، في أيدينا كما أنه يقلل إلى حد كبير كفاءة التبييض. ومع ذلك، يمكن لأنظمة المسح الضوئي البديلة (مثل قرص الغزل مجهزة مع جهاز photobleaching من مخصص)، وأشعة الليزر أقوى تحسين كل من الكفاءة والسرعة تبيض الاستحواذ.
معظم البروتينات الفلورية المستخدمة في FRAP FLIP والتجارب تظهر قدرا من photobleaching من عكسها وBLInking التي يجب مراعاتها عند تنفيذ تحليل كمي. التقلبات بين الدول الفلورسنت ومظلمة تحدث في الثانية إلى دقيقة والنطاق الزمني. لEGFP، وقد تبين أنه خلال التجارب التبييض، والاختلافات مضان قد تنطوي على أقل من 10٪ من الجزيئات، وبالتالي في هذا البروتوكول هذه الظاهرة لا يكاد يذكر. إذا كان يتم الاحتفاظ بجميع الشروط المستمر، وهذا سوف يعرض وجود تحيز المستمر في النتائج. إذا تم استخدام البروتينات الفلورية الأخرى، والتي جزء عكسها هو أعلى بكثير (أي YFP)، أو لكشف وتقييم photobleaching من العودة إلى الوراء، وهذا يمكن أن يتم ذلك عن طريق قياس مضان الانتعاش بعد photobleaching من في الخلية الحية بأكملها، وإذا لوحظ انتعاش هذا يمكن أن يكون إلا نتيجة لphotobleaching من العودة إلى الوراء 18.
السمية المحتملة للضوء خلال التجارب هو عامل حاسم آخر، لا سيما بسبب photobleaching من يتطلب إضاءة قوية. فمن أهلا وسهلال المعروف أن fluorophores متحمس تميل إلى التفاعل مع الأكسجين لإنتاج الجذور الحرة التي يمكن أن تؤثر على مختلف العمليات داخل الخلايا وحتى بقاء الخلية 19، ولذا فمن الضروري إقامة توازن بين تبيض كفاءة والحد الأدنى من الضيائية، علاوة على ذلك، ينبغي دائما أن يتم التحقق بقاء الخلية بعد تجارب التصوير الخلية الحية. نظرا لتسجيل الوقت قصير، ونحن لم تنظر في تأثير سمية جينية قصيرة الطول الموجي للضوء (405 نانومتر) في المثال الوارد وصفها في هذه الورقة، ولكن إذا كان هناك حاجة التجربة لفترة أطول، لا ينبغي أن تستخدم خط ليزر 405 نانومتر.
اخترنا عدم استخدام نهج مترابط لنقل الإلكترون المجهري بسبب الطبيعة غير المتجانسة للهندسة المعمارية OSER وحقيقة اننا نريد لمراقبة العديد من الخلايا (والهياكل) ممكن. تنوع هيكل غرامة من المجاميع البروتين في الخلايا قد يكون سمة أساسية من الأمراض المختلفة، ونحن مهتمون في الحصول على مجموعة واسعة من ساmples، في حين أن نهج مترابط يسمح للمراقبة عدد أقل من الأحداث خلال نفس الفترة الزمنية. ومع ذلك، ينبغي المتلازم المجهر الضوئي الإلكترون (CLEM) يكون الخيار الأول عند التحقيق في الأحداث في الهياكل التي لا يمكن التعرف عليها بسهولة (مثل النطاقات الفرعية ER أقل بروزا) أو في عدد محدود من الخلايا (مثل الخلايا المحقونة الصغيرة). تجدر الإشارة إلى أن تميزت تجاربنا من قبل على درجة عالية من الكفاءة ترنسفكأيشن (و transfected لا يقل عن 30٪ من الخلايا)، وإلا فإن إمكانية مراقبة الهياكل OSER noncorrelatively محدودة للغاية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
المؤلفون ممتنون لFONDAZIONE Filarete على مساعدتها ودعمها في نشر هذا المقال. نود أيضا أن نشكر سنترو دي EUROPEO Nanomedicina لاستخدام TECNAI G2 المجهر الإلكتروني النافذ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 41966029 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) w/o phenol red | Invitrogen | 31053028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10270106 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine 200 mM solution | Invitrogen | 25030-024 | |
| jetPEI | Polyplus Transfection | PP10110 | |
| OxyFluor | Oxyrase Inc. | OF-0005 | |
| Glutaraldehyde Grade I | Sigma Aldrich | G5882 | |
| Sodium Cacodylate Trihydrate | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Osmium Tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Science | 19150 | |
| Uranyl Acetate Dihydrate | Sigma Aldrich | 73943 | slightly radioactive |
| Propylene Oxide | Sigma-Aldrich | 82320 | |
| EPON embedding medium kit | Sigma-Aldrich | 45359-1EA-F | |
| Lead Citrate | Electron Microscopy Science | 17800 | |
| Bench top centrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| Spectral Confocal Microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CO2 Microscope Cage Incubation System | OkoLab | ||
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 ° | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai G2 | |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc | ||
| Steel culture cell chamber for 24 mm coverslip | Bioscience Tools | CSC-25 | |
| Electron Microscopy grids | Electron Microscopy Science | G300Cu |
References
- Fasana, E., et al. A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum. FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).
- Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux. Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).
- Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum. J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).
- Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. Bi-directional protein transport between the ER and. 20, 87-123 (2004).
- Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).
- Papiani, G., et al. Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome. J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).
- Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization. J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).
- Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. Y. The dynamic ER: experimental approaches and current questions. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 409-414 (2005).
- Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells. Neuron. 12, 327-342 (1994).
- Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital. Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).
- Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells. J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13, 643-649 (2012).
- Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres. J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic proteins in neurodegenerative disease. Science. 296, 1991-1995 (2002).
- Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases. EMBO J. 27, 336-349 (2008).
- Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways. Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).
- Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).
- Michida, T., et al. Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats. Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).
