Summary
Neuroblast migration är ett avgörande steg i postnatal neurogenes. Protokollet som beskrivs här kan användas för att undersöka rollen av kandidat regulatorer av neuroblast migration genom användning av DNA / liten hårnål RNA (shRNA) nucleofection och en 3D-migration assay med neuroblaster som isolerats från gnagare postnatal rostral migratory stream.
Abstract
Den subventrikulära zonen (SVZ) belägen i sidoväggen av de laterala ventriklarna spelar en grundläggande roll i vuxen neurogenes. I detta begränsade område i hjärnan, neurala stamceller föröka sig och ständigt genererar neuroblaster som flyttar tangentiellt i kedjor längs rostralt vandrande ström (RMS) för att nå luktbulben (OB). En gång i OB, neuroblaster byta till radiell migration och differentiera till mogna nervceller som kan införliva i den redan existerande neuronala nätverk. Korrekt migration neuroblast är ett grundläggande steg i neurogenesis, säkerställa en korrekt funktionell mognad av nyfödda nervceller. Med tanke på möjligheten av SVZ-härledda neuroblaster att rikta skadade områden i hjärnan, undersöker de intracellulära mekanismerna bakom deras rörlighet kommer inte bara att öka förståelsen av neurogenes, men kan också främja utvecklingen av neuroregenerative strategier.
Detta manuskript beskriver en detaljeradprotokoll för transfektion av primära gnagare RMS postnatal neuroblaster och analysen av deras rörlighet med hjälp av en 3D-vitro migrationstest på rekapitulera sitt läge migration observerats in vivo. Både rått-och mus-neuroblaster kan vara snabbt och effektivt transfekterats via nucleofection med antingen plasmid-DNA, liten hårnål (sh) RNA eller kort interfererande (si) RNA oligos targeting gener av intresse. För att analysera migration, är nucleofected celler reaggregated i "hängande droppar" och sedan inbäddade i en tredimensionell matris. Nucleofection i sig inte väsentligt försämrar migration av neuroblaster. Farmakologisk behandling av nucleofected och reaggregated neuroblaster kan också göras för att studera betydelsen av signalvägar som är involverade i neuroblast migration.
Introduction
I den postnatal däggdjurshjärnan, generering av nya nervceller (neurogenes) sker under hela livet och är begränsad till två neurogena nischer: subventrikulära zonen (SVZ) av de laterala ventriklarna och subgranular zonen i gyrus dentatus i hippocampus 1. Flera nya studier har visat den viktiga roll som vuxen neurogenes underlätta inlärning och minnesuppgifter 2,3. Vidare bevis för spridning och rekrytering av neurala stamceller efter hjärnskada 4-7 behandlas möjligheten att farmakologisk aktivering av neurogenes i neurala reparation.
Postnatal neurogenes är strikt reglerad i alla dess faser, som inkluderar neurala progenitorceller proliferation, migration, differentiering, överlevnad, och sista synaptisk integration av nyfödda nervceller 8. Neurala stamceller (neuroblaster) härrör från stamceller i SVZ vandrar över långa sträckor genom den rostrala migrationsström (RMS) mot luktbulben (OB) där de mogna till funktionella nervceller 9. Flyttneuroblaster är övervägande unipolär, med en långsträckt cellkroppen sträcker sig en enda ledande process. Dessa celler rör sig i kedjor i ett kollektivt sätt, glider över varandra 10. Migration är ett avgörande steg för den efterföljande mognaden av SVZ-härledda stamfäder till fungerande nervceller 11 och styrs av flera faktorer och väglednings molekyler inklusive: polysialylated neural celladhesionsmolekyl (PSA-NCAM) 12, Ephrins 13, integriner 14, Slits 15, tillväxtfaktorer 16 och neurotransmittorer 17 emellertid de molekylära mekanismerna bakom denna process är inte helt klarlagda. Undersöka de intracellulära signalvägar som reglerar neuroblast migration kommer inte bara att ge en bättre förståelse av den vuxna neurogenes, men kommer också att bidra till utvecklingen av nya terapeutiskatillvägagångssätt för att främja hjärnans reparation.
Detta manuskript beskriver ett detaljerat protokoll för att studera rollen av kandidat regulatorer av neuroblast migration in vitro med hjälp nucleofection och en 3D-analys migration. Nucleofection är en cell transfektion teknik baserad på ett förbättrat förfarande för elektroporering. Cell-typ specifik elektrisk ström och nucleofection lösning möjliggör överföring av polyanjoniska makromolekyler såsom DNA och shRNA vektorer och siRNA oligonukleotider direkt in i cellkärnan och tillstånds transfektion av långsamt dela eller mitotiskt inaktiva celler som foster-och däggdjurs nervceller 18. Denna metod är snabb, relativt enkelt att utföra och resulterar i mycket reproducerbar transfektion av ett brett spektrum av celltyper inklusive primära neuroblaster och neuroner 19-21.
Dissociation av RMS-vävnad möjliggör isolering av flyttande neuroblaster, som framgångsrikt kan nucleofected med DNA / SHRNA-vektorer eller siRNA oligos riktar gener av intresse. Efter nucleofection är neuroblaster reaggregated i hängande droppar och därefter bäddas in i en tredimensionell Matrigel matris. Dessa förhållanden gör att neuroblaster att migrera ut ur cellaggregat rekapitulera migrationsläget observerats in vivo, vilket ger ett utmärkt modellsystem för att undersöka signalvägar involverade i neuroblast migration och för att bedöma inverkan av farmakologisk behandling på motilitet av dessa celler.
Protocol
Detta förfarande är i enlighet med den brittiska Home Office förordningarna (Animal Scientific Rutiner lagen, 1986). Forskare bör följa de riktlinjer som fastställts och godkänts av deras institutionella och nationella djur reglerande organisationer.
1. Dissektion och Dissociation av Rat RMS neuroblaster
- Förbered de lösningar som krävs för RMS dissekering och dissociation:
Dissektion medium (100 ml)
Hanks balanserade saltlösning (HBSS) - 98,5 ml
5 M HEPES pH 7,4 till 0,5 ml
Penicillin-streptomycin (10.000 enheter / ml och 10000 pg / ml) - 1 ml
Dissociation medium (2 ml)
HBSS - 1,760 ml
10x trypsin (2,5%) - 200 | il
DNAse1 (1 mg / ml) - 40 | il
Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) + 10% fetalt kalvserum (FCS) (40 ml)
DMEM -36 ml
FCS - 4 ml
Komplett medium (12 ml)
Neurobasal medel - 11.46 ml
B27 Tillägg - 250 ^
L-glutamin (200 mM) - 125 | il
Glukos (45%) - 165 | il
2. Filter-sterilisera DMEM + 10% FCS och det kompletta mediet och preequilibrate dem i en 37 ° C / 5% CO2 inkubator.
- Dissection
- Offra en P6-P7 råtta kull (ca 12 valpar) genom cervikal dislokation och decapitate med sax.
- Gör ett anteroposterior snitt i huden längs med mitt sagittal sutur från näsan till lillhjärnan med ett skalpellblad. Bort skinnet på och upprepa samma snitt längs skallen.
- Ta försiktigt bort de kraniala klaffar med pincett och försiktigt bort hjärnan med en spatel, var noga med att inkludera de lukt glödlampor.
- Skär den mest kaudala tredjedel av hjärnan och kassera den.
- Chop the hjärnvävnad i 1,4 mm tjocka koronala skivor med hjälp av en vävnad chopper.
- Placera skivor i rätter som innehåller kallt dissektion medium och försiktigt separera dem med hjälp av en nål.
- RMS visas som en triangulär, genomskinligt område i centrum av OB-avsnitt och som ett litet, cirkulärt område i mer caudal hjärnan skivor. Skär RMS ur varje skiva med en mikrokirurgisk kniv, se till att undvika inklusive omgivande vävnad. I P7 råttungar, oftast ~ 8 mest rostralt skivor (inklusive OB) innehåller RMS.
- Samla RMS fragment med en plast pasteurpipett och placera dem i en liten skål med kallt dissektion medium på is.
- När dissektion är slutförd, överför RMS-fragment i en 15 ml tub med en plast-pipett. Lämna fragment som avsätts i botten av röret.
- Dissociation
- Byt ut dissektion medium med 2 ml dissociation medium.
- Mal sönder RMS-fragmenten genom att försiktigt pipetting fragmentet fjädring upp och ner ca 10x med hjälp av en P1000 pipett.
- Låt röret med vävnadsfragment i ett 37 ° C vattenbad under 2 minuter.
- Pipet lösningen igen 10x och se till att fragmenten har dissocierade (suspensionen ska bli grumlig).
- Inaktivera trypsin genom tillsats av 5 ml av förvärmd DMEM + 10% FCS.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 433 x g under 5 min.
- Under tiden alikvot (dock mängden DNA / siRNA kan kräva vanligen 3-5 mikrogram DNA / shRNA eller 5-9 mikrogram siRNA oligo per nucleofection, optimering) den önskade mängden siRNA / DNA i Eppendorf-rör.
- Avlägsna överskott av medium och resuspendera cellpelleten genom försiktig pipettering i 5 ml av förvärmd DMEM + 10% FCS.
- Utför ett celltal. Räkna med ~ 1 x 10 6 celler per råtta valp hjärna. Ett minimum av 2,5 x 10 6 celler erfordras för varje nucleofection medanoptimala resultat uppnås med hjälp av 3-4 x 10 6 celler per nucleofection.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 433 x g under 5 min. Se till att ta bort så mycket medel som möjligt.
2. Nucleofection
- Omedelbart resuspendera cellpelleten i råtta (eller mus om du använder musceller) neuron nucleofection lösning som tidigare odlades vid rumstemperatur. Använd 100 l per nucleofection Anm. Vanligen en råtta kull på 12 valpar är tillräcklig för att utföra 4 nucleofections och en mus kull (12 valpar) är tillräcklig för att utföra 2 nucleofections.
- Överför 100 | il av cellsuspension till varje Eppendorf-rör innehållande siRNA / DNA och blanda försiktigt 2-3x genom pipettering med en P200 pipett.
- Lägg provet (cell-DNA/siRNA suspension) till botten av den nucleofectioncuvette, noga med att undvika bubblor.
- Nucleofect använder programmet G-013 (för råttceller) eller O-005 (förmusceller). En nucleofection tar ungefär fem sekunder.
- Snabbt lägga 1 ml förvärmd DMEM + 10% FCS till nucleofected provet.
- Upprepa steg 2,4 och 2,5 för alla andra prover. Anmärkning: för optimalt resultat bör hela nucleofection förfarandet inte vara längre än 5 minuter.
- Överför varje prov i ett 15 ml rör innehållande 5 ml förvärmd DMEM + 10% FCS med hjälp av plastpipett tillhandahålls av nucleofection sats. Undvik att överföra någon cellulära skräp till röret.
- Centrifugera proverna vid 433 x g under 5 min.
- Ta försiktigt bort allt överflödigt medium och suspendera pelleten i 25-30 pl förvärmd DMEM + 10% FCS med hjälp av en P20 pipett. Använd inte mer än 30 l av medium.
- Pipet suspensionen som en droppe på insidan av en p35 maträtt lock.
- Vänd locket över p35 skål innehållande 2 ml av komplett medium (se även figur 1).
- Låt i inkubatorn (37 ° C / 5% CO2) underminst 5 timmar och upp till 7 timmar. Längre inkubationstid tillåter bättre återaggregering av cellkluster.
- Överför hängande droppar från locket till det kompletta mediet i skålen med hjälp av en P1000 pipett med ett snitt spets.
- Inkubera vid 37 ° C / 5% CO2 under 24 h för DNA nucleofections och 48 h för siRNA / shRNA nucleofections.
3. Inbäddning
- Förbered komplett medium (25 ml) och preequilibrate den vid 37 ° C / 5% CO2 under ett par timmar.
- Ta ut de frysta alikvoter av basalmembranmatrisen från -80 ° C frys och tina på is i kylrummet.
- För varje nucleofection förbereda en 6 cm skål som innehåller upp till åtta 13 mm sterila coverlips.
- Placera skålarna på en is låda täckt med plastfolie. Det är viktigt att hålla täckglasen coolt att undvika matrisstel under inbäddning förfarandet.
- För att behålla fukt, placera en remsa av fuktig vävnad inne i en 15 cm skål som wsjuka användas för att hålla upp till tre 6 cm rätter som innehåller inbäddade neuroblaster.
- Lägg komplett medium till den tinade matris i ett 01:03-förhållande. Till exempel, blanda 40 | il fullständigt medium med 120 | il av matrisen genom pipettering. Denna mängd av matrisen är tillräcklig för att bädda in aggregat på åtta 12 mm täckglas.
- Överför reaggregated cellkluster i ett 15 ml rör och centrifugera vid 433 xg under 5 min.
- Avlägsna överskott av medium och återsuspendera pelleten i 10 | il fullständigt medium.
- Placera 2 l av cell aggregat fjädring på varje sterila täckglas och tillsätt 18 l av matris / komplett medium blandning. Använd pipettspetsen för att sprida matris över hela täckglas.
- Placera omedelbart 6 cm skål med täckglasen i 15 cm skålen och lämna i inkubatorn (37 ° C / 5% CO 2) i 15-20 min. När matrisen har stelnat, försiktigt 5 ml komplett medium till var 6 cm skål ta hand för att drivaner någon flytande täckglas med en pipett.
- Inkubera under 24 h vid 37 ° C / 5% CO2 för att låta neuroblaster migrera ut ur cellaggregat.
4. 3D Migration Assay
- Förbered de lösningar som krävs för immunfärgning.
- Förbered blocket lösningen:
Goat blockningslösning (50 ml)
Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) - 5 ml
Get serum - 7,5 ml
10% Triton X-100 till 1,5 ml
BSA - 50 mg
H2O - 36 ml - Filtrera och förvara vid 4 ° C.
- Förbered fixeringslösning:
Fixeringslösning (100 ml)
Paraformaldehyd (PFA) - 4 g VARNING: alltid hantera PFA i dragskåp
Sackaros - 20 g (tillval)
PBS upp till 100 ml - På en het platta och under konstant omröring upplösa PFA i 80 ml PBS upprätthölls vid 65 ° C.
- När PFA har lösts upp, tillsätt 20 g sackaros.
- Justera pH till7,4 (vanligen genom tillsats av ~ 60 | il 1 M NaOH per 100 ml lösning).
- Ta upp till en total volym av 100 ml med PBS.
- Förbered blocket lösningen:
- Immunfärgning
- Placera täckglas i en 24-brunnsplatta.
- Skölj täckglas med PBS 2x.
- Fäst RMS neuroblast aggregat med fixeringslösning under 45 minuter vid rumstemperatur.
- Skölj täckglas med PBS 3x (5 min / tvätt - på en gungande plattform).
- Blockera efter 30-60 min med get-block lösning.
- Späd primära antikroppar i get blocket lösning och inkubera över natten vid 4 ° C. (Om så önskas, fluorescerande falloidin (1:400) och Hoechst-färgämne (1:10,000) kan också tillsättas till den primära antikroppen lösning för att visualisera filamentöst aktin och kärnor).
- Skölj täckglas med PBS 3x (5 min / tvätt).
- Späd sekundära antikroppar i get blocket lösning och inkubera under 2 timmar vid rumstemperatur.
- Skölj coverslips med PBS 3x (5 min / tvätt)
- Montera täckglas med fluorescerande monteringsmedium och låt torka över natten i rumstemperatur.
- Migrationsanalys
- Ta bilder av fasta RMS neuroblast aggregat med ett fluorescerande mikroskop med hjälp av en 10X objektiv. Inkludera en skala bar i en provbild.
- För att ställa in skalan för kvantifiering, mätning av skalfältet i bilden genom att välja "Rak linje" verktyget på ImageJ verktygsfältet.
- Välj "Analysera" och klicka på "Ställ in skalan".
- I skalan fönstret satt den "kända avstånd" och kryssa i "global" rutan för att behålla samma inställningar för alla mätningar.
- Använd "Segmenterad linjen" verktyget på ImageJ verktygsfältet för att mäta avståndet från kanten av det sammanlagda till längst migrerat neuroblast i 6 olika branscher runt om i hela aggregat (Figur 3B). Betrakta endast isolerade aggregates för analys.
- Beräkna en genomsnittlig migration avstånd från de 6 värden som erhålls för varje aggregat.
- Mät 10-20 aggregat för varje tillstånd i varje oberoende experiment och pool resultat från minst tre oberoende försök. Inkludera alltid en nucleofection kontroll (t ex. GFP eller en kontroll sh / siRNA).
Representative Results
Neuroblaster kan framgångsrikt isoleras från dissekerade RMS vävnad (Figur 1A) och bäddas in i en tredimensionell matris. Celler isolerade från antingen råtta eller mus postnatala RMS är immunopositiva för flyttande neuroblast markörer, såsom doublecortin (DCX), βIII tubulin eller PSA-NCAM (figurerna 1B-C).
Dissocierade neuroblaster kan effektivt nucleofected med DNA (t. ex. En GFP-kodande plasmid, figur 2) eller shRNA plasmiderna (figur 4) för att uppnå proteinnedbrytning, som kan bedömas genom western blot-analys (fig 4B) eller immunofluorescens (ej visad) .
Celler nucleofected med GFP-kodande plasmider migrera radiellt ut reaggregated neuroblast kluster (Figur 3A). Kvantifiering av relativa migrerade distans 24 timmar efter inbäddning (Figur 3B) visar ingen skillnad i migrationen mellan GFP-posit ive celler och GFP-negativa, nonnucleofected celler (Figur 3C), vilket indikerar att nucleofection per se inte stör migration. Det finns heller ingen signifikant skillnad i graden av migration mellan nucleofected neuroblaster och neuroblaster direkt migrerar ut ur RMS explants (data visas ej).
Figur 1. Dissektion av RMS neuroblaster. (A) Schematisk representation av RMS neuroblast dissekering. För detaljerad beskrivning se texten. (B) Isolerade råtta RMS celler är immunpositiva för flyttande neuroblast beslutsfattare DCX och βlll tubulin. Bar, 20 um. (C) celler migrerar ut ur mus RMS explants uttrycker flyttande neuroblast markörer DCX och PSA-NCAM. Bar, 20 | im.0989/50989fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Mus neuroblast nucleofection. Dissocierad mus RMS neuroblaster var nucleofected med pMAX-GFP, reaggregated, inbäddade i en tre-dimensionell matris och tilläts migrera under 6 timmar. Neuroblaster migrerar ut ur en reaggregated cellkluster (topp, fas kontrast bilder) visar hög transfektionseffektivitet (bottom, GFP kanalbilder). Den högra kolumnen paneler visar högre förstoring bilder som motsvarar de inläggningar markerade i den vänstra spalten panelerna. Barer, 20 um. Klicka här för att visa en större bild .
ontent-width = "6in" src = "/ files/ftp_upload/50989/50989fig3.jpg" width = "500px" />
Figur 3. 3D Migration assay. (A) Rat neuroblaster var nucleofected med pMAX-GFP (GFP) eller pCAG-IRES-EGFP 22 (EV), reaggregated, inbäddade i matrisen och lämnades att migrera under 24 timmar. Cellerna fixerades sedan och immun för GFP (grönt) och βIII tubulin (röd). Bar, 50 um. (B) Mätning migrationsavstånd med ImageJ. Den reaggregated cellkluster är uppdelad i 6 lika stora sektorer. Avståndet mellan kanten av klustret (streckad linje) och längst migrerade cellen mäts för varje sektor. (C) Kvantifiering av det relativa avståndet migrerat genom nucleofected celler (GFP-positiva) och kontroll, nonnucleofected celler (GFP-negativa) . Klicka här för att visa en större bild .
"Bild 4" fo: innehåll-width = "6in" src = "/ files/ftp_upload/50989/50989fig4.jpg" width = "500px" />
Figur 4. Övervakning neuroblast migration efter shRNA nucleofection. (A) Rat neuroblaster var nucleofected med en styr shRNA vektor (PCA-b-EGFPm5 Ljuddämpare 3, som också uttrycker EGFP-23) eller samma vektor innehållande en shRNA targeting Fascin, en aktin-buntprotein 24. Celler reaggregated över 48 timmar, inbäddad i matrisen och lämnades att migrera under 24 timmar. Ballast fixerades sedan och immun för GFP (grönt) och βIII tubulin (röd). Bar, 50 um. (B) Effektiv Fascin utarmning kan detekteras 50 h efter shRNA nucleofection genom western blot-analys. Aktin visas här som en laddningskontroll (C) Kvantitativ analys av relativ vandring avstånd som visar att Fascin utarmning avsevärt hindrar neuroblast migration. (Medelvärde ± SEM, ** p <0,01, n = 3 oberoende försök).
Discussion
Migrationen av neuroblaster längs RMS till den slutliga placeringen i OB är ett grundläggande steg i postnatal neurogenes. Men de molekylära mekanismer som styr denna komplicerade process är långt ifrån helt klarlagda.
Det experimentella förfarandet beskrivs här tillåter studiet av neuroblast migration in vitro. Vi har anpassat ett tidigare publicerat protokoll för att isolera RMS neuroblaster från tidig postnatal mus eller råtta 25. För att uppnå optimala resultat är det viktigt att behärska dissektion steg, eftersom det är viktigt att hålla den tid som förflyter mellan dissekering och nucleofection till ett minimum. Efter nucleofection kan neuroblaster vara reaggregated, inbäddade i en tre-dimensionell matris och lämnades att migrera över en 24 h period. Alternativt, för andra än migration (t.ex. immunofluorescens eller Western blot-analys) ändamål, celler kan direkt klädd efter nucleofection på polyornithine/laminin-belagda täckglas, där de överlever upp till 4-5 dagar. Mus och råtta neuroblaster vandrar i Matrigel i liknande utsträckning, men musceller verkar ha en starkare tendens att migrera i kedjor än råttceller.
Beroende på syftet med studien, kan neuroblaster vara nucleofected med olika plasmider som kodar för fluorescerande proteiner eller vildtyp / mutant proteiner av intresse. För optimala protein uttryckningsplasmider med CAG promotor (β-aktin promotor med CMV-förstärkare och β-globin poly-A svans) 26 rekommenderas starkt. Dessutom kan siRNA oligos eller shRNA plasmider nucleofected att knockdown mål av intresse. Effektiv protein utarmning kan visualiseras genom immunofluorescens eller genom western blöt (vanligtvis lyse inbäddade aggregat från en råttunge med 50 ul av standard lysbuffert).
Nucleofection är en relativt enkel metod för att transfektera primära neuroblaster, och erbjuder en enklare och snabbare alternativ till VIral vektor-medierad transfektion, och kan uppnå hög (~ 70-80%) transfektionseffektivitet. Det är viktigt att arbeta snabbt under nucleofection förfarandet, efter att ha lämnat neuroblaster i nucleofection lösningen under en längre tid drastiskt minskar cellernas livskraft.
Den genomsnittliga cellutbyte från RMS dissektion är relativt låg för P7-möss (~ 5 x 10 5 celler / hjärna) i jämförelse med P7-råttor (~ 1 x 10 6 celler / hjärna) och minst 3 x 10 6 celler per nucleofection krävs för att uppnå transfektion med ~ 50% effektivitet. Dessutom råttneuroblaster verkar motstå bättre att Nucleofection jämfört med mus-neuroblaster. Därför kan tidig födsel (P6-P7) råttungar utgör en bekväm neuroblast källa, även med tanke på att organisationen av råtta och mus RMS är påfallande liklar 27 och att omfattningen av rått-och mus-neuroblast migration in vitro är också jämförbara. Det rekommenderas inte att hålla reaggregated kluster av nucleofected neuroblaster i suspension under längre tid än 48 timmar för att undvika onormala effekter på cell morfologi och migration (våra opublicerade observationer).
3D-analys som beskrivs här kan användas för att kvantifiera neuroblast migration vid en fixerad tidpunkt efter inbäddning i matrix (t.ex.. 24 h). Aggregat av olika storlekar kan användas i analysen, eftersom det inte finns någon signifikant korrelation mellan storleken på aggregaten och migrationsavstånd (våra opublicerade observationer). Att visualisera och ytterligare undersöka dynamiken i neuroblast migration, kan användas time-lapse avbildning. Det rekommenderas att utföra analyser av migration inom en 24 tim intervall efter inbäddning, eftersom hastigheten på neuroblaster verkar drastiskt minska på längre tidpunkter (våra opublicerade observationer). </ P>
Det finns vissa begränsningar i detta protokoll. Först kan nucleofection hittills användas för tidiga postnatala gnagar neuroblaster, medan infektion med virala vektorer är fortfarande den mest effektiva transfektion metod för vuxna neuroblaster 28. För det andra innebär migration vitro-analys av i inte helt återge den komplexa arkitekturen av RMS observerats in vivo. I själva verket, även om neuroblaster upprätthålla förmågan att migrera på ett liknande sätt till deras in vivo motsvarigheter, i experimentuppställning som beskrivs här de saknar interaktioner med andra RMS komponenter såsom astrocyter och blodkärl, vilket också bidrar till att reglera deras rörlighet 9,29, 30. Denna fråga kan behandlas i framtiden genom optimering av tredimensionella coculture modellsystem.
Sammanfattningsvis kombinerar nucleofection med en 3D-analys migration utgör ett värdefullt verktyg för att bättre förstå de molekylära mekanismerna bakomneuroblast migration. Denna experimentella procedur ger en första, snabb och relativt enkel metod för att utvärdera vilken roll kandidat regulatorer av neuroblast migration, vilket kan vara ytterligare valideras av andra metoder som in vivo-postnatal elektroporering och time-lapse avbildning av hjärnan skiva kulturer 28,31,32 .
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av en Wellcome Trust Project Grant delas PD och GL (089236/Z/09/Z). SG fick stöd av ett bioteknik och Biological Sciences Research Council doktorand. Vi tackar Matthieu Vermeren för slags gåva av shRNA vektorn och Jennifer Shieh för värdefulla råd om neuroblast nucleofection.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen Life Technologies | 14175129 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen Life Technologies | 15140-122 | |
| 2.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15090-046 | store 200 µl aliquots at -20 °C |
| DNAse I Vial (D2) | Worthington | LK003170 | ≥1,000 units per vial; store 50 µl aliquots at -20 °C |
| Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Hyclone | SH3007902 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| B27 supplement | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
| D-(+)-Glucose solution (45%) | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-free, 10 ml, LDEV-Free | BD Biosciences | 356231 | prepare 120 µl aliquots at 4 °C, then store at -80 °C |
| PFA | Sigma-Aldrich | 441242 | |
| Sucrose | BDH | 102745C | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | 69023 | |
| Triton X-100 | VWR International Ltd. | 306324N | |
| BSA | Fisher Chemical | BPE9701-100 | |
| Dako fluorescence mounting medium | Dako | S3023 | |
| Rat neuron nucleofection kit | Lonza | VPG-1003 | |
| Mouse neuron nucleofection kit | Lonza | VPG-1001 | |
| Microsurgical knife | Angiotech | 7516 | |
| McIlwain tissue chopper | The Mickle Laboratory Engineering Company | ||
| Nucleofector II | Lonza |
References
- Ming, G. L., Song, H. J. Adult Neurogenesis in the Mammalian Brain: Significant Answers and Significant Questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Alonso, M., et al. Activation of adult-born neurons facilitates learning and and memory. Nat. Neurosci. 15, 897-U127 (2012).
- Lazarini, F., Lledo, P. M. Is adult neurogenesis essential for olfaction? Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).
- Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat. Med. 8, 963-970 (2002).
- Jin, K. L., et al. Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13198-13202 (2006).
- Kim, Y., Szele, F. G. Activation of subventricular zone stem cells after neuronal injury. Cell Tissue Res. 331, 337-345 (2008).
- Massouh, M., Saghatelyan, A. De-routing neuronal precursors in the adult brain to sites of injury: Role of the vasculature. Neuropharmacology. 58, 877-883 (2010).
- Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis. Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).
- Lois, C., Alvarez-Buylla, A. Long-Distance Neuronal Migration in the Adult Mammalian Brain. Science. 264, 1145-1148 (1994).
- Lois, C., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Chain migration of neuronal precursors. Science. 271, 978-981 (1996).
- Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. Abnormal Neuronal Migration Changes the Fate of Developing Neurons in the Postnatal Olfactory Bulb. J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).
- Battista, D., Rutishauser, U. Removal of Polysialic Acid Triggers Dispersion of Subventricularly Derived Neuroblasts into Surrounding CNS Tissues. J .Neurosci. 30, 3995-4003 (2010).
- Conover, J. C., et al. Disruption of Eph/ephrin signaling affects migration and proliferation in the adult subventricular zone. Nat. Neurosci. 3, 1091-1097 (2000).
- Mobley, A. K., McCarty, J. H. beta 8 Integrin is Essential for Neuroblast Migration in the Rostral Migratory Stream. Glia. 59, 1579-1587 (2011).
- Nguyen-Ba-Charvet, K. T., et al. Multiple roles for slits in the control of cell migration in the rostral migratory stream. J. Neurosci. 24, 1497-1506 (2004).
- Garzotto, D., Giacobini, P., Crepaldi, T., Fasolo, A., De Marchis, S. Hepatocyte growth factor regulates migration of olfactory interneuron precursors in the rostral migratory stream through Met-Grb2 coupling. J. Neurosci. 28, 5901-5909 (2008).
- Platel, J. C., Stamboulian, S., Nguyen, I., Bordey, A. Neurotransmitter signaling in postnatal neurogenesis: The first leg. Brain Res. Rev. 63, 60-71 (2010).
- Dityateva, G., et al. Rapid and efficient electroporation-based gene transfer into primary dissociated neurons. J. Neurosci. Meth. 130, 65-73 (2003).
- Shieh, J. C., Schaar, B. T., Srinivasan, K., Brodsky, F. M., McConnell, S. K. Endocytosis Regulates Cell Soma Translocation and the Distribution of Adhesion Proteins in Migrating Neurons. PloS One. 6, (2011).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons. J. Vis. Exp. , e2373 (2011).
- Gartner, A., Collin, L., Lalli, G. Nucleofection of primary neurons. Method Enzymol. 406 (06), 374-388 (2006).
- Causeret, F., et al. The p21-Activated Kinase Is Required for Neuronal Migration in the Cerebral Cortex. Cereb. Cortex. 19, 861-875 (2009).
- Bron, R., Eickholt, B. J., Vermeren, M., Fragale, N., Cohen, J. Functional knockdown of neuropilin-1 in the developing chick nervous system by siRNA hairpins phenocopies genetic ablation in the mouse. Dev. Dynam. 230, 299-308 (2004).
- Sonego, M., et al. Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).
- Ward, M., Rao, Y. Investigations of neuronal migration in the central nervous system. Methods Mol. Biol. 294, 137-156 (2005).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient Selection for High-Expression Transfectants with a Novel Eukaryotic Vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp. Neurol. 487, 407-427 (2005).
- Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain. J. Vis. Exp. , e4061 (2012).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood Vessels Form a Migratory Scaffold in the Rostral Migratory Stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
- Sonego, M., Ya, Z., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain. J. Vis. Exp. , in press (2013).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A., lique, Neonatal Subventricular Zone Electroporation. J. Vis. Exp. , e50197 (2013).
