Introduction
Os modelos animais fornecem informações sobre a patologia da doença que não pode ser adquirida através da análise in vitro. Para obter os resultados mais eficazes, é importante o uso de um modelo animal, que está intimamente relacionado com a doença e da espécie de interesse. Por exemplo, o muntjac Reeves (Muntiacus reevesi), um pequeno cervo asiáticos 1,2 e camundongos transgênicos que expressam a proteína príon cervídeos (CerTgPrP) 3 são modelos animais úteis para as espécies de cervídeos. Ambas as espécies são polyestrous, permitindo reprodução durante todo o ano e, portanto, uma fonte consistente de tecidos e fluidos relacionados com a gravidez para estudar mecanismos específicos em biologia cervídeos. Estudos de leite tem uma vasta gama de aplicações, que são mais simples (e barata) realizados em modelos animais do que em seres humanos. Pesquisadores poderia investigar leite e colostro como uma fonte potencial de 1) a transmissão de doenças infecciosas, 2) imunoglobulinas transferidos de mãe para filho no desenvolvimento da imunidade passiva 4 e 3) a lactoferrina, uma proteína encontrada no leite materno humano envolvido na imunidade passiva que os investigadores estão actualmente a tentar produzir comercialmente 5.
Coleta de uma quantidade substancial de leite de pequenos animais pode revelar-se uma tarefa difícil. Rogers propôs uma abordagem para coletar o leite de ratos 6, que foi posteriormente utilizados em camundongos. DePeters e Hovey propostos dois métodos para a recolha de leite, um utilizando um vácuo gerado produzido manualmente por um bolbo de pipeta de borracha ligada a uma pipeta de Pasteur, e uma segunda que exige a construção de uma unidade de ordenha, que é então ligado a uma fonte de vácuo (tal como uma torneira) para colher o leite do mouse 7. Aqui propomos um método de custo simples, de baixo para a recolha de leite de ratos e Reeves 'veado muntjac, que requer equipamentos de laboratório apenas prontamente disponíveis e habilidades técnicas básicas. Nosso método produz volumes suficientes de leite para diversasaplicações.
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Protocol
1. Rato ordenha Protocolo
Os métodos descritos neste protocolo foram aprovados pelo IACUC.
1. Separação da Barragem de Offspring
- Selecione a barragem a ser ordenhadas. Escolha uma barragem com uma ninhada de 4 ou mais filhotes que é de 8-12 dias após o parto para fornecer leite máxima coleção, embora coleção é possível a qualquer momento ponto pós parto até 21 dias.
- Separe a barragem de sua ninhada, pelo menos 2 horas antes da ordenha.
Nota: Caso um desejo de leite mais de uma barragem em um determinado período de tempo, é aceitável para abrigar as barragens separados na mesma gaiola com alimentação adequada e abastecimento de água.
2. Administração de ocitocina, anestesia e Eye Lubrificante
- Administrar 2 UI / kg de oxitocina por via intraperitoneal (IP). A ocitocina é um hormônio que atua sobre as glândulas mamárias das fêmeas lactantes para estimular a liberação de leite. A ocitocina pode ser adquirido from um veterinário.
- Administrar uma mistura de anestésicos contendo 80-100 mg / kg de cetamina, em combinação com 5-10 mg / kg IP de xilazina. Por exemplo, um ml de caldo de mistura de anestésico 10 pode ser preparado antecipadamente por ratinhos pesando cerca de 30 g e que incluem 0,1 ml de xilazina, 8,9 ml de H 2 O, e 1,0 ml de cetamina. 0,25 ml de anestésico total será sedar um rato deste tamanho por aproximadamente 20-30 min, que deverá fornecer o tempo adequado para a coleta de leite.
Notas: Para determinar que o animal foi anestesiado com sucesso, coloque-a suavemente em seu estômago em uma superfície sólida; ela não deve se mover seus pés ou a tentativa de subir para os pés dela se ela está totalmente anestesiado. No caso de um rato não ser completamente anestesiados com a dose inicial, o pesquisador pode administrar um outro ¼ ou C da dose original da mistura de anestésico, dependendo do tamanho do animal e / ou o nível de sedação que o rato já atingiu . No entanto, isso poderia increase a possibilidade de uma reacção adversa à anestesia, e pode também resultar no rato sendo mais profundamente anestesiados e / ou anestesiados por um longo período de tempo.
Nota: Se a ordenha mais de uma barragem, que é necessário escalonar oxitocina e anestésicos injectáveis devido à meia-vida curta de oxitocina e tempos de sedação de cetamina e xilazina. - Aplique uma pequena quantidade de lubrificante olho para o canto de cada olho e se espalhar para evitar que os olhos do rato de secar sob anestesia.
3. Coleta de leite
A coleta do leite é mais facilmente executada com dois pesquisadores: um pesquisador para segurar o rato anestesiado ao expressar manualmente o leite (referido como R1), e um pesquisador para recolher o leite (R2). Este método também pode ser realizado com uma pessoa, se o rato é fixada sobre uma superfície plana, para evitar danos.
- R2 deve ser equipado com as almofadas da preparação do álcool estéril, um pip P-200Etman, uma ponteira limpa para cada rato, e um recipiente para armazenar o leite, como um tubo Eppendorf de 1,5 ml ou uma cryovial 1,2 ml (ver Tabela de Materiais).
- Como a ocitocina começa a fazer efeito, a descida do leite se tornará visível na área mamária do rato (ver Figura 1A). R1: Retire uma compressa embebida em álcool preparação estéril e limpe a área mamária do mouse para limpar a área antes da ordenha. Expressar manualmente leite da teta, utilizando o polegar e dedo indicador para massajar suavemente e apertar o tecido mamário de um movimento para cima até que uma gota visível de leite começa a formar-se na base da teta.
- Pressione o êmbolo Pipetman P-200 à sua primeira parada para liberar o ar para fora da ponteira e se preparar para a coleta de leite.
- Posicione a ponta da pipeta no topo da gota de leite e retire o leite na ponta da pipeta, liberando lentamente a pressão sobre o êmbolo. Tome cuidado para não colocar a ponta muito perto do teto ou da pele (verFigura 1B). Não é necessário para libertar completamente o êmbolo, como esta vai puxar o leite todo o caminho para o topo da ponta da pipeta e fará com que seja difícil para expelir o leite muitas vezes viscoso para dentro do recipiente de retenção.
- Expelir o leite no recipiente, utilizando o polegar para pressionar o êmbolo após a primeira paragem (ver Figura 1C). Para facilitar a expulsão de pequenos volumes, pressionar a ponta da pipeta contra o lado do tubo, de modo que o líquido não se perde.
- Continue a expressar manualmente leite de cada teta, movendo-se em um ou outro sentido horário ou anti-horário, de modo a não pular nenhuma tetas. É ao mesmo tempo aceitável e útil para voltar e expressar continuamente leite da mesma teta deveria produzir mais leite do que o outro.
4. Reversão anestésica na Barragem
- Na maioria dos casos, é comum que a represa para começar a começar a acordar durante o processo de ordenha. Se este não for o caso, colocar a barragem em um cage indiretamente, debaixo de uma fonte de calor, como um cobertor circulando aquecido, até que ela começa a acordar.
Nota: Como a barragem começa a acordar, manter observação atenta de sua atividade até que ela é capaz de andar sobre a sua gaiola com ela própria. - Uma vez que a barragem está se movendo sobre a gaiola sem luta, colocá-la de volta em sua gaiola original com sua ninhada. Sem efeitos nocivos têm sido observados em relação à capacidade dos filhotes para alimentar após a coleta do leite.
2. Muntjac ordenha Protocolo
Os métodos descritos neste protocolo foram aprovados pelo IACUC.
1. Separação da Silva de Offspring
- Selecione o doe para serem ordenhadas. Veado muntjac Reeves 'geralmente dão à luz a um jovem corça 2. Leite a corça do dia depois do parto para permitir a corça oportunidade para ganhar acesso a nutrientes essenciais no colostro 8.
Nota: O fulvo geralmente se esconde e não reaparecer durante o procedure; separação do binômio mãe-filho não é necessário.
2. Administração de ocitocina, anestesia e Eye Lubrificante
- Administrar 10 UI / kg de ocitocina por via intramuscular (IM). A ocitocina é um hormônio que atua sobre as glândulas mamárias das fêmeas lactantes para estimular o let-down do leite. A ocitocina pode ser adquirido a partir de um veterinário.
- Administrar o anestésico BAM IM 11 butorfanol contendo 0,45 mg / kg, azaperona 0,25 mg / kg, medetomadine 0,07 mg / kg. Uma dose da mistura de anestésico BAM vai sedar um muntjac por aproximadamente 20-30 min, que fornece tempo suficiente para coleta de leite completa. Outra opção para o anestésico é midazolam a 1-2 mg / kg, o que irá sedar um muntíaco durante aproximadamente 10-15 min. Enquanto isto proporciona o tempo adequado para a recolha de leite, este anestésico é metabolizada de forma mais rápida do que BAM e o animal pode tentar escapar no final do período de tempo mais curto.
Nota: resposta mínima à dor, Reflexos menores ao tocar as orelhas, seguido pela capacidade de R1 para segurar o MJ sem esforço indica que o animal foi anestesiado com sucesso.
Nota: No caso de um muntíaco não ser completamente anestesiados com a dose inicial, o pesquisador pode administrar um outro ¼ ou C da dose original da mistura de anestésico, dependendo do tamanho do animal e / ou o nível de sedação, que já tenha sido conseguida. No entanto, isto pode aumentar a probabilidade de uma reacção adversa à anestesia, e pode também resultar na muntíaco ser mais profundamente anestesiados e / ou anestesiados por um longo período de tempo. - Aplique uma pequena quantidade de lubrificante no canto de cada olho e se espalhar para evitar que os olhos do muntjac de secar sob anestesia.
3. Coleta de leite
A coleta do leite é mais facilmente executada com dois pesquisadores; um pesquisador para segurar o muntjac anestesiado ema volta ao expressar manualmente o leite (Referido como R1), e um segundo pesquisador para manter a cabeça do muntjac em uma posição confortável e segura e para recolher o leite (R2).
- Dependendo do anestésico utilizado, a ordenha deve ser realizada ou 1) em suas canetas para fornecer um lugar seguro para eles que eles deveriam acordar durante o procedimento (induzido por midazolam) 2) ou em uma ante-sala sem cama para manter a limpeza (BAM- induzida).
- R1 e R2 deve ser equipado com uma gaze embebida com etanol e vários tubos de 15 ml de polipropileno cónicos para segurar o leite.
- Como a ocitocina começa a fazer efeito, a descida do leite se tornará visível na área mamária do muntjac. R1: Higienizar as mãos e os dedos enluvados, bem como todo o úbere e cada teto individual do animal com a gaze embebida em álcool. R2: Segure a cabeça do muntjac em uma posição segura e confortável para permitir a facilidade de respiração e ajudar a prevenir a regurgitação rúmen. Segure os cl tubo de coleta ose para a tetina sendo ordenhada sem tocá-lo para evitar a contaminação potencial.
- Expresse o leite de uma teta, usando o polegar eo dedo indicador para apertar suavemente o tecido mamário em um movimento ascendente até o teto é ingurgitadas com leite, e rolar suavemente o leite para fora do teto e no tubo que R2 está segurando (ver Figura 2 ).
- Nota: O leite sai em um córrego, por isso é importante para R2 para ter o tubo de coleta posicionada de modo que pouco ou nenhum leite será desperdiçado.
- O úbere da muntjac é dividido em quadrantes. R1: Continue a extrair o leite de cada quadrante até que o leite já não flui facilmente. Se o leite não pode ser expresso a partir de uma teta, expresso a partir de todas as outras tetinas antes de voltar para o primeiro. É ao mesmo tempo aceitável e útil para voltar e expressar continuamente leite da mesma teta deveria produzir mais leite do que o outro.
4. Reversão anestésica no DOE
t "> É comum que doe induzido por midazolam para começar a acordar durante o processo de ordenha. Na maioria dos casos, a fêmea vai tentar escapar antes de todo o leite tem sido expressa. contenção Menor é usado em um esforço para aumentar o leite produção, porém a segurança eo conforto de ambos os pesquisadores e os doe são igualmente importantes.- Administrar atipamezole em 2,5 mg / mg medetomadine por via subcutânea para a reversão rápida do BAM anestesiados doe.
Nota: Com os dois tipos de anestesia, é necessário manter uma estreita observação do doe até que ela é capaz de andar por conta própria, sem tropeçar ou cair, e é capaz de comer e beber sem medo de aspiração ou asfixia. Sem efeitos nocivos têm sido observados em relação à capacidade do fulvo para amamentar após a coleta do leite.
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Representative Results
Mouse
A partir de nossas experiências, nós determinamos que é possível recolher cerca de 100-400 mL de leite de um rato de laboratório, dependendo de diversas variáveis. Estas variáveis incluem: 1) a quantidade de tempo reservado para a coleta, 2) a dose de ocitocina administrada, 3) quantos filhotes da barragem é atualmente de enfermagem e 4) o período de tempo após o parto. Os nossos estudos mostraram que o rendimento mais elevado é obtido quando os reservatórios são separados das suas crias durante pelo menos 2 horas, e, pelo menos, 45 minutos até uma hora é retirada por ratinho para a ordenha. Volumes máximos de leite foram colhidas de 8-12 dias após o parto através de 2 UI / kg de ocitocina. Nossos resultados são na sua maioria, de acordo com outros estudos, onde o tamanho da leitegada foi positivamente correlacionada com a produção de leite 9 (ver Figura 3).
Muntjac
Embora a quantidade de leite harinvestido do muntjac foi variável de dia para dia, fomos capazes de coletar 5 a 30 ml de leite / barragem / sessão, dependendo da anestesia utilizada e / ou pós-parto tempo. Veado muntjac são polyestrous; leite pode ser coletado em vários momentos ao longo do ano 2 (ver Tabela 1). Doe induzida por Midazolam permaneceu sob anestesia para o tão pouco quanto 10 minutos, permitindo a coleções de menor volume (normalmente 5-30 ml), enquanto que doe induzida por BAM sofrido um longo período de efeito anestésico (20-30 min), permitindo a expressão de leite completo (15-130 ml). Coleções de leite foram interrompidas quando o leite já não era mais a ser produzido em quantidades suficientes pelo corça, eo fulvo correspondente estava sendo alimentada com uma dieta de forragem principalmente feno.
Figura 1. (A) A barragem217; s tetas se tornam cheios de leite após a injeção de ocitocina (B) Recolha de leite a partir de uma barragem anestesiados com uma P-200 pipeta (C) de ejeção do leite em um 1,2 ml cryovial...
Leite Muntjac Figura 2. É coletado em um tubo cônico de 15 ml.
Figura 3. Produção de leite aproximado coletadas de camundongos com base no tamanho da maca, e idade dos filhotes.
Coll Leite Tabela 1.exão de início e término para lactantes barragens muntjac Reeves '.
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Discussion
Mouse
Existem vários factores a ter em consideração aquando da recolha de leite de um rato, incluindo 1) a quantidade de tempo reservado para a coleta, 2) a dose de ocitocina administrada, 3) quantos filhotes da barragem é atualmente de enfermagem e 4) a quantidade de tempo que se passou desde o parto, no momento da coleta. Usando estudos anteriores como diretrizes, partimos para otimizar as condições de produção de leite.
Pesquisas anteriores já haviam diretamente relacionada a produção de leite com o tamanho da leitegada 8. Infelizmente, o tamanho de ninhada é uma variável que não pode ser controlado. No entanto, o tempo de ordenha pós parto pode ser controlada. De acordo com o secreção de leite máxima Laboratório Rato está em 8-10 dias após o parto 9. Nossa experiência é em congruência com esta afirmação.
Tem sido demonstrado que a oxitocina desempenha um papel insubstituível no leite pós produçãoparto 10. Doses de oxitocina que variam de 0,1 UI / kg 9-4 UI / kg 6 foram relatados para a coleta de leite a partir de roedores 6,7,9. Iniciamos nosso estudo com a administração a menor dose sugerida, 0,1 UI / kg 9. Usando esta dosagem, a quantidade de leite produzido pela rato era muito pequena para medir ou coletar. Mediante o aumento da dose de oxitocina a 2 Ul / kg de 6,7, a produção de leite foi significativamente superior em cerca de 120 ul. Porque queríamos usar a menor dose de ocitocina para conseguir coleta de leite ideal, nós não administrar doses superiores a 2 UI / kg.
A produção de leite também depende da quantidade de tempo reservado para a coleção. Nós determinamos que um mínimo de 3 horas é necessário para hr ótima coleção-2 para os filhotes de ser separadas da barragem e 1 hora para a preparação de material e coleção. Coleta de leite de várias barragens em uma sessão irá diminuir o tempo total necessáriocolher um volume específico de leite, ou seja, 2 horas para separar os filhotes, 30 min de materiais de instalação e de 20-30 min para recolher o leite de cada barragem. Cada barragem deve ser monitorado até que eles estão acordados antes de serem colocados de volta com seus filhotes. Temos notado que quanto mais tempo reservado para a ordenha leva a rendimentos mais elevados do leite, pois o mouse pode ser ordenhadas até que ela recupere a consciência.
Instâncias surgem com modelos animais que vai afetar a produção de leite. Um problema comum é a presença de sangue ou exsudato no leite de mães mais velhas que foram criados várias vezes e têm grandes ninhadas, ou em barragens que estão amamentando a sua primeira ninhada. Caso isso ocorra, sugerimos a interrupção recolha de leite que teta particular. É aconselhável alterar pontas de pipeta no momento, e rejeitar qualquer exsudado ou sangue.
Investigadores que realizem este método também deve estar ciente de que, como é frequentemente o caso quando se utiliza modelos animais, os resultados variam (Figura3). Se a menos do que a quantidade ideal de leite é coletado em uma única sessão, é preferível repetir o procedimento em um momento posterior (por exemplo, 24-48 h), em vez de alterar as condições experimentais para forçar liberação de leite.
Muntjac
O volume de leite coletado de barragens muntjac Reeves era dependente do anestésico utilizado. Nossa anestésico inicial de escolha foi midazolam. Midazolam fornecido sedação suficiente para permitir a contenção por curtos períodos de tempo, ou seja, se R1 tinha um temperamento calmo e poderia manter o muntjac calma, R2 poderia assumir a ordenha para aumentar o rendimento antes do muntjac acordava-a segurança eo conforto de ambos animal e manipulador foram de extrema importância e que abandonaram o esforço de ordenha se sentiu ou foi comprometida. Descobrimos que muntjac doe rapidamente tornar-se tolerante ao midazolam e que seria necessário doses mais altas após exposição repetida, fazer coleta de leite duas vezes por semana cada vez mais difícil.
A escassez de midazolam, juntamente com uma tolerância de construção, levou-nos a pesquisar um anestésico alternativo. Uma mistura de Butorfanol, Azaperone e Medetomadine (BAM) é efetivamente utilizado para a imobilização de Cervos da cauda branca 11. Em nossas mãos, o coquetel fornecido BAM anestesia suficientes para permitir a coleta de volumes aceitáveis de leite de uma forma segura, com menor tolerância à droga após o uso repetido e com melhor controle na reversão dos efeitos da anestesia.
Algumas barragens muntjac sofria de tetas sensíveis e / ou foram mães pela primeira vez. Estes muntjac desenvolvido hematomas nas tetas durante o processo de ordenha, eo fluxo de leite diminuiu ou parou completamente, levando-nos a interromper a sessão em curso. Se isto ocorrer, deve-se usar uma técnica de ordenha mais suave em uma tentativa de evitar desconforto ou hematomas nas tetas.
e_content "> A produção de leite parecia aumentar e diminuir em várias ocasiões. colheitas baixas de leite pode ser causada por 1) os filhotes terem amamentado pouco antes de coleções ou 2) um declínio na produção de leite, devido ao processo natural de fulvo desmame.Embora possa ser um processo de tentar obter um volume considerável de leite de pequenos modelos animais, nosso trabalho mostra que é na verdade uma possibilidade para mouse e modelos muntjac; nem exigindo extensa habilidade nem bolsos profundos, simplesmente perseverança.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials—Mouse | |||
| Ketamine (KetaVed 100 mg/ml) (dose: 80-100 mg/kg) | MWI/Vedco | 011075 | |
| Xylazine (TranquiVed 100 mg/ml) (dose: 5-10 mg/kg) | MWI/Vedco | NADA 139236 | |
| Eye lubricant | MWI/Apexa | 701013 | |
| Oxytocin (2 IU/kg) | Vet One | 501013 | |
| Materials—Muntjac | |||
| Midazolam (1-2 mg/kg) | Amerisource Bergen Drug Corp | 924326 | Optional: researcher can either use Midazolam on its own or BAM combination as an anesthetic |
| Butorphanol tartrate (Torbugesic) (0.45 mg/kg) | Fort Dodge Animal Health | NADA 135-780 | |
| Azaperone tartrate (0.25 mg/kg) | ZooPharm | ||
| Medetomadine HCl (0.07 mg/kg) | ZooPharm | ||
| Antipamezol hydrochloride (Antisedan) (dose: 0.25 mg/kg) | Orion Corporation | NADA 141-033 | |
| Oxytocin (10 IU/kg) | Vet One | 501013 | |
| Equipment—Mouse | |||
| P-200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μl pipette tips | Light Labs | B-2004-SH | |
| 1 ml syringes | MWI | 005427 | |
| 27 G needles | MWI | 002031 | |
| Equipment—Muntjac | |||
| 15 ml conical tubes | VWR | 21008-918 | |
| 22 G needles | MWI | 873 | |
| 3 ml luer lock syringes | MWI | 001377 | |
References
- Dueling, S. Muntiacus reevesi. Animal Diversity Web. , Available from: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Muntiacus_reevesi (2004).
- Pei, K., Taber, R., O'Gara, B., Wang, Y. Breeding cycle of the Formosan Reeves muntjac (Muntiacus reevesi micrurus) in northern Taiwan, Republic of China. Mammalia. 59 (2), 223-228 (1995).
- Browning, S. R. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J. Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
- Van de perre, P. Transfer of antibody via mother's milk. Vaccine. 21 (24), 3374-3376 (2003).
- Maden, C. Genetically modified mice produce human milk protein. BioNews. , (2009).
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- Nishimori, K., Young, L. J., Guo, Q., Wang, Z., Insel, T. R., Matzuk, M. M. Oxytocin is required for nursing but is not essential for parturition or reproductive behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (21), 11699-11704 (1996).
- Miller, B. F., Osborn, D. A., Lance, W. R., Howze, M. M., Warren, R. J., Miller, K. V. Butorphanol-azaperone-medetomidine for immobilization of captive white-tailed deer. 45 (2), 457-467 (2009).
