Introduction
Djurmodeller ge insikt i sjukdomspatologi, som inte kan erhållas genom in vitro-analys. För att åstadkomma de mest effektiva resultaten, är det viktigt att använda en djurmodell som är nära relaterad till sjukdomen och arter av intresse. Till exempel, Reeves muntjac (muntiacus reevesi), en liten asiatiska rådjur 1,2, och transgena möss som uttrycker den cervid prionprotein (CerTgPrP) 3, är användbara djurmodeller för cervid arter. Båda arterna är polyestrous, vilket gör året runt avel, och därmed en enhetlig källa för graviditetsrelaterade vävnader och vätskor för att studera specifika mekanismer i hjortdjur biologi. Studier av mjölk har ett brett spektrum av applikationer som är mer helt enkelt (och billigt) åstadkommit i djurmodeller än hos människor. Forskare kan undersöka mjölk och råmjölk som en potentiell källa till 1) smittsam sjukdom sprids, 2) immunoglobuliner överförs från mor till avkomma i utveckpment av passiv immunitet 4 och 3) laktoferrin, ett protein som finns i bröstmjölk inblandad i passiv immunitet som forskare för närvarande försöker att producera kommersiellt 5.
Samla en väsentlig mängd av mjölk från små djur kan visa sig vara en svår uppgift. Rogers föreslog en metod för att samla in mjölk från råttor 6, som sedan användes i möss. DePeters och Hovey föreslagit två metoder för uppsamling av mjölk, en med användning av en manuellt genererat vakuum som produceras av en gummi pipett glödlampa ansluten till en pasteurpipett, och en andra som kräver konstruktion av en mjölkningsenhet, som sedan är fäst vid en vakuumkälla (exempelvis som en kran) för att skörda mus mjölk 7. Här föreslår vi en enkel, billig metod för insamling av mjölk från både möss och Reeves muntjac rådjur, som kräver endast lätt tillgängliga laboratorieutrustning och grundläggande teknisk kompetens. Vår metod ger tillräckliga volymer av mjölk för olikaapplikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mouse Mjölkning Protocol
De metoder som beskrivs i detta protokoll har godkänts av IACUC.
1. Separation av dammen från Offspring
- Välj dammen som ska mjölkas. Välj en damm med en kull på 4 eller fler valpar som är 8-12 dagar efter nedkomst för att ge maximal uppsamling av mjölk-även om samlingen är möjlig vid någon tidpunkt efter förlossning upp till 21 dagar.
- Separera dammen från hennes kull minst 2 timmar före mjölkning.
OBS: Om en önskan att mjölka mer än en fördämning i en viss tidsperiod, är det acceptabelt att hysa de separerade dammar i samma bur med tillräckligt med mat och vatten.
2. Administration av Oxytocin, Anestesi-och ögon Smörjmedel
- Administrera 2 IE / kg av oxytocin intraperitonealt (IP). Oxytocin är ett hormon som verkar på mjölkkörtlar hos ammande kvinnor för att stimulera frisättning av mjölk. Oxytocin kan förvärvas frOM en veterinär.
- Administrera en narkosblandning innehållande 80-100 mg / kg ketamin i kombination med 5-10 mg / kg xylazin IP. Till exempel kan en 10 ml lager anestesiblandningar beredas i förväg för möss som väger ca 30 g och skulle omfatta 0,1 ml xylazin, 8,9 ml H2O, och 1,0 ml ketamin. 0,25 ml total bedövningsmedel kommer att söva en mus av denna storlek i ca 20-30 min, vilket bör ge tillräcklig tid för uppsamling av mjölk.
Obs: För att bestämma att djuret har framgångsrikt sövda, försiktigt placera henne på magen på en fast yta; Hon bör inte röra hennes fötter eller försöker stiga till hennes fötter, om hon är helt sövd. I fallet med en mus som inte är helt bedövad med den ursprungliga dosen, kan forskaren administrera annan ¼ eller ½ av den ursprungliga dosen av narkosblandning beroende på storleken på musen och / eller nivå av sedering att musen redan har uppnått . Men detta kan jagncrease risken för en negativ reaktion på anestesi, och även kan resultera i musen som mer djupt sövda och / eller bedövades under en längre tidsperiod.
OBS: Om mjölkning flera dammen, är det nödvändigt att sprida oxytocin och anestesi injektioner på grund av den korta halveringstiden av oxytocin och sedering tider för ketamin och xylazin. - Applicera en liten mängd av ögat smörjmedel till hörnet av varje öga och sprids för att förhindra musens ögon från att torka ut under anestesi.
3. Mjölk Insamling
Mjölk kollektionen är lättast utförs med två forskare: en forskare för att hålla den sövda musen medan manuellt uttrycker mjölk (kallas R1), och en forskare att samla in mjölken (R2). Denna metod kan också utföras med en person, om musen är säkrad på en plan yta för att undvika skada.
- R2 bör vara utrustade med steril alkohol prep pads, en P-200 pipEtman, en ren pipettspets för varje mus, och en behållare för att hålla mjölken, såsom ett 1,5 ml Eppendorf-rör eller en 1,2 ml köldkärlet (se tabell of Materials).
- När oxytocin börjar gälla, kommer mjölkutdrivning blir synliga i musens bröstområdet (se figur 1 A). R1: Packa en steril alkohol prep pad och torka försiktigt bröstområdet på musen för att rengöra området före mjölkning. Uttrycka manuellt mjölk från spenen med hjälp av tummen och pekfingret för att försiktigt massera och pressa bröstvävnad i en uppåtgående rörelse till dess att en synlig sträng av mjölk börjar bildas vid basen av spenen.
- Tryck på P-200 pipetman kolven till sitt första stopp för att släppa ut luft ur pipettspetsen och förbereda för uppsamling av mjölk.
- Placera pipettspetsen på toppen av droppen av mjölk, och försiktigt dra mjölken in i pipettspetsen genom att långsamt släppa trycket på kolven. Se till att inte sätta spetsen för nära spenen eller huden (seFigur 1B). Det är inte nödvändigt att helt frigöra tryckorganet, eftersom detta kommer att dra mjölken hela vägen till toppen av pipettspetsen och kommer att göra det svårt att driva ut den ofta viskösa mjölken i anläggningen behållaren.
- Häll mjölken i behållaren med hjälp av tummen för att trycka kolven förbi det första stoppet (se figur 1C). För att underlätta utdrivning av små volymer, trycker pipettspetsen mot sidan av röret, så att ingen vätska går förlorad.
- Fortsätt att manuellt uttrycka mjölk från varje spene, som rör sig i antingen medurs eller moturs för att inte hoppa över några spenar. Det är både acceptabelt och användbart för att komma tillbaka till och ständigt uttrycka mjölk från samma spenen borde det producerar mer mjölk än en annan.
4. Bedövning Återföring i Dam
- I de flesta fall är det vanligt att dammen för att börja att börja att vakna under mjölkningsprocessen. Om så inte är fallet, placera dammen i cage indirekt under en värmekälla, t.ex. en uppvärmd cirkulerande filt, tills hon börjar vakna.
OBS: Eftersom dammen börjar vakna upp, hålla noggrann observation av sin verksamhet tills hon kan gå om sin bur på egen hand. - När dammen rör sig om buren utan kamp, placera henne tillbaka till hennes ursprungliga bur med sin kull. Inga skadliga effekter har noterats med avseende på valparna förmåga att föda efter uppsamling av mjölk.
2. Muntjac Mjölkning Protocol
De metoder som beskrivs i detta protokoll har godkänts av IACUC.
1. Separation av DOE: t från Avkomma
- Välj den doe som ska mjölkas. Reeves 'muntjac rådjur ger i allmänhet upphov till en fawn 2. Mjölk DOE dagen efter förlossningarna så att fawn möjlighet att få tillgång till viktiga näringsämnen i råmjölk 8.
Obs: fawn gömmer oftast och inte slås på under procedure; separation av mor-avkomman paret är inte nödvändigt.
2. Administration av Oxytocin, Anestesi-och ögon Smörjmedel
- Administrera 10 IE / kg av Oxytocin intramuskulärt (IM). Oxytocin är ett hormon som verkar på mjölkkörtlar hos ammande kvinnor att stimulera låt-ned av mjölk. Oxytocin kan förvärvas från en veterinär.
- Administrera BAM bedövningsmedel IM 11 innehållande butorfanol 0,45 mg / kg, azaperon 0,25 mg / kg, medetomadine 0,07 mg / kg. En dos av BAM anestesiblandningar kommer att söva en muntjac för cirka 20-30 min, vilket ger gott om tid för fullständig uppsamling av mjölk. Ett annat alternativ för anestetikum är midazolam vid 1-2 mg / kg, vilket kommer att söva en muntjac under ca 10-15 min. Även om detta ger tillräckligt med tid för uppsamling av mjölk, är detta bedövningsmedel metaboliseras snabbare än BAM och djuret kan försöka fly i slutet av den kortare tidsperioden.
Obs: Minimal reaktion på smärta, Mindre reflexer vid röra öronen, följt av möjligheten för R1 att hålla MJ utan kamp visar att djuret har framgångsrikt sövd.
Anmärkning: I fråga om en muntjac inte fullt bedövas med den ursprungliga dosen, kan forskaren administrera annan ¼ eller ½ av den ursprungliga dosen av narkosblandning beroende på storleken på djuret och / eller nivå av sedering som redan har uppnåtts. Detta kan dock öka risken för en negativ reaktion på anestesi, och även kan leda till att muntjac är mer djupt sövda och / eller sövd under en längre tid. - Applicera en liten mängd smörjmedel till hörnet av varje öga och sprids för att förhindra muntjac ögon från att torka ut under anestesi.
3. Mjölk Insamling
Mjölk kollektionen är lättast utförs med två forskare; en forskare att hålla sövd muntjac iknät medan manuellt uttrycker mjölk (Kallas R1), samt en andra forskare att hålla muntjac huvud i en bekväm och säker position och att samla in mjölken (R2).
- Beroende på bedövningsmedel används, bör utföras mjölkning antingen 1) i sina pennor för att ge en säker plats för dem bör de vaknar under förfarandet (midazolam-inducerad) 2) i ett strö-fri förrummet eller för att upprätthålla renlighet (BAM- inducerad).
- R1 och R2 bör vara utrustade med etanol-indränkt gasbinda och flera 15 ml koniska polypropylenrör att hålla mjölken.
- När oxytocin börjar gälla, kommer mjölkutdrivning blir synliga i muntjac s bröstområdet. R1: Hygienbehandla behandskade händer och fingrar, liksom hela juvret och varje enskild spene hos djuret med etanolindränkt gasbinda. R2: Håll muntjac huvud i en säker och bekväm ställning för att tillåta enkel andning och hjälpa till att förhindra vommen uppstötningar. Håll provröret cl ose till spenen mjölkas utan att röra den för att förhindra eventuella föroreningar.
- Uttryck mjölk från en spene med hjälp av tummen och pekfingret för att försiktigt pressa bröstvävnaden i en uppåtgående rörelse tills spenen svullna med mjölk, och försiktigt rulla mjölken ur spenen och in i röret som R2 håller (se figur 2 ).
- Anmärkning: Mjölk kommer ut i en ström, så det är viktigt för R2 ha uppsamlingsröret placeras så att liten eller ingen mjölk går till spillo.
- Den muntjac juver är uppdelad i kvadranter. R1: Fortsätta att uttrycka mjölk från varje kvadrant tills mjölken inte längre flyter lätt. Om mjölken inte kan uttryckas från en spene, uttrycka från alla andra spenar innan han återvände till den första. Det är både acceptabelt och användbart för att komma tillbaka till och ständigt uttrycka mjölk från samma spenen borde det producerar mer mjölk än en annan.
4. Bedövning Återföring i Doe
t "> Det är vanligt att midazolam-inducerad doe att börja vakna under mjölkningsprocessen. I de flesta fall kommer det doe försöka fly innan all mjölk har uttryckts. är mindre återhållsamhet används i ett försök att öka mjölken avkastning, men säkerhet och komfort för både forskare och doe är lika viktiga.- Administrera atipamezol på 2,5 mg / mg medetomadine subkutant för snabb reversering av BAM sövda doe.
Anm: Med båda typerna av bedövningsmedel, är det nödvändigt att upprätthålla noggrann observation av DOE tills hon kan gå på egen hand utan att snubbla eller falla, och kan äta och dricka utan risk för aspiration eller kvävning. Inga skadliga effekter har noterats med avseende på fawn förmåga att amma efter mjölkhämtningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mus
Från våra experiment har vi fastställt att det är möjligt att samla in cirka 100-400 l av mjölk från ett laboratorium mus, beroende på flera variabler. Dessa variabler är 1) den tid som avsatts för insamling, 2) den dos av oxytocin administreras, 3) hur många valpar dammen är idag omvårdnad och 4) den tid efter förlossning. Våra studier har visat, att det högsta utbytet erhålles då dammarna är separerade från deras avkomma i minst 2 timmar, och åtminstone 45 min till en timme är avsatt per mus för mjölkning. Maximal mjölkvolymer skördades 8-12 dagar efter nedkomst med 2 IE / kg av oxytocin. Våra resultat är mestadels i överensstämmelse med andra studier där kullstorlek positivt korrelerade med mjölkavkastningen 9 (se figur 3).
Muntjac
Även om mängden mjölk HARintjänade från muntjac var varierande från dag till dag, kunde vi samla in 5 till 30 ml mjölk / damm / session, beroende på anestesi som används och / eller tidpunkt efter förlossning. Muntjac rådjur är polyestrous; mjölk kan samlas upp vid olika tidpunkter under hela året 2 (se tabell 1). Midazolam-inducerad doe förblev under anestesi för så lite som 10 min, vilket möjliggör mindre volym samlingar (typiskt 5 till 30 ml), under det att BAM-inducerad doe sustained en längre period av anestetisk effekt (20-30 min), vilket möjliggör fullständig mjölk uttryck (15 till 130 ml). Mjölk samlingar avbröts när mjölken inte längre produceras i tillräckliga mängder av DOE, och motsvarande fawn var som näring på en diet av mestadels hö foder.
Figur 1. (A) Dammen217, s spenar blir överfyllda med mjölk på oxytocininjektion (B) Insamling av mjölk från en sövd damm med hjälp av en P-200 pipetman (C) Utmatning av mjölk i en 1,2 ml cryovial...
Figur 2. Muntjac mjölken samlas in i ett 15 ml koniskt rör.
Figur 3. Ungefärligt mjölkavkastning som samlats in från möss baserat på kullstorlek och ålder valpar.
Tabell 1. Mjölk collvsnitt start-och slutdatum för ammande Reeves 'muntjac dammar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mus
Det finns flera faktorer att ta hänsyn till när man samlar in mjölk från en mus, däribland 1) den tid som avsatts för insamling, 2) den dos av oxytocin administreras, 3) hur många valpar dammen är idag omvårdnad och 4) det belopp tid som har gått sedan förlossning vid tidpunkten för insamlingen. Med hjälp av tidigare studier som riktlinjer, vi ut för att optimera förutsättningarna för mjölkproduktion.
Tidigare forskning har direkt korrelerad mjölkavkastning med kullstorlek 8. Olyckligtvis är kullstorlek en variabel som inte kan kontrolleras. Emellertid kan tiden för mjölkningen efter nedkomst styras. Enligt The Laboratory Mouse maximala mjölksekretion är på 8-10 dagar efter nedkomst 9. Vår erfarenhet är i kongruens med detta uttalande.
Det har visat sig att oxytocin spelar en oersättlig roll i mjölkproduktion inläggetförlossning 10. Oxytocin doser från 0,1 IE / kg 9-4 IE / kg 6 har rapporterats för uppsamling av mjölk från gnagare 6,7,9. Vi började vår studie genom att administrera den lägsta dosen föreslagits, 0,1 IE / kg 9. Med användning av denna dosering, mängden mjölk som produceras av mus var för liten för att mäta och samlas upp. Vid ökning av oxytocin dosen till 2 IE / kg 6,7, mjölkavkastning var betydligt högre efter cirka 120 pl. Eftersom vi ville använda den lägsta doseringen av oxytocin för att uppnå optimal uppsamling av mjölk, det gjorde vi inte administrera doser högre än 2 IE / kg.
Mjölkmängden beror också på den tid som avsatts för insamling. Vi har fastställt att ett minimum av 3 h är nödvändig för optimal collection-2 h för valparna som skall separeras från dammen och en timme för materialberedning och samling. Samla mjölk från flera dammar i en session kommer att minska den totala tid som krävs för attskörda en viss volym av mjölk, det vill säga 2 tim för att skilja valpar, 30 min till installationsmaterial och 20-30 min för att samla in mjölken från varje damm. Varje dammen måste övervakas tills de är vakna innan de släpps tillbaka med sina valpar. Vi har noterat att mer tid avsatt för mjölkning leder till högre avkastning mjölk, eftersom musen kan mjölkas tills hon återfår medvetandet.
Instanser uppstår med djurmodeller som kommer att påverka mjölkavkastning. Ett vanligt problem är förekomsten av blod eller exsudat i mjölken hos äldre dammar som har fötts upp vid upprepade tillfällen och har stora kullar, eller i dammar som ammar sin första kull. Om detta inträffar, föreslår vi att avbryta mjölk från just den spene. Det är lämpligt att byta pipettspetsar vid denna tid, och kasta alla exsudat eller blod.
Forskare som utför denna metod bör också vara medveten om att, såsom ofta är fallet när man använder djurmodeller, varierar resultaten (figur3). Om en mindre än optimal mängd mjölk samlas i en session, är det att föredra att upprepa proceduren vid ett senare tillfälle (t.ex. 24-48 timmar) snarare än ändra försöksbetingelserna att tvinga mjölk release.
Muntjac
Volymen av mjölk som hämtas från Reeves 'muntjac dammar var beroende av bedövningsmedel används. Vår initiala bedövningsmedel val var midazolam. Midazolam ges tillräcklig sedering för att möjliggöra återhållsamhet under korta tidsperioder-dvs om R1 hade en lugn disposition och kunde hålla muntjac lugn, kunde R2 ta över mjölkningen att öka utbytet innan muntjac skulle väcka-säkerhet och komfort för både djur och handler var av största vikt och vi övergav mjölknings ansträngning om vi kände heller äventyrades. Vi upptäckte att muntjac doe snabbt blivit toleranta mot midazolam och att högre doser skulle vara nödvändigt efter upprepad exponering, gör mjölk samling två gånger i veckan allt svårare.
Bristen på midazolam, i kombination med en tolerans byggnad, fick oss att undersöka en alternativ bedövningsmedel. En blandning av butorfanol, Azaperon och Medetomadine (BAM) i praktiken används för immobilisering av vit svans rådjur 11. I våra händer, BAM cocktail ges tillräckliga anestesi för att möjliggöra insamling av acceptabla volymer mjölk på ett säkert sätt, med mindre tolerans drog efter upprepad användning, och med bättre kontroll för att motverka effekten av bedövningen.
Vissa muntjac dammar led av känsliga juver och / eller var förstföderskor. Dessa muntjac utvecklade blåmärken på spenarna under mjölkningsprocessen, och mjölkflödet saktat eller stoppas helt, vilket fick oss att avbryta den pågående sessionen. Om detta inträffar, bör man använda en mer skonsam mjölkningsteknik i ett försök att förhindra obehag eller blåmärken i spenarna.
e_content "> Mjölkproduktionen verkade vax och avta vid flera tillfällen. Låga mjölk skördar kan orsakas av 1) de rådjur som har vårdat strax före samlingar eller 2) en nedgång i mjölkproduktionen på grund av den naturliga processen av fawn avvänjning.Även om det kan vara en ansträngande process för att erhålla en betydande volym av mjölk från små djurmodeller, visar vårt arbete att det faktiskt är en möjlighet för både mus och muntjac modeller; varken kräver omfattande kunskap eller djupa fickor, helt enkelt uthållighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials—Mouse | |||
| Ketamine (KetaVed 100 mg/ml) (dose: 80-100 mg/kg) | MWI/Vedco | 011075 | |
| Xylazine (TranquiVed 100 mg/ml) (dose: 5-10 mg/kg) | MWI/Vedco | NADA 139236 | |
| Eye lubricant | MWI/Apexa | 701013 | |
| Oxytocin (2 IU/kg) | Vet One | 501013 | |
| Materials—Muntjac | |||
| Midazolam (1-2 mg/kg) | Amerisource Bergen Drug Corp | 924326 | Optional: researcher can either use Midazolam on its own or BAM combination as an anesthetic |
| Butorphanol tartrate (Torbugesic) (0.45 mg/kg) | Fort Dodge Animal Health | NADA 135-780 | |
| Azaperone tartrate (0.25 mg/kg) | ZooPharm | ||
| Medetomadine HCl (0.07 mg/kg) | ZooPharm | ||
| Antipamezol hydrochloride (Antisedan) (dose: 0.25 mg/kg) | Orion Corporation | NADA 141-033 | |
| Oxytocin (10 IU/kg) | Vet One | 501013 | |
| Equipment—Mouse | |||
| P-200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μl pipette tips | Light Labs | B-2004-SH | |
| 1 ml syringes | MWI | 005427 | |
| 27 G needles | MWI | 002031 | |
| Equipment—Muntjac | |||
| 15 ml conical tubes | VWR | 21008-918 | |
| 22 G needles | MWI | 873 | |
| 3 ml luer lock syringes | MWI | 001377 | |
References
- Dueling, S. Muntiacus reevesi. Animal Diversity Web. , Available from: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Muntiacus_reevesi (2004).
- Pei, K., Taber, R., O'Gara, B., Wang, Y. Breeding cycle of the Formosan Reeves muntjac (Muntiacus reevesi micrurus) in northern Taiwan, Republic of China. Mammalia. 59 (2), 223-228 (1995).
- Browning, S. R. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J. Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
- Van de perre, P. Transfer of antibody via mother's milk. Vaccine. 21 (24), 3374-3376 (2003).
- Maden, C. Genetically modified mice produce human milk protein. BioNews. , (2009).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab. Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- Depeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
- Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: effects of litter size and lactation. 84 (1), 127-133 (1986).
- Hedrich, H. J., Bullock, G. R. The laboratory mouse. , 735-736 (2004).
- Nishimori, K., Young, L. J., Guo, Q., Wang, Z., Insel, T. R., Matzuk, M. M. Oxytocin is required for nursing but is not essential for parturition or reproductive behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (21), 11699-11704 (1996).
- Miller, B. F., Osborn, D. A., Lance, W. R., Howze, M. M., Warren, R. J., Miller, K. V. Butorphanol-azaperone-medetomidine for immobilization of captive white-tailed deer. 45 (2), 457-467 (2009).
