Introduction
Les modèles animaux donnent un aperçu de la pathologie de la maladie qui ne peut être obtenu par une analyse in vitro. De fournir les résultats les plus efficaces, il est important d'utiliser un modèle animal qui est étroitement liée à la maladie et des espèces d'intérêt. Par exemple, le muntjac de l'Reeves (Muntiacus reevesi), un petit cerf Asie 1,2, et les souris transgéniques exprimant la protéine prion des cervidés (CerTgPrP) 3 sont des modèles animaux utiles pour les espèces de cervidés. Les deux espèces sont polyestrous, permettant l'année élevage, et donc une source constante pour les tissus et les fluides liés à la grossesse pour étudier les mécanismes spécifiques à la biologie des cervidés. Études de lait ont une vaste gamme d'applications qui sont plus simplement (et peu coûteuse) accomplis dans des modèles animaux que chez les humains. Les chercheurs peuvent étudier lait et le colostrum comme une source potentielle de 1) la transmission de maladies infectieuses, 2) des immunoglobulines transférés de la mère à la progéniture dans le dévepement de l'immunité passive 4 et 3) la lactoferrine, une protéine présente dans le lait maternel humain impliqué dans l'immunité passive que les chercheurs tentent actuellement de produire commercialement 5.
Collecte une quantité importante de lait des petits animaux peut s'avérer être une tâche difficile. Rogers propose une approche de la collecte du lait de rats 6, qui a ensuite été utilisés chez la souris. Depeters et Hovey proposé deux procédés pour la collecte du lait, l'une utilisant un vide manuellement généré produite par une ampoule de pipette en caoutchouc à l'aide d'une pipette Pasteur, et un second nécessitant la construction d'une unité de traite, qui est ensuite fixé à une source de dépression (par exemple comme un robinet) pour récolter le lait de la souris 7. Nous proposons ici une méthode simple et peu coûteuse pour la collecte du lait de la souris et le muntjac le cerf de Reeves, qui nécessite un équipement de laboratoire seulement facilement disponibles et les compétences techniques de base. Notre méthode donne des volumes suffisants de lait pour diversapplications.
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Protocol
1. Protocole traite souris
Les méthodes décrites dans le présent protocole ont été approuvés par IACUC.
1. Séparation du barrage de Offspring
- Sélectionnez le barrage à traire. Choisissez un barrage avec une portée de 4 ou plus petits qui est de 8-12 jours après l'accouchement de fournir du lait maximale collection-même si la collecte est possible à tout point de temps après l'accouchement jusqu'à 21 jours.
- Séparer le barrage de sa litière au moins 2 heures avant la traite.
Remarque: Si un désir de lait plus d'un barrage dans une période de temps donnée, il est acceptable pour abriter les barrages séparés dans la même cage avec une alimentation adéquate et d'eau.
2. L'administration de l'ocytocine, anesthésie et des yeux Lubrifiant
- Administrer 2 UI / kg par voie intrapéritonéale d'ocytocine (IP). L'ocytocine est une hormone qui agit sur les glandes mammaires de femelles en lactation à stimuler la libération de lait. L'ocytocine peut être acquise from un vétérinaire.
- Administrer un mélange anesthésique contenant 80-100 mg / kg de kétamine en association avec 5-10 mg / kg de xylazine IP. Par exemple, un mélange de 10 ml actions anesthésique peut être préparé à l'avance pour les souris pesant environ 30 g et comprendrait 0,1 ml de xylazine, 8,9 ml H 2 O, et 1,0 ml de kétamine. 0,25 ml anesthésie totale endormir une souris de cette taille environ 20-30 min, ce qui devrait donner suffisamment de temps pour la collecte du lait.
Notes: Pour déterminer que l'animal a été anesthésié avec succès, la placer délicatement sur le ventre sur une surface solide; elle ne doit pas être en mouvement ses pieds ou de tenter de monter à ses pieds si elle est complètement anesthésié. Dans le cas d'une souris anesthésiée pas pleinement avec la dose initiale, le chercheur peut administrer un autre quart ou la moitié de la dose initiale du mélange anesthésique en fonction de la taille de la souris et / ou le niveau de sédation que la souris a déjà atteint . Toutefois, cela pourrait iUGMENTATION la probabilité d'une réaction indésirable à l'anesthésie, et peut également conduire à la souris étant anesthésiée plus profondément et / ou l'anesthésie pendant une période de temps plus longue.
Remarque: Si la traite plus d'un barrage, il est nécessaire d'échelonner l'ocytocine et les injections anesthésiques en raison de la courte demi-vie de l'ocytocine et les temps de sédation de la kétamine et de xylazine. - Appliquez une petite quantité de lubrifiant oeil au coin de chaque oeil et se propage à empêcher les yeux de la souris de se dessécher sous anesthésie.
3. Collecte de lait
La collecte du lait est plus facilement réalisée avec deux chercheurs: un chercheur de tenir la souris anesthésiée tout en exprimant manuellement le lait (dénommé R1), et un chercheur pour recueillir le lait (R2). Cette méthode peut également être effectuée avec une seule personne, si la souris est fixé sur une surface plane pour éviter un préjudice.
- R2 doit être équipé tampons à l'alcool stériles, un pip P-200Etman, une pointe de pipette propre pour chaque souris, et un récipient pour contenir le lait, comme un tube Eppendorf de 1,5 ml ou un cryovial 1,2 ml (voir tableau des matériaux).
- Comme l'ocytocine commence à prendre effet, la descente du lait sera visible dans la zone mammaire de la souris (voir la figure 1A). R1: Déballer un tampon à l'alcool stérile et essuyez délicatement la zone mammaire de la souris pour nettoyer la zone avant la traite. Exprimer manuellement le lait du trayon en utilisant le pouce et l'index pour masser doucement et presser le tissu mammaire dans un mouvement ascendant jusqu'à ce qu'un bourrelet visible de lait commence à se former à la base de la tétine.
- Appuyez sur le piston Pipetman P-200 à son premier arrêt pour libérer l'air de la pointe de la pipette et se préparer pour la collecte du lait.
- Placez la pointe de la pipette au sommet de la goutte de lait, et tirez doucement le lait dans la pointe de la pipette en libérant lentement la pression sur le piston. Prenez soin de ne pas mettre la pointe trop près de la tétine ou la peau (voirFigure 1B). Il n'est pas nécessaire de libérer complètement le piston car cela va tirer le lait tout le chemin vers le sommet de la pointe de la pipette et il sera difficile d'expulser le lait souvent visqueux dans le récipient de maintien.
- Expulser le lait dans le récipient à l'aide du pouce sur le piston au-delà de la première étape (voir figure 1C). Afin de faciliter l'expulsion de petits volumes, appuyez sur la pointe de la pipette contre le côté du tube de manière à ce qu'aucun liquide est perdue.
- Continuer à exprimer manuellement le lait de chaque trayon, se déplaçant dans le sens horaire ou antihoraire afin de ne pas sauter des trayons. Il est à la fois acceptable et utile de revenir sans cesse et exprimer le lait de la même tétine doit-il produire plus de lait que les autres.
4. Reprise anesthésique dans le barrage
- Dans la plupart des cas, il est fréquent que le barrage pour commencer à commencer à se réveiller pendant le processus de traite. Si ce n'est pas le cas, placez le barrage dans un cage indirectement sous une source de chaleur, comme une couverture de circulation chauffée, jusqu'à ce qu'elle commence à se réveiller.
Remarque: Comme le barrage commence à se réveiller, garder une surveillance étroite de son activité jusqu'à ce qu'elle est capable de marcher sur sa cage elle-même. - Une fois le barrage se déplace sur la cage sans lutte, placer son dos dans sa cage d'origine avec sa litière. Pas d'effets néfastes ont été constatés à l'égard de la capacité des petits à nourrir après la collecte du lait.
2. Protocole traite Muntjac
Les méthodes décrites dans le présent protocole ont été approuvés par IACUC.
1. Séparation de la Biche de Offspring
- Sélectionnez la biche à traire. Les cerfs muntjac de Reeves donnent généralement naissance à un faon 2. Traire la biche le jour après l'accouchement afin de permettre la possibilité de faon d'avoir accès à des nutriments essentiels dans le colostrum 8.
Remarque: Le faon cache habituellement et ne réapparaît pas au cours de la procedure; la séparation de la paire mère-progéniture n'est pas nécessaire.
2. L'administration de l'ocytocine, anesthésie et des yeux Lubrifiant
- Administrer 10 UI / kg de l'ocytocine par voie intramusculaire (IM). L'ocytocine est une hormone qui agit sur les glandes mammaires de femelles en lactation à stimuler la déception de lait. L'ocytocine peut être acquis auprès d'un vétérinaire.
- Administrer l'anesthésique BAM IM 11 contenant butorphanol 0,45 mg / kg, azapérone 0,25 mg / kg, medetomadine 0,07 mg / kg. Une dose de mélange anesthésique BAM endormir un muntjac environ 20-30 min, ce qui donne suffisamment de temps pour la collection complète de lait. Une autre option pour l'anesthésie est midazolam à 1-2 mg / kg, ce qui endormir un muntjac environ 10-15 min. Bien que cela fournit suffisamment de temps pour la collecte du lait, ce anesthésique est métabolisé plus rapidement que les BAM et l'animal peuvent tenter de s'échapper à la fin de la période de temps plus courte.
Remarque: Une réponse minimale à la douleur, Réflexes mineures en touchant les oreilles, suivies par la capacité de R1 à tenir le MJ sans lutte indique que l'animal a été anesthésié avec succès.
Remarque: Dans le cas d'un muntjac pas pleinement anesthésiés avec de la dose initiale, le chercheur peut administrer un autre quart ou la moitié de la dose initiale du mélange anesthésique en fonction de la taille de l'animal et / ou le niveau de sédation, qui a déjà été atteint. Toutefois, cela pourrait augmenter le risque d'une réaction indésirable à l'anesthésie, et peut également entraîner la muntjac être plus profondément anesthésié et / ou anesthésié pour une période de temps plus longue. - Appliquez une petite quantité de lubrifiant dans le coin de chaque oeil et la propagation de prévenir les yeux du muntjac de sécher sous anesthésie.
3. Collecte de lait
La collecte du lait est plus facilement réalisée avec deux chercheurs; un chercheur de tenir le muntjac anesthésié dansla tour tout en exprimant manuellement le lait (désigné par R1), et un second chercheur à garder la tête de la muntjac dans une position confortable et sûre et pour recueillir le lait (R2).
- Selon l'anesthésique utilisé, la traite doit être effectuée soit 1) dans leurs stylos à fournir un endroit sûr pour eux devraient-ils se réveiller au cours de la procédure (midazolam induite) 2) ou dans une antichambre d'une literie à maintenir la propreté (BAM- induite).
- R1 et R2 doivent être équipés d'une gaze imbibée d'éthanol et 15 ml de plusieurs tubes coniques en polypropylene pour maintenir le lait.
- Comme l'ocytocine commence à prendre effet, la descente du lait sera visible dans la zone mammaire du muntjac. R1: Désinfecter les mains gantées et des doigts, ainsi que l'ensemble du pis et les trayons de l'animal individuel avec de la gaze imbibée d'éthanol. R2: Maintenez la tête du muntjac dans une position sûre et confortable pour permettre une facilité de respiration et aider à prévenir la régurgitation rumen. Tenez les cl tubes de prélèvement ose à la tétine étant traire sans le toucher pour éviter la contamination potentielle.
- Exprimez-lait d'une tétine en utilisant le pouce et l'index pour presser doucement le tissu mammaire dans un mouvement ascendant jusqu'à ce que la tétine est gorgé de lait, et rouler doucement le lait du trayon et dans le tube que R2 tient (voir la figure 2 ).
- Remarque: Le lait sort dans un flux, il est donc important pour R2 pour que le tube de prélèvement placé de sorte que peu ou pas de lait sera gaspillée.
- Le pis de l'muntjac est divisé en quadrants. R1: Continuer à exprimer le lait de chaque quadrant jusqu'à ce que le lait ne coule plus facilement. Si le lait ne peut pas être exprimé d'une tétine, exprimer de toutes les autres tétines avant de revenir à la première. Il est à la fois acceptable et utile de revenir sans cesse et exprimer le lait de la même tétine doit-il produire plus de lait que les autres.
4. Reprise anesthésique dans le Doe
t "> Il est commun pour une lapine induite midazolam à commencer à se réveiller au cours du processus de traite. Dans la plupart des cas, la biche va tenter de s'échapper avant tout le lait a été exprimé. retenue mineure est utilisé dans un effort pour augmenter le lait rendement, mais la sécurité et le confort des deux chercheurs et la biche sont tout aussi importants.- Administrer atipamezole à 2,5 mg / mg medetomadine voie sous-cutanée pour l'inversion rapide de BAM anesthésié biche.
Remarque: Avec les deux types d'anesthésique, il est nécessaire de maintenir une surveillance étroite de la biche jusqu'à ce qu'elle est capable de marcher sur son propre sans trébucher et de tomber, et est capable de manger et de boire sans crainte d'aspiration ou d'étouffement. Pas d'effets néfastes ont été constatés en ce qui concerne la capacité de la faon d'allaiter après la collecte du lait.
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Representative Results
Souris
De nos expériences, nous avons déterminé qu'il est possible de collecter environ 100-400 pi de lait d'une souris de laboratoire, en fonction de plusieurs variables. Ces variables comprennent: 1) le temps mis de côté pour la collecte, 2) la dose d'ocytocine administrée, 3) combien de chiots barrage est actuellement infirmière et 4) le montant de la post accouchement de temps. Nos études ont montré que le rendement le plus élevé est obtenu lorsque les barrages sont séparés de leur progéniture pendant au moins 2 heures, et au moins 45 min à une heure est réservée par la souris pour la traite. Les volumes de lait maximales ont été récoltés 8-12 jours après l'accouchement aide de 2 UI / kg d'ocytocine. Nos résultats sont la plupart du temps en accord avec d'autres études où la taille des portées était positivement corrélée avec la production de lait 9 (voir la figure 3).
Muntjac
Bien que la quantité de lait haracquis du muntjac était variable d'un jour à l', nous avons pu recueillir 5 à 30 ml de lait / barrage / session, en fonction de l'anesthésie utilisée et / ou après l'accouchement de temps. cerf Muntjac sont polyestrous; lait peut être recueillie à différents moments tout au long de l'année 2 (voir le tableau 1). Biche induite midazolam est demeuré sous anesthésie pour aussi peu que 10 minutes, ce qui permet pour les collections de volumes plus petits (typiquement 5-30 ml), tandis que biche BAM-induite a subi une longue période de l'effet anesthésique (20-30 min), permettant l'expression de lait complet (15-130 ml). collections de lait ont été interrompues lorsque le lait a été plus produite en quantités suffisantes par la biche et le faon correspondant a été nourris avec un régime de fourrage surtout foin.
La figure 1 (A). L'barrage217; s tétines s'engorgent avec du lait lors de l'injection d'ocytocine (B) Collecte de lait à partir d'un barrage anesthésié à l'aide d'un Pipetman P-200 (C) d'éjection du lait en un 1,2 ml Cryovial...
Muntjac lait Figure 2. Est recueilli dans un tube conique de 15 ml.
Figure 3. Production de lait collectées approximative de souris en fonction de la taille des portées, et l'âge des chiots.
Tableau 1. Coll laitection commencer et terminer les dates de lactation des barrages de muntjac de Reeves.
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Discussion
Souris
Il ya plusieurs facteurs à prendre en considération lors de la collecte de lait d'une souris, y compris 1) le temps mis de côté pour la collecte, 2) la dose d'ocytocine administrée, 3) combien de chiots barrage est actuellement infirmière et 4) le montant de temps qui s'est écoulé depuis la mise bas au moment de la collecte. En utilisant des études précédentes que les lignes directrices, nous avons décidé d'optimiser les conditions pour la production de lait.
Des recherches antérieures ont directement corrélée production de lait avec la taille de la portée 8. Malheureusement, la taille des portées est une variable qui ne peut être contrôlé. Toutefois, le moment de la traite après la parturition peut être contrôlée. Selon le Laboratoire de souris lait maximale sécrétion est à 8-10 jours après la parturition 9. Notre expérience est en congruence avec cet énoncé.
Il a été montré que l'ocytocine joue un rôle irremplaçable dans la production de lait après10 parturition. Ocytocine doses allant de 0,1 UI / kg de 9 à 4 UI / kg 6 ont été rapportés pour la collecte du lait à partir de 6,7,9 rongeurs. Nous avons commencé notre étude par l'administration de la dose la plus faible suggéré, 0,1 UI / kg 9. L'utilisation de ce dosage, la quantité de lait produite par la souris était trop petit pour mesurer ou de percevoir. Après l'augmentation de la dose d'ocytocine à 2 UI / kg 6,7, la production de lait était considérablement plus élevé à environ 120 pi. Parce que nous voulions utiliser la plus faible dose d'ocytocine pour réaliser la collecte de lait optimale, nous n'avons pas administrer des doses supérieures à 2 UI / kg.
La production de lait est également dépendant de la quantité de temps mis de côté pour la collecte. Nous avons déterminé que d'un minimum de 3 heures est nécessaire pour optimiser la collecte h-2 pour les chiots à être séparés de leur mère et 1 h pour la préparation matérielle et collection. La collecte du lait de plusieurs barrages dans une session diminuera le temps global nécessaire àobtention d'un volume spécifique de lait, c'est-à-2 hr pour séparer les chiots, 30 min à des matériaux d'installation et de 20 à 30 min pour recueillir le lait de chaque barrage. Chaque barrage doit être surveillée jusqu'à ce qu'ils sont éveillés avant d'être placé en arrière avec leurs petits. Nous avons constaté que plus le temps mis de côté pour la traite conduit à une augmentation des rendements de lait, parce que la souris peut traire jusqu'à ce qu'elle reprenne conscience.
Cas apparaissent dans les modèles animaux qui aura une incidence sur la production de lait. Un problème commun est la présence de sang ou exsudat dans le lait des mères plus âgées qui ont été élevés à plusieurs reprises et avoir de grandes portées, ou dans les barrages qui allaitent leur première portée. Dans ce cas, nous vous suggérons arrêt du prélèvement de lait de cette tétine particulier. Il est conseillé de changer les embouts de pipettes à ce moment, et supprimer tout exsudat ou de sang.
Les chercheurs qui effectuent cette méthode doivent également être conscients que, comme c'est souvent le cas lors de l'utilisation de modèles animaux, les résultats varient (figure3). Si un moins que la quantité optimale de lait est recueilli en une seule session, il est préférable de répéter la procédure à une date ultérieure (par exemple 24-48 h), plutôt que de modifier les conditions expérimentales pour forcer la libération de lait.
Muntjac
Le volume de lait collecté à partir des barrages de muntjac de Reeves était dépendante de l'anesthésique utilisé. Notre anesthésique de choix initiale était midazolam. Midazolam fourni sédation suffisante pour permettre retenue pour de courtes périodes de temps-à-dire, si R1 a un tempérament calme et pourrait garder le muntjac calme, R2 pourrait prendre en charge la traite d'augmenter le rendement avant le muntjac éveillerait-la sécurité et le confort des deux animaux et maître sont de la plus haute importance et nous ont abandonné l'effort de traite si nous nous sentions soit a été compromise. Nous avons découvert que muntjac biche rapidement devenir tolérant au midazolam et que des doses plus élevées seraient nécessaires après une exposition répétée, faire la collecte du lait deux fois par semaine en plus difficile.
La pénurie de midazolam, couplé avec une tolérance de construction, nous a conduit à la recherche d'un anesthésique alternative. Un mélange de butorphanol, Azapérone et Medetomadine (BAM) est effectivement utilisé pour l'immobilisation de cerf à queue blanche 11. Dans nos mains, le cocktail de BAM a fourni une anesthésie suffisante pour permettre la collecte de volumes acceptables de lait d'une manière sûre, avec moins de tolérance au médicament après un usage répété, et avec un meilleur contrôle pour inverser les effets de l'anesthésie.
Certains barrages de muntjac souffert de mamelles sensibles et / ou sont mères pour la première fois. Ces muntjac développé des ecchymoses sur les trayons pendant le processus de traite, et le débit de lait ralenti ou arrêté complètement, nous incitant à interrompre la session en cours. Dans ce cas, il faut utiliser une technique de traite plus doux dans une tentative pour éviter la gêne ou des ecchymoses dans les tétines.
e_content "> La production de lait est apparu à croître et décroître à plusieurs reprises. récoltes faibles de lait peuvent être causées par 1) les faons avoir soigné juste avant collections ou 2) une baisse de la production de lait en raison du processus naturel de faon sevrage.Alors qu'il peut être un processus d'essayer d'obtenir un volume non négligeable de lait de petits modèles animaux, notre travail montre que c'est en effet une possibilité pour la souris et modèles de muntjac; ni exiger une vaste compétence ni poches profondes, tout simplement persévérance.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials—Mouse | |||
| Ketamine (KetaVed 100 mg/ml) (dose: 80-100 mg/kg) | MWI/Vedco | 011075 | |
| Xylazine (TranquiVed 100 mg/ml) (dose: 5-10 mg/kg) | MWI/Vedco | NADA 139236 | |
| Eye lubricant | MWI/Apexa | 701013 | |
| Oxytocin (2 IU/kg) | Vet One | 501013 | |
| Materials—Muntjac | |||
| Midazolam (1-2 mg/kg) | Amerisource Bergen Drug Corp | 924326 | Optional: researcher can either use Midazolam on its own or BAM combination as an anesthetic |
| Butorphanol tartrate (Torbugesic) (0.45 mg/kg) | Fort Dodge Animal Health | NADA 135-780 | |
| Azaperone tartrate (0.25 mg/kg) | ZooPharm | ||
| Medetomadine HCl (0.07 mg/kg) | ZooPharm | ||
| Antipamezol hydrochloride (Antisedan) (dose: 0.25 mg/kg) | Orion Corporation | NADA 141-033 | |
| Oxytocin (10 IU/kg) | Vet One | 501013 | |
| Equipment—Mouse | |||
| P-200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μl pipette tips | Light Labs | B-2004-SH | |
| 1 ml syringes | MWI | 005427 | |
| 27 G needles | MWI | 002031 | |
| Equipment—Muntjac | |||
| 15 ml conical tubes | VWR | 21008-918 | |
| 22 G needles | MWI | 873 | |
| 3 ml luer lock syringes | MWI | 001377 | |
References
- Dueling, S. Muntiacus reevesi. Animal Diversity Web. , Available from: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Muntiacus_reevesi (2004).
- Pei, K., Taber, R., O'Gara, B., Wang, Y. Breeding cycle of the Formosan Reeves muntjac (Muntiacus reevesi micrurus) in northern Taiwan, Republic of China. Mammalia. 59 (2), 223-228 (1995).
- Browning, S. R. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J. Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
- Van de perre, P. Transfer of antibody via mother's milk. Vaccine. 21 (24), 3374-3376 (2003).
- Maden, C. Genetically modified mice produce human milk protein. BioNews. , (2009).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab. Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- Depeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
- Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: effects of litter size and lactation. 84 (1), 127-133 (1986).
- Hedrich, H. J., Bullock, G. R. The laboratory mouse. , 735-736 (2004).
- Nishimori, K., Young, L. J., Guo, Q., Wang, Z., Insel, T. R., Matzuk, M. M. Oxytocin is required for nursing but is not essential for parturition or reproductive behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (21), 11699-11704 (1996).
- Miller, B. F., Osborn, D. A., Lance, W. R., Howze, M. M., Warren, R. J., Miller, K. V. Butorphanol-azaperone-medetomidine for immobilization of captive white-tailed deer. 45 (2), 457-467 (2009).
