Summary
Este vídeo demonstra uma estratégia fácil e confiável para a preparação de culturas puras de células endoteliais do cérebro anterior embrionário dentro de 10-12 dias e será útil para a pesquisa focada em muitos aspectos da angiogênese cerebral.
Abstract
Células endoteliais cerebrais embrionárias podem servir como uma ferramenta importante no estudo da angiogênese eo desenvolvimento neurovascular e interações. As duas redes vasculares do cérebro anterior embrionário, pial e periventricular, são espacialmente distinta e têm diferentes origens e padrões de crescimento. As células endoteliais das redes vasculares pial e periventriculares têm perfis de expressão de genes únicos e funções. Aqui apresenta-se um protocolo de passo-a-passo para o isolamento, a cultura, e a verificação de populações puras de células endoteliais a partir da rede vascular periventricular (PVECs) do prosencéfalo embrionário (telencéfalo). Nesta abordagem, telencéfalo desprovido de membrana pial obtido a partir do dia embrionário 15 ratinhos é picada, digeridos com colagenase / dispase e disperso mecanicamente numa suspensão de células individuais. PVECs são purificados a partir de suspensão de células utilizando selecção positiva com anticorpo conjugado com MicroBeads anti-CD-31/PECAM-1 usando um forte magnéticométodo de separação. Células purificadas são cultivadas em colágeno 1 revestidas placas de cultura em meio de cultura de células endoteliais, até que se tornar confluentes e mais subcultivadas. PVECs obtidos com esta exposição de paralelepípedos protocolo e fenótipos fusiformes, visualizadas por microscopia de luz de contraste de fase e microscopia de fluorescência. Pureza de culturas PVEC foi estabelecida com marcadores de células endoteliais. Em nossas mãos, este método confiável e consistente produz populações puras de PVECs. Este protocolo irá beneficiar estudos para obtenção de conhecimentos mecanicistas em prosencéfalo angiogênese, compreender as interacções PVEC e transversais conversações com os tipos de células neuronais e tem um enorme potencial para a angiogênese terapêutica.
Introduction
A angiogênese, neurogênese e migração neuronal são eventos críticos no sistema nervoso central (SNC) de desenvolvimento, reparo e regeneração. Vários estudos elegantes mostraram que células endoteliais estimular a proliferação neuronal e vice-versa através da liberação de fatores solúveis e pelo contato direto. Descobrimos que é curioso que na maioria dos estudos 1-3, enquanto progenitoras neuronais / células estaminais neurais são isoladas a partir do cérebro embrionário, que são co-cultivados com células endoteliais do cérebro adulto, outras fontes de tecido adulto, ou com linhas de células endoteliais. Isto pode em parte ser devido aos problemas técnicos associados com o isolamento e cultivo de populações puras de células endoteliais do cérebro embrionário. No entanto, a angiogénese, a neurogénese e migração neuronal são eventos que ocorrem em simultâneo, em ordens de magnitude mais robusto no cérebro embrionário do que no cérebro adulto normal. A rede vascular periventricular do embryonic prosencéfalo (telencéfalo) origina a partir de um navio localizado no primórdio gânglios basais e desenvolve-se na forma de um gradiente de ordenada ventral dorsal telencéfalo por dia embrionário 11 (E11), 4,5. Este plexo de vasos da rede vascular periventricular são distintos dos vasos pial com base em origens, localização anatômica, os padrões de crescimento e regulação do desenvolvimento 4,5. A direção de propagação do gradiente angiogênese periventricular corresponde ao gradiente neurogenético transversal telencefálico. Dentro do telencéfalo, o gradiente de angiogénese periventricular e o gradiente de neurónios GABA migram tangencialmente sobrepõe espacialmente assim 6. No que diz respeito ao tempo, a inclinação da angiogénese é, antes da inclinação e do neurónio GABA gradiente neurogenético por cerca de um dia. Assim, as células endoteliais periventriculares são espacialmente e temporalmente bem posicionada para fornecer pistas importantes para apoiar a neurogênese e telencefálico4,6 migração neuronal. Portanto, o uso de células endoteliais periventriculares embrionárias em experimentos de co-cultura com células progenitoras e / ou neurônios neuronais forneceria um modelo mais favorável para o estudo de interações neurovasculares e desenvolvimento de novos caminhos para o tratamento de doenças neurodegenerativas ou da lesão cerebral isquêmica / traumático.
Ressaltamos a importância de remover a membrana pial, não só para limitar a contaminação de células epiteliais, mas também para separar as células endoteliais pial que são molecularmente e funcionalmente distinto de células endoteliais da rede vascular periventricular 4,6 (PVECs denominado para distinguir de pial ECs) . Aqui, descrevemos o método que usam rotineiramente em nosso laboratório para obter um rendimento rico e puro de PVECs. Estas células endoteliais são preparados a partir de prosencéfalo embrionário isolado a partir de um único rato cronometrado-grávida. Eles podem ser expandidas, subcultivadas e congelado para baixo com êxito para utilização futura.
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Protocol
1. Preparação de reagentes e soluções
- Revestimento de 35 mm de prato de cultura: O colagénio tipo 1 solução é fornecida como uma solução aquosa de ácido acético 20 mM (~ 100 mg de proteína / tubo de ensaio). Dilui-se um volume adequado de solução de colagénio a uma concentração de trabalho de 0,01% a partir da cultura de tecido estéril, de grau água. Pratos de revestimento com 1 ml de solução de colagénio durante 3-4 horas à temperatura ambiente (TA) ou a 37 ° C, ou durante a noite a 2-8 ° C. Retire o excesso de solução do prato revestido e deixe-a secar durante a noite. Lave o prato com água grau cultura de tecido ou PBS antes de adicionar mídia. Placas revestidas podem ser armazenadas a 4 ° C durante um mês.
- Prepare Eagle Modificado por Dulbecco completo (DMEM). Suplementar o meio DMEM (500 ml) com 10% FBS e solução de antibiótico-antimicótico (concentração 1x; 1 ml/100 ml). DMEM completo pode ser armazenado a 4 ° C durante dois meses.
- Prepara-se uma alíquota (50 ml) de meio DMEM com DNase I (0,001 mg / ml), (referido como DMEM-DNase I).
- Preparar outra alíquota (10 ml) de meio DMEM com colagenase e dispase (1 mg / mL) (referido como DMEM-collagenase/dispase).
- Prepare celular endotelial Meio de Cultura (ECCM, 500 ml), suplementado com EGF (5 ug), ECGS (100 mg) e 5 ul de solução de antibiótico-antimicótico. ECCM pode ser armazenado a 4 ° C durante dois meses.
- Pré-aquecer todos os meios antes de usar.
- Preparar tampão de purificação: PBS, pH 7,2, com 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM. Manter tampão frio (2-8 ° C).
2. Remoção de Embriões e Dissecção da Telencéfalo
Todos os experimentos com animais de laboratório são aprovados pelos cuidados com os animais e uso de comitês de McLean Hospital e em conformidade com as diretrizes do NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório.
- Use ratinhos CD1 grávidas cronometrados (dia embrionário 15). O dia de tampão vaginal descoberta é considerado embrionário dia 0 (E0). Barragens CD1 geralmente produzem grandes ninhadas, então 10-12 embriãos são esperados a partir de uma barragem grávida.
- Para histerotomia, anestesiar ratas grávidas com uma injecção intraperitoneal de cetamina (100 mg / kg) / xilazina (5 mg / kg). No caso dos ratos, aproximadamente 20-30 g, entregar 0,3 ml de uma solução anestésica de 10 ml / kg de cetamina / xilazina e assegurar que a dor e desconforto é mínima durante as injecções intraperitoneais de anestésico. Use restrição de mão para as injeções.
- Verifique anestesia profunda por toe pitada. Retirar embriões de ratinhos anestesiados profundamente. Decapitar cada embrião imediatamente após a remoção da mãe. Coloque as cabeças embrionárias em placas de Petri estéreis em PBS gelado.
- Siga histerectomia por eutanásia imediata com overdose de anestésico (130 mg / kg de pentobarbital, ip), um método de eutanásia, o que é consistente com as diretrizes AVMA para a eutanásia de animais: 2013 Edition.
- Sob um microscópio estéreo, retirar o cérebro da cabeça com uma tesoura MicroTip finas e uma pinça fina. Nota: A dissecar alta qualidadeião é essencial para remover com sucesso o pial membrana do cérebro embrionário. Isto é conseguido através da prática. Uma pinça fina e tesoura MicroTip também são ferramentas fundamentais para a obtenção de uma boa dissecção.
- Use a pinça para obter um controle firme sobre o cérebro e as tesouras MicroTip para descascar a membrana pial. Retire o mesencéfalo e metencéfalo e isolar o telencéfalo. Transferir telencéfalo pial-livre de todos os embriões para a 35 milímetros prato de cultura com 2 ml de PBS em gelo.
3. Isolamento celular
- Picar o telencéfalo em fragmentos de 1-2 mm com uma lâmina de bisturi e recolher o tecido em um tubo Falcon de 15 ml contendo 2 ml de DMEM completo.
- Dissociar tecido suave mas completamente com uma pipeta de 1 ml até aglomerados desaparecer e uma suspensão leitosa é alcançado.
- Centrífuga células dissociadas em 800-1.000 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o pellet em DMEM-DNase I. Gently dissociar a cells novamente utilizando uma pipeta ml e centrifugar a 800-1.000 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
- Ressuspender o sedimento em DMEM completo quente. Células filtrar através de uma malha de nylon estéril 70 mM. Coletar as células filtradas e manter em gelo.
- Recolher as porções de células retidas na malha e digerir ainda mais com DMEM-collagenase/dispase (2 ml) durante 1-2 minutos à temperatura ambiente. Lavar as células 3x em DMEM-ADNase I através de centrifugação a 800-1.000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Agrupar as células com as células filtrados recolhidos no passo 3.5. Lave as células uma vez com DMEM totais completa. Prossiga para determinar o número de células e etapas de rotulagem magnéticos. Nota: É importante para se obter uma suspensão de célula única antes da marcação magnética.
4. Rotulagem Magnetic
- Este protocolo mostra a rotulagem magnética de 10 7 células. Para o número de células inferior a 10 7, use o mesmo volume de reagente e para o número de células superior a 10 7, escala de todos os volumes de reagentes e volumes totaisem conformidade (por exemplo, para 2 x 10 7 células totais, utilizar duas vezes o volume de todos os reagentes indicados). Manter todos os reagentes e as células em gelo.
- Determinar o número de células com um hemocitômetro.
- Suspensão de células de centrifugar a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante completamente.
- Adicionar 90 μl/10 7 células de tampão de purificação para a pelete de células seguido de 10 ul de MicroBeads CD31. Os Microbeads fornecidos pelo fabricante são conjugados a anticorpo monoclonal anti-CD31 mouse.
- Misture bem e incubar por 15 min na geladeira. Nota: As temperaturas mais elevadas e / ou aumentando o tempo de incubação, durante a etiquetagem magnético pode resultar numa ligação não específica.
- Lavar as células por adição de 1-2 ml/10 7 células de tampão de purificação e centrifugar a 300 xg durante 10 min. Remover as células do sobrenadante e ressuspender em 500 ul de tampão de purificação. Vá para a separação magnética ou etapa de purificação.
5. Purification
- Coloque coluna MS no campo magnético de MACS Separador.
- Lavar coluna com 500 mL de tampão de purificação.
- Aplicar a suspensão de células para dentro da coluna. Carregar número adequado de células para a coluna MS como o número de células mais elevada pode obstruir a coluna. Cuidado: Cada coluna MS pode acomodar um número máximo de 2 x 10 7 células, para um número de células superior, utilizar mais colunas.
- Coletar e descartar flow-through contendo células não marcadas.
- Lavar coluna com 500 ul de tampão de purificação de três vezes. Durante as etapas de lavagem, certifique-se de que o reservatório da coluna está vazia antes de adicionar alíquotas tampão de purificação posteriores.
- Remover coluna do separador MACS e coloque-o em um tubo Falcon de 15 ml.
- Um êmbolo é fornecido juntamente com a coluna MS. Pipeta 1 ml de tampão de purificação na coluna de MS e imediatamente lavar as células magneticamente rotulados com firmeza empurrando o êmbolo para a coluna.
- Placa celsl em uma placa de cultura de 35 milímetros pré-revestidos com colagénio do tipo 1 e crescer células em ECCM numa incubadora a 37 ° C com 95% de O2 e 5% de CO 2.
- Troca da mídia a cada quatro dias. Use PVECs para experiências ou subcultura após 10-12 dias, quando o prato é confluente.
6. Subcultura de PV ECS
- Retire o ECCM e lavar a monocamada de PVECS com 1-2 ml de PBS estéril.
- Adicionar cuidadosamente 1,5 ml de 0,25% de solução de tripsina-EDTA para cobrir a monocamada de células.
- Devolver o prato para a incubadora. Dentro de 5-7 minutos, as células irão separar da superfície do prato.
- Após as células terem destacado, imediatamente adicionar um volume igual de inibidor de tripsina e tritura-se várias vezes.
- Transferência das células para um tubo estéril de 15 ml Falcon. Centrifuga-se o tubo a 500 xg durante 5 min.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de pré-aquecido ECCM.
- Semente das células para a expansão da cultura, imenvelhecimento ou outros ensaios.
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Representative Results
A caracterização fenotípica dos PVECs do dia 1-12 é mostrado por microscopia óptica de contraste de fase (figura 2). As células ligadas ao prato no dia 1 mostra a morfologia característica de divisão celular (Figura 2A). Entre 5-8 dias, PVECs transição de pedra de calçada ao fuso morfologia em forma típica de células endoteliais e mais parecido com o seu estado in vivo (Figuras 2B e 2C). Por volta do dia 12, a cultura atinge PVEC confluência completo (Figura 2D). PVECs podem ser repicadas facilmente para expandir a colônia (Figuras 2E-G). Pureza de culturas de células endoteliais foi estabelecida com marcadores de células endoteliais - isolectin B4, CD-31/PECAM-1, Factor de von Willebrand (vWF) e VE-caderina e foi determinado ser de cem por cento após subcultura (Figuras 2H-K).
As imagens de alta ampliação de PVECs preparados a partir de embriões CD1, bem como TieEmbriões 2-GFP 4 (cujas células endoteliais expressam GFP) são mostrados (Figura 3). Além do paralelepípedos comum e fusiformes morfologias (Figuras 3A-C), morfologias poligonais com processos delgados foram também observados em isolectina e Tie2-GFP + ve PVECs (Figuras 3D e 3E) marcado com B4. Em alguns dos nossos colagénio revestidas placas de cultura (na ausência de Matrigel), PVECs formados padrões de treliça que se assemelham a característica única da in vivo periventricular rede vascular (Figura 3F). Isso reflete o elevado potencial angiogênico de PVECs. Um ensaio de angiogénese foi realizada na qual PVECs (2 x 10 4 células) foram adicionadas a placas de cultura revestidas com matriz Matrigel. PVECs mostrou a formação do tubo robusto no prazo de 18 horas (Figura 3G). Estes resultados fornecem evidência forte de que este sistema pode ser utilizado como um modelo in vitro de células endoteliais. PVECs isoladosa partir de embriões de CD1 pode ser rapidamente marcado com nanocristais Qdot (Figura 3H) que proporcionam intensa fluorescência estável no citoplasma de células vivas e podem ser utilizadas para estudos de longo prazo de PVECs vivo, incluindo a migração, motilidade, morfologia, ensaios de função celular como bem como em experiências in vivo. PVECs podem ser transfectadas com traçadores celulares como celular Luz Plasma Membrane-RFP, BacMam 2,0 (Figura 3I), conforme as instruções do fabricante para a clara visualização da morfologia celular em experimentos de imagens de células vivas.
Nós PVECs cultivadas não só em ECCM, mas também no cérebro de rato endotelial meio de crescimento celular (RBECGM) e meio F12 de DMEM. Tanto a fase de contraste (Figuras 4A, 4C, e 4E) e isolectina B4 marcado imagens (Figuras 4B, 4D, e 4F) de PVECs cultivadas em ECCM (Figuras 4A e 4B), RBECGM (Figuras 4C e
Figura 1. Esquema de PVEC isolamento. O protocolo utilizado para o isolamento e purification de PVECs do telencéfalo embrionário é resumido em um esquema. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 2. Caracterização fenotípica dos PVECs. (AG) imagens de contraste de fase de cultura PVEC em diferentes pontos do tempo após o plaqueamento. (A) cultura PVEC no dia 1. Células ter anexado e mostrar morfologias divisão. (B) cultura PVEC no dia 5 e (C), no dia 8 de transição de paralelepípedos ao fuso forma morfologia. (D) PVEC cultura atingiu confluência no dia 12. (E) PVECs após subcultura no dia 1, (F) dia 5 (L (HJ) imunomarcação de PVECs utilizando marcadores de células endoteliais: isolectin B4 (H), Factor de von Willebrand (I), CD31/PECAM (J) e VE-caderina (k). Barras de escala: A, 100 mm (aplica-BJ), K, 50 mm. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 3. Morfologias de PVECs. (AE) Imagens de alta ampliação de isolectin e Tie2-GFP + ve PVECs mostrando paralelepípedos e fusiformes morfologia (AC), bem como a morfologia poligonal com extensões longas e finas (D, E) com rótulo B4. (<fortes> F) PVECs mostram um elevado potencial angiogénico no prato de cultura, mesmo na ausência de Matrigel. (G) PVECs mostram a formação do tubo robusto no ensaio da angiogénese em Matrigel. (H) PVECs marcadas com nanocristais Qdot. (I) PVECs transfectadas com celular Luz Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0. Barras de escala: A, 50 mm, B, 15 mm (aplica-CE), F, 100 mm (aplica-se G, H), I, 50 mm. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 4. PVECs cultivadas em diferentes meios de cultura espetáculo variante morfologia. (
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Discussion
PVEC do são mais fisiologicamente relevante do que as células endoteliais adultas do cérebro e células endoteliais provenientes de outras fontes de tecidos para estudos sobre interações neurovasculares e também têm potencial terapêutico. Para a preparação PVEC, é princípio fundamental com dissecção de trabalhar rápido para conseguir uma boa viabilidade desde as células mortas pode ligar de forma inespecífica a MicroBeads CD31. Além disso, se a suspensão de uma única célula não é conseguido antes da etapa de marcação magnética, isto irá resultar na resolução de problemas, uma vez aglomerados de células vai obstruir a coluna. Uma vantagem deste método é que não há necessidade de incubação com tripsina para retirar as células dos grânulos magnéticos, um passo demorado e muitas vezes difícil usado noutros métodos magnéticos de separação baseadas em esferas para a preparação da CE 4,7. Além disso, esta técnica de isolamento não requerem grandes quantidades de tecido de cérebro embrionário. PVEC de pode ser preparado de forma consistente com a utilização de um único ratinho grávida cronometrado em aproxoximately 12 dias, subcultivadas e utilizados em uma grande variedade de ensaios in vitro e in vivo.
A pureza de PVECs após isolamento é mais de 90%, mas a pureza do PVECs após subcultura é de 100%. Para além das células endoteliais, PECAM-1 é encontrado na superfície de monócitos / macrófagos. Microglia, a população de macrófagos do SNC é no entanto muito menor no cérebro embrionário do rato quando comparado a pós-natal ou cérebro adulto 8. Os monócitos / microglia precisa meio suplementado com 10% de soro bovino fetal e fatores de crescimento específicos para crescer, pois eles vão morrer eventualmente em ECCM e não vai durar após subcultura de PVECs. Quando 100% PVECs puros são necessários imediatamente após o isolamento (por exemplo, para testar a expressão do gene), utilizamos células activadas por fluorescência método (FACS) de triagem. PVECs são então isolados a partir de embriões Tie2GFP (em que somente as células endoteliais expressam GFP) e rigorosamente classificados por análise FACS dupla. A pureza do endotélio classificadol células são assegurados pela coleta de células que são o dobro positivo para GFP e CD31/PECAM-1 6.
As culturas também é observada de perto na primeira semana de isolamento para contaminar os tipos de células, como pericitos. Como as células pericyte estão de forma irregular e nunca vai formar uma monocamada confluente ao contrário das células endoteliais que consistem em forma de fuso, células ou contatados poligonais que crescem como colônias, eles são fáceis de reconhecer, se houver. Se for detectada a contaminação pericitos, uma menor concentração de tripsina (0,05%), seguida por um rápido procedimento de tripsinização (2-3 min) é utilizado para a subcultura de PVECs. Pericitos requerem um tempo de tripsinização prolongado (7-10 min) e continuará a ser anexado. Além disso, a eficiência de plaqueamento de pericitos tripsinizadas (se houver) é muito pobre. Estes passos eliminar a contaminação pericyte e garantir que PVECs repicadas são puras.
O meio ECCM é um meio de baixo soro contendo hidrocortisona,heparina e 2% de soro fetal bovino e é suplementado com o Factor de Crescimento Epidérmico (EGF), e suplemento de crescimento celular endotelial (ECGS). PVECs cultivadas em ECCM mostrou fuso morfologia em forma consistente. A ECGM cérebro de rato contém 10% de soro fetal bovino, factores de crescimento, e VEGF. PVECs cultivadas neste media têm morfologias muito alongadas e demoram mais para atingir confluência. O meio de DMEM-F12 é suplementado com 10% de soro fetal bovino, GlutaMAX e suplemento de crescimento de células endoteliais e induz mais proliferação do que outros meios de comunicação. Embora PVECs cultivadas neste media mostraram um crescimento muito rápido e confluência alcançado em 4 dias, suas morfologias foram plana ou apenas poligonal. Temos crescido PVECs em ECCM para até três passagens sem perda de fenótipo e função. Portanto, ECCM é o meio que preferimos para a cultura PVEC.
PVECs co-cultivadas com precursores neuronais por este protocolo são susceptíveis de estimular a neurogênese e migração neuronal para far-maiores extensões do que as células endoteliais do cérebro adulto ou de outras fontes e pode ser valiosa para ajudar a recuperação da função neurológica em acidente vascular cerebral, traumatismo crânio-encefálico ou neurodegeneração. Precursores neuronais transplantadas no cérebro adulto têm sido freqüentemente relatados para parar e não conseguem migrar para regiões que necessitam de novos neurônios. Este problema é contabilizada para a ausência de substratos que facilitam a migração neuronal como guias gliais radiais 9. Vasculatura é cada vez mais apreciada como substratos para a migração neuronal 6,10,11. PVECs pode oferecer uma solução para estes precursores neuronais paralisadas em locais de transplante. Coimplantation de PVECs e neurônios em regiões cerebrais danificadas podem facilitar a migração dos neurônios guiada por células endoteliais e ajudar a conseguir a recuperação funcional. A estreita associação de células endoteliais com neurônios que migram também os torna especialmente adequado para entregar os fatores de crescimento e outras proteínas diretamente e seletivamente emmigrando neurônios.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma Aliança Nacional para a Pesquisa sobre Esquizofrenia e Depressão (NARSAD) Young Investigator Award e National Institutes of Health conceder R01NS073635 a AV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNase I | Sigma | D-4527 | |
| Collagen, Type 1 solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| DPBS | Quality Biologicals | 114057-131 | |
| EDTA | Fisher Scientific | M4055 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| MS column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| CD31 microbeads | Miltenyi Biotech | 130-097-418 | |
| MACS separator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Bioscience | 352350 | |
| Antibiotic and antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| 35 mm Culture dish | BD Bioscience | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352097 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352098 | |
| ECCM kit | BD Bioscience | 355054 | Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF, and Soybean Trypsin Inhibitor |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Bioscience | 354006 | |
| RBECGM | Cell Applications | R819-500 | |
| DMEM F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 305050-061 | |
| Tissue culture grade water | Life Technologies | 15230162 | |
| 0.25% Trypsin | Life Technologies | 15050 | |
| Soybean trypsin inhibitor | BD Bioscience | 5425 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Life Technologies | Q25021 | |
| CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0 | Life Technologies | C10608 | |
| Biotinylated Isolectin B4 antibody | Sigma | L2140 | |
| Anti-Von Willebrand factor | Sigma | F3520 | |
| Anti-CD31/PECAM-1 | BD Pharmingen | 550274 | |
| VECTASHIELD Hardset Mounting Media with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Ketamine | Butler Schein Animal Health Supply | 44028 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 1009 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Inverted microscope | Olympus CK-40 | CK-40 | |
| Fluorescent microscope | Olympus FSX-100 | FSX-100 | |
| Fine forceps | Roboz Surgical Instrument | 7 inox | |
| Fine microtip scissors | Roboz Surgical Instrument | RS5611 |
References
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