Introduction
動物モデルは、 インビトロ分析によって得られることができない疾患病理への洞察を提供しています。最も有効な結果を提供するためには、疾患および対象の種と密接に関連して動物モデルを使用することが重要である。たとえば、リーブス」キョン（ キョン ）、小アジアの鹿1,2、およびシカのプリオンタンパク質（CerTgPrP）3を発現するトランスジェニックマウスは、シカ科の種のための有用な動物モデルである。両種は、年間を通して繁殖が可能、多発情性のある、したがって、妊娠関連組織および体液のための一貫性のあるソースは、シカ科生物学の特定のメカニズムを研究する。牛乳の研究では、ヒトより動物モデルで達成より簡単に（かつ安価に）されているアプリケーションの広大な配列を持っている。研究者たちは、1）感染症伝達の潜在的な原因として、牛乳や初乳を調査できた、develoの中で子孫に母親から転送された2）免疫グロブリン受動免疫4および3）ラクトフェリンのpment、研究者は、現在、商業的に5を生産しようとしている、受動免疫に関与するヒトの母乳中に見出されるタンパク質。
小さな動物から牛乳のかなりの量を収集することは困難な作業であることを証明することができます。ロジャースは、その後、マウスを使用したラット6からミルクを収集するための手法を提案した。 DePeters及びハービ次いで真空源に取り付けられた搾乳ユニット（の構築を必要とする牛乳の収集、パスツールピペットに取り付けられたゴム製のピペット球によって産生さ手動生成された真空を用いたもの、及び第二の2つの方法を提案し、このようなマウスのミルク7を収穫する蛇口）など。ここでは、マウスだけで容易に利用可能な実験装置と基本的な技術的なスキルを必要としリーブス」キョン鹿、両方からミルクを収集するためのシンプルで低コストの方法を提案する。我々の方法は、様々なミルクの十分なボリュームをもたらすアプリケーション。
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Protocol
1。マウス搾乳プロトコル
このプロトコルで説明する方法は、動物実験委員会によって承認された。
子孫からのダムの1。分離
- 搾乳するダムを選択します。 8〜12日で4つ以上の仔のごみでダムを選択して、コレクションが21日までの任意の時点ポスト分娩アップ時に可能であるが、コレクションの最大の乳提供するために分娩を投稿してください。
- 搾乳前に彼女ごみ少なくとも2時間からダムを分離する。
注：特定の期間内に複数のダムを牛乳に1欲求必要があります、それが十分な食料と水の供給と同じケージで分離ダムを収容するために許容可能である。
オキシトシン、麻酔および眼潤滑剤の2。管理
- 腹腔内にオキシトシンの2 IU / kgの（IP）を管理します。オキシトシンは、ミルクの放出を刺激するために授乳雌の乳腺に作用するホルモンである。オキシトシンは、FRを取得することが可能OM獣医。
- 5月10日mg / kgのキシラジンのIPと組み合わせて、80〜100 mg / kgのケタミンを含む麻酔薬の混合物を管理します。たとえば、10 mlストック麻酔混合物を約30グラムの体重のマウスについて予め用意することができた0.1mlのキシラジン8.9 mlのH 2 O、1.0mlのケタミンを含むであろう。 0.25ミリリットルの合計麻酔薬はミルク収集のための十分な時間を提供する必要があり、これを約20〜30分のために、このサイズのマウスを鎮静します。
注：動物が正常に麻酔をされたことを確認するには、ゆっくりと固体表面上の彼女の胃に彼女を置く。彼女は彼女の足を動かしたり、彼女が完全に麻酔をかけている場合、彼女の足に上昇しようとするべきではありません。完全オリジナルの投与量で麻酔されていないマウスの場合、研究者は別のものを投与することができる4あるいは麻酔薬混合物は、マウスが既に達成しているマウスおよび/または鎮静のレベルの大きさに応じて、元の投与量の2分の1 。しかし、これは私ができた麻酔に対する有害反応の可能性をncrease、またマウスは、より長い期間のためのより深く麻酔および/または麻酔をかけている可能性があります。
注：複数のダムを搾乳する場合は、ケタミンおよびキシラジンのためにオキシトシンとオキシトシンの短い半減期のために麻酔注射し、鎮静時間をずらすことが必要である。 - それぞれの目の隅に目の潤滑剤を少量塗布し、麻酔下ながら乾燥からマウスの目を防ぐために広がった。
3。ミルクコレクション
牛乳（R2）を収集するために手動で（R1と称する）ミルクを表現しながら、麻酔したマウスを保持する一つの研究者、一研究者：乳コレクションは最も容易に2人の研究者によって行われる。マウスは危害を避けるために、平坦な表面上に固定されている場合、この方法はまた、一人で行うことができる。
- R2は、無菌アルコールプレップパッドと、P-200のピップを装備する必要がありますetman、各マウスのきれいなピペットチップ、およびそのような1.5ミリリットルエッペンドルフチューブまたは1.2ミリリットルクライオバイアルなどの牛乳を、（材料の表を参照）を保持するための容器。
- オキシトシンを有効にし始めると、ミルクレットダウン（ 図1A参照 ）は、マウスの乳腺領域に見えるようになります。 R1：無菌アルコールプレップパッドをラップを解除し、ゆっくりと前に搾乳する領域をきれいにするには、マウスの乳腺の領域を拭く。手動で牛乳の可視ビーズは乳頭の基部に形成され始めるまで、静かに上向きの動きで乳房組織をマッサージし、圧迫する、親指と人差し指を使って、乳頭からミルクを表現しています。
- ピペットチップから空気を放出し、牛乳の収集のために準備するために、その最初のピットストップへのP-200ピペットマンのプランジャーを押してください。
- ミルクの滴の一番上にピペットチップを置き、静かにゆっくりとプランジャーに圧力を解放することによってピペットチップに牛乳を引き出します。 （参照乳首や皮膚に近すぎるチップを入れないように注意してください図1B）。これはすべての方法ピペットチップの上部に牛乳を引っ張ってくると、それが困難な保持容器に、多くの場合、粘性のミルクを排出するようになりますように、完全にプランジャーを解放する必要はありません。
- （ 図1C参照 ）の最初のピットストップを過ぎてのプランジャーを押すように、親指を使って、容器にミルクを排出する。全く液体が失われないように、少量の排除を容易にするために、チューブの側面にピペットチップを押してください。
- 手動で乳首をスキップしないように、時計回りか反時計方向のいずれかに移動し、それぞれの乳頭からミルクを発現し続ける。それはに戻って来て、それが他よりも多くの牛乳を生産する必要があり、継続的に同じ乳頭からミルクを表現するために許容され、便利でもある。
ダム4。麻酔逆転
- ほとんどの場合、それはダムが搾乳プロセス中にウェイクアップを開始し始めることが一般的である。そうでない場合は、CAGにダムを配置このような加熱された循環毛布などの熱源の下に間接的にE、彼女は目を覚ますし始めるまで。
注：ダムが目を覚ますし始めると、彼女は彼女自身の彼女のケージについて歩くことができるようになるまで、彼女の活動の注意深い観察を保つ。 - ダムが闘争することなく、ケージ動き回っていると、彼女のゴミと彼女のオリジナルケージに彼女の背中を置く。悪影響を与えることなく、牛乳コレクション後養うために子犬の能力に関連して指摘されていない。
2。キョン搾乳プロトコル
このプロトコルで説明する方法は、動物実験委員会によって承認された。
子孫からのドウの1。分離
- 搾乳するDOEを選択します。リーブス「キョンの鹿は、一般的に1子鹿2を出産する。初乳8で必須栄養素へのアクセスを得るため鹿の子機会を可能にするために、DOEの出産の翌日ミルク。
注意：子鹿は通常、非表示にし、PROC時に再表示されません。edure;母の子孫のペアの分離は必要ありません。
オキシトシン、麻酔および眼潤滑剤の2。管理
- 筋肉内にオキシトシン10 IU / kgの（IM）を管理します。オキシトシンは、牛乳のレットダウンを刺激するために、授乳中の雌の乳腺に作用するホルモンである。オキシトシンは、獣医師から取得することができる。
- BAM麻酔IM 11含むブトルファノール0.45 mg / kgでの管理、0.25 mg / kgのアザペロン、0.07 mg / kgでのmedetomadine。 BAMの麻酔混合物の1回投与は、完全なミルク収集のための十分な時間を提供して約20〜30分間キョンを鎮静します。麻酔のための別のオプションは、約10〜15分間キョンを鎮静します1〜2 mg / kgで、でミダゾラムです。これは牛乳収集のための十分な時間を提供するが、この麻酔薬は、より迅速にBAMよりも代謝され、動物は短い時間期間の終了時に脱出しようと試みることができる。
注：痛みに対する最小限の応答、闘争なしでMJを保持するために、R1の能力が続く耳に触れたとき、マイナー反射は、動物が正常に麻酔をされたことを示します。
注：完全オリジナルの投与量で麻酔されていないキョンの場合、研究者は別のものを投与することができる4あるいは既にされている鎮静の動物および/またはレベルの大きさに応じて麻酔薬の混合物の本来の投与量の2分の1達成しました。しかしながら、これは、麻酔に対する有害反応の可能性を増大させることができ、また、キョンより深く麻酔し、および/またはより長い期間を麻酔さをもたらし得る。 - 麻酔下ながら乾燥からキョンの目を防ぐために、それぞれの目と普及の隅に潤滑油を少量を適用します。
3。ミルクコレクション
牛乳コレクションは、最も簡単に2人の研究者によって行われる。に麻酔をかけたキョンを保持する1研究者手動（R1と呼ばれる）ミルクを表現しながら、ラップ、そして快適で安全な位置にキョンの頭を保つために、牛乳（R2）を収集するために第二の研究者。
- 使用麻酔薬によっては、搾乳者は（ミダゾラムにより誘導される）または2）のベッドのない控え室での清浄度を維持するために、（BAM-手順の間に目を覚ますべき彼らのために安全な場所を提供するために、自分のペンのいずれか1）を実行する必要があります誘導された）。
- R1とR2は、牛乳を保持するために、エタノールに浸したガーゼといくつかの15ミリリットルコニカルポリプロピレンチューブに装備する必要があります。
- オキシトシンを有効にし始めると、ミルクレットダウンはキョンの乳腺領域に表示になります。 R1：手袋をはめた手や指だけでなく、全体の乳房とエタノールに浸したガーゼで動物の個々の乳頭をサニタイズ。 R2：呼吸のしやすさを可能にし、第一胃の逆流を防ぐために、安全で楽な姿勢でキョンの頭を持ってください。コレクションチューブCLを保持する潜在的な汚染を防ぐために、それに触れることなく、搾乳されている乳首へオース。
- 乳首がミルクで充血されるまで、ゆっくりと上向きの動きで乳房組織を圧迫するために親指と人差し指を使って、1乳頭からミルクを表現し、ゆっくりと乳首から、R2が保持しているチューブに牛乳をロールします（ 図2を参照してください。 ）。
- 注：R2は無し、牛乳はほとんどが無駄になりますように収集管が配置されていることが重要であるので、ミルクは、ストリームに出てくる。
- キョンの乳房を象限に分割されている。 R1：牛乳はもはや簡単に流れるまで各象限からミルクを発現し続けるん。牛乳は1乳頭から発現させることができない場合は、最初に戻る前に他のすべての乳首から発現する。それはに戻って来て、それが他よりも多くの牛乳を生産する必要があり、継続的に同じ乳頭からミルクを表現するために許容され、便利でもある。
ドウ中の4。麻酔逆転
すべてのミルクが表明される前にTが ">ミダゾラムによって誘発されるDOEは搾乳プロセス中に目を覚ますために開始することが一般的です。ほとんどの場合、DOEは脱出しようとします。マイナー拘束ミルクを高めるための努力で使用されている収量はあるが、研究者とDOEの両方の安全性と快適性も同様に重要である。- BAMの急速な反転のため/ mgのmedetomadine皮下2.5ミリグラムでアチパメゾール管理DOEを麻酔。
注意：麻酔薬の両方のタイプで、それは彼女がつまずきや転倒することなく、彼女自身で歩くことができるようになるまで、DOEの注意深い観察を維持する必要があり、誤嚥の恐怖や窒息せずに食べて、飲んですることができます。悪影響を与えることなく、牛乳コレクション後看護する子鹿の能力に関連して指摘されていない。
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Representative Results
マウス
我々の実験から、我々は、いくつかの変数に依存して、ある実験用マウスからの乳の約100-400液を収集することが可能であると判断した。これらの変数）は、コレクションのために取っておく時間の長さ、2）オキシトシンの投与量は、投与を、1を含む3）ダムは現在、看護や時間ポスト分娩の4）の量でどのように多くの子犬。我々の研究は、ダムは、少なくとも2時間その子孫から分離されるときに、最も高い収率が得られ、時間に少なくとも45分間は、搾乳のために、マウスごとに確保されていることを示している。最大の乳量は8〜12日は、オキシトシンの2 IU / kgのを使用して分娩後に回収された。我々の結果は、産子数を積極乳量9（ 図3参照）と相関していた他の研究に基づいて、大部分である。
ホエジカ
ミルクHARの量であるがキョンからの既得日から今日に至るまで、我々が使用し麻酔および/または時間ポスト分娩に応じて、30ミリリットルのミルク/ダム/セッションに5を収集することができました変数だった。キョンの鹿は多発情性のある;ミルクは（ 表1を参照）2年間を通して様々な時点で収集することができる。 BAMに誘導されるDOEは、完全なミルクの発現を可能にする、麻酔効果（20〜30分）より長い期間持続に対しミダゾラム誘発性DOEは、小容量のコレクション（、典型的には5〜30 mL）を可能にする、わずか10分間麻酔下で推移し（15〜130ミリリットル）。牛乳は、もはやDOEが十分な量で生産されていた、それに対応する子鹿は主に干し草飼料の飼料で養われていた時にミルクコレクションは中止されませんでした。
図1（A）ダム217、S乳首はオキシトシン注射時ミルク充血になるミルクの（B）コレクションのP-200ピペットマンを用いて麻酔ダムから牛乳の（C）の吐出クライオバイアル1.2ミリリットルに。。。
図2キョンミルクを15mlのコニカルチューブに回収される。
図3。おおよその乳量は、ごみの大きさに基づいて、マウスから採取し、仔の時代。
表1。ミルクコルECTION開始およびリーブス」キョンダム授乳の日付を終了します。
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Discussion
マウス
1を含むマウスの乳を収集するとき考慮すべきいくつかの要因が、）は、コレクションのために取っておく時間の量、投与オキシトシンの2）の投与量、3）ダムは現在、看護や4）の量でどのように多くの子犬があります収集時に分娩から経過した時間。ガイドラインとしてこれまでの研究を用いて、乳量のための条件を最適化するために設定してください。
これまでの研究では、直接、産子数8と乳量と相関している。残念ながら、産子数を制御することができません変数です。しかし、搾乳ポスト分娩の時間を制御することができる。 実験マウスの最大のミルクの分泌に応じて8〜10日後分娩9である。我々の経験では、この文と合同である。
なお、オキシトシンは乳生産後にかけがえのない役割を果たしていることが示された分娩10。 0.1 IU / kgを9から4 IU / kgの6の範囲のオキシトシンの投与量は、げっ歯類6,7,9から牛乳の収集のために報告されている。我々は、提案された最低用量、0.1 IU / kgの9を投与することにより、我々の研究を始めた。この投与量を使用して、マウスが産生する乳汁の量は、測定したり収集するには小さすぎた。 2 IU / kgの6,7にオキシトシンの投与量を増加すると、乳量は約120μLでかなり高かった。我々は最適なミルクの収集を実現するためにオキシトシンの最低の投与量を使用したかったので、我々は2 IU / kgのより高い用量を投与しなかった。
乳量は、コレクションのために取っておく時間の長さに依存している。我々は、3時間の最小値が材料の調製及び収集のために、ダム、1時間から分離するための仔のための最適なコレクション2時間必要であることを決定した。 1セッションで複数のダムからミルクを収集するのに必要な時間が減少します各ダムの乳を収集するために子犬、セットアップ材料に30分20〜30分を分離するために、特定のミルクの量、 すなわち 、2時間後に収穫します。彼らは彼らの子犬と戻される前に目を覚ましているまで、各ダムは監視されなければならない。私たちは、彼女が意識を取り戻すまで、マウスは搾乳することができるので、搾乳のために確保され、より多くの時間が、より高い乳量につながることを指摘している。
インスタンスは、乳量に影響する動物モデルで発生です。一つの一般的な問題を繰り返し交配し、大きなリットルを持っているか、彼らの最初のゴミを看護しているダムにあった古いダムのミルク中の血液や滲出液の存在である。これが発生した場合、我々は、その特定の乳首からミルクの収集を中止示唆。それは、この時点ではピペットチップを切り替え、任意の滲出液や血液を廃棄することをお勧めします。
この方法を実施する研究者はまた、動物モデルを使用しているとき、多くの場合そうであるように、結果は（ 図に変化していることに注意する必要があります3）。乳未満の最適量は、1つのセッションで収集される場合、それは後の時間（ 例えば、24〜48時間）で、手順を繰り返すのではなく、ミルクの放出を強制的に実験条件を変化させることが好ましい。
ホエジカ
リーブス「キョンダムから収集牛乳の量が使用される麻酔薬に依存していた。選択した私たちの最初の麻酔薬がミダゾラムた。ミダゾラムは時間すなわち短期間の拘束を可能にするのに十分な鎮静を提供R1は穏やかな気質を持っていたし、キョンの冷静を保つことができればキョンが目覚め、だろう前に両方の安全性と快適さを、R2は、歩留まりを向上させるために搾乳を引き継ぐことができ動物やハンドラは、最重要のものであり、我々はどちらかが侵害されたと感じた場合、私たちは、搾乳作業を断念した。我々は、高用量の反復暴露後に必要になるとキョンのDOEはすぐにミダゾラムに対して寛容になることを発見し、ミルク収集が週二回、ますます困難になる。
建物の許容範囲と相まってミダゾラムの不足は、代替麻酔薬を研究するために私達を導いた。ブトルファノール、アザペロンとMedetomadine（BAM）の混合物を効果的に白い尾の鹿11の固定化に使用されている。私たちの手では、BAMカクテルは繰り返し使用後の少ない薬剤耐性を持つと、麻酔薬の作用を逆転させるより良いコントロールと、安全な方法で牛乳の許容ボリュームの集合を可能にするのに十分な麻酔を提供した。
いくつかのキョンダムは敏感乳房に苦しんおよび/または初めての母親だった。これらのキョンは、搾乳プロセス中に乳首にあざを開発し、ミルクの流れが遅くなったり、進行中のセッションを中止するために私達を促す、完全に停止。これが発生した場合、1が乳首に不快感や打撲を防止するための試みで、より穏やかな搾乳技術を使用する必要があります。
e_content ">牛乳生産）がLowのミルクの収穫が1によって引き起こされることがあります。何度か盛衰に現れfawnsは直前のコレクションに、または2）牛乳生産の減少により、鹿の子離乳の自然なプロセスに看病した。それは小さな動物モデルからの牛乳のかなりのボリュームを取得しようとし、プロセスになることができますが、私たちの仕事は、それが実際にマウスとキョンモデルの両方の可能性であることを示している。どちらも豊富なスキルも深いポケット、単に忍耐力を必要としない。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials—Mouse | |||
| Ketamine (KetaVed 100 mg/ml) (dose: 80-100 mg/kg) | MWI/Vedco | 011075 | |
| Xylazine (TranquiVed 100 mg/ml) (dose: 5-10 mg/kg) | MWI/Vedco | NADA 139236 | |
| Eye lubricant | MWI/Apexa | 701013 | |
| Oxytocin (2 IU/kg) | Vet One | 501013 | |
| Materials—Muntjac | |||
| Midazolam (1-2 mg/kg) | Amerisource Bergen Drug Corp | 924326 | Optional: researcher can either use Midazolam on its own or BAM combination as an anesthetic |
| Butorphanol tartrate (Torbugesic) (0.45 mg/kg) | Fort Dodge Animal Health | NADA 135-780 | |
| Azaperone tartrate (0.25 mg/kg) | ZooPharm | ||
| Medetomadine HCl (0.07 mg/kg) | ZooPharm | ||
| Antipamezol hydrochloride (Antisedan) (dose: 0.25 mg/kg) | Orion Corporation | NADA 141-033 | |
| Oxytocin (10 IU/kg) | Vet One | 501013 | |
| Equipment—Mouse | |||
| P-200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μl pipette tips | Light Labs | B-2004-SH | |
| 1 ml syringes | MWI | 005427 | |
| 27 G needles | MWI | 002031 | |
| Equipment—Muntjac | |||
| 15 ml conical tubes | VWR | 21008-918 | |
| 22 G needles | MWI | 873 | |
| 3 ml luer lock syringes | MWI | 001377 | |
References
- Dueling, S. Muntiacus reevesi. Animal Diversity Web. , Available from: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Muntiacus_reevesi (2004).
- Pei, K., Taber, R., O'Gara, B., Wang, Y. Breeding cycle of the Formosan Reeves muntjac (Muntiacus reevesi micrurus) in northern Taiwan, Republic of China. Mammalia. 59 (2), 223-228 (1995).
- Browning, S. R. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J. Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
- Van de perre, P. Transfer of antibody via mother's milk. Vaccine. 21 (24), 3374-3376 (2003).
- Maden, C. Genetically modified mice produce human milk protein. BioNews. , (2009).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab. Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- Depeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
- Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: effects of litter size and lactation. 84 (1), 127-133 (1986).
- Hedrich, H. J., Bullock, G. R. The laboratory mouse. , 735-736 (2004).
- Nishimori, K., Young, L. J., Guo, Q., Wang, Z., Insel, T. R., Matzuk, M. M. Oxytocin is required for nursing but is not essential for parturition or reproductive behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (21), 11699-11704 (1996).
- Miller, B. F., Osborn, D. A., Lance, W. R., Howze, M. M., Warren, R. J., Miller, K. V. Butorphanol-azaperone-medetomidine for immobilization of captive white-tailed deer. 45 (2), 457-467 (2009).
