Summary
يوضح هذا الفيديو استراتيجية سهلة وموثوقة لإعداد الثقافات نقية من الخلايا البطانية من الدماغ الأمامي الجنينية داخل 10-12 يوما، وسوف يكون من المفيد للبحوث تركز على جوانب كثيرة من الأوعية الدموية الدماغية.
Abstract
الخلايا البطانية المخ الجنينية يمكن أن تكون بمثابة أداة هامة في دراسة الأوعية الدموية والتنمية وعائية عصبية والتفاعلات. شبكات الأوعية الدموية وهما من الدماغ الأمامي الجنينية، حنوني وحول البطينات الدماغية، ومميزة مكانيا ولها أصول مختلفة وأنماط النمو. الخلايا البطانية من شبكات الأوعية الدموية حنوني وحول البطينات الدماغية وفريدة من نوعها ملامح التعبير الجيني ووظائفها. هنا نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لعزل والثقافة، والتحقق من السكان نقية من الخلايا البطانية من شبكة الأوعية الدموية المحيطة بالبطين (PVECs) من الدماغ الأمامي الجنينية (الدماغ الانتهائي). في هذا النهج، ومفروم الدماغ الانتهائي خالية من الغشاء حنوني تم الحصول عليها من يوم الجنينية 15 الفئران، يتفاعل مع كولاجيناز / dispase، وفرقت ميكانيكيا في تعليق خلية واحدة. يتم تنقيته PVECs من الايقاف الخلية باستخدام اختيار إيجابية مع الأجسام المضادة anti-CD-31/PECAM-1 مترافق لبلي باستخدام مغناطيسي قويطريقة الانفصال. الخلايا تنقيته يتم تربيتها على الكولاجين 1 الأطباق الثقافة المغلفة في البطانية مستنبت الخلايا حتى تصبح متكدسة ومزيد من subcultured. الحصول PVECs مع هذا البروتوكول المعرض الحصوه والمغزل على شكل الظواهر، كما تصور من قبل على النقيض من المرحلة المجهر الضوئي ومضان المجهري. تأسست نقاء الثقافات PVEC مع علامات الخلايا البطانية. في أيدينا، وهذه الطريقة بشكل موثوق وثابت تعطي السكان نقية من PVECs. وهذا البروتوكول الاستفادة من الدراسات التي تهدف إلى اكتساب رؤى الآلي في الدماغ الأمامي الأوعية الدموية، وفهم التفاعلات PVEC، ومحادثات عبر أنواع الخلايا العصبية مع ويحمل إمكانات هائلة لتكوين الأوعية الدموية العلاجية.
Introduction
الأوعية الدموية، والخلايا العصبية الهجرة العصبية هي الأحداث الحاسمة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) التنمية والإصلاح والتجديد. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن الخلايا البطانية أنيقة تحفيز انتشار العصبية والعكس بالعكس من خلال الافراج عن العوامل القابلة للذوبان وعن طريق الاتصال المباشر. وجدنا أنه من الغريب أنه في الغالبية العظمى من هذه الدراسات 1-3، في حين يتم عزل الأسلاف العصبية / الخلايا الجذعية العصبية من المخ الجنينية، وأنها cocultured مع الخلايا البطانية من الدماغ الكبار، الكبار مصادر الأنسجة الأخرى، أو مع خطوط الخلايا البطانية. وهذا قد يكون في جزء منه بسبب الصعوبات التقنية المرتبطة عزل وزراعة السكان نقية من الخلايا البطانية من المخ الجنينية. ومع ذلك، الأوعية الدموية، تكوين الخلايا العصبية، وهجرة الخلايا العصبية هي الأحداث المتزامنة التي تحدث في أوامر من حجم أكثر قوة في الدماغ الجنينية مما كانت عليه في الدماغ الكبار العادي. شبكة الأوعية الدموية المحيطة بالبطين من embryoniج الدماغ الأمامي (الدماغ الانتهائي) تنبع من سفينة تقع ضمن العقد القاعدية منشم ويتطور في شكل التدرج المنظم من بطني لالظهرية لل telencephalon بعد يوم الجنينية 11 (E11) 4،5. هذه الضفيرة من السفن من شبكة الأوعية الدموية المحيطة بالبطين تختلف عن السفن حنوني على أساس أصول والموقع التشريحي، وأنماط النمو، وتنظيم التنموية 4،5. اتجاه الانتشار من الأوعية الدموية المحيطة بالبطين مباريات متدرجة الانحدار العصبية الوراثية عرضية الدماغ الانتهائي. ضمن الدماغ الانتهائي، التدرج الأوعية الدموية المحيطة بالبطين والتدرج من الخلايا العصبية GABA المهاجرة تتداخل بشكل طفيف مكانيا كذلك 6. فيما يتعلق بالتوقيت، التدرج الأوعية الدموية في وقت مبكر من العصبية الوراثية الانحدار والخلايا العصبية GABA التدرج بنحو يوميا. وبالتالي، الخلايا البطانية حول البطينات الدماغية هي مكانيا وزمانيا في وضع جيد لتقديم العظة الحرجة لدعم تكوين الخلايا العصبية والدماغ الانتهائي4،6 هجرة الخلايا العصبية. ولذا، فإن استخدام الخلايا البطانية حول البطينات الدماغية الجنينية في التجارب coculture مع الأسلاف العصبية و / أو الخلايا العصبية تقدم نموذجا أكثر ملاءمة لدراسة التفاعلات الوعائية العصبية وتطوير سبل جديدة لعلاج المرض العصبي أو نقص تروية / إصابات في الدماغ.
فإننا نؤكد على أهمية إزالة الغشاء حنوني، وليس فقط للحد من تلوث الخلايا الظهارية ولكن أيضا لفصل الخلايا البطانية حنوني التي هي جزيئيا ومتميزة وظيفيا من الخلايا البطانية في الأوعية الدموية المحيطة بالبطين شبكة 4،6 (PVECs يطلق تمييزها عن حنوني ECS) . هنا، نحن تصف طريقة التي نستخدمها بشكل روتيني في مختبرنا للحصول على العائد غنية ونقية من PVECs. وتعد هذه الخلايا البطانية من forebrains الجنينية معزولة عن ماوس توقيت الحوامل واحد. أنها يمكن توسيعها، subcultured، وتجميد أسفل بنجاح لاستخدامها في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الكواشف وحلول
- ويتم تزويد الكولاجين من النوع 1 الحل بمثابة محلول مائي في 20 ملي حمض الخليك (~ 100 ملغم بروتين / قارورة): طلاء من 35 مم طبق الثقافة. تمييع حجم مناسب من حل الكولاجين لتركيز العمل من 0.01٪ باستخدام زراعة الأنسجة المعقمة للمياه الصف. أطباق معطف مع 1 مل من محلول الكولاجين لمدة 3-4 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) أو 37 درجة مئوية، أو بين عشية وضحاها في 2-8 درجة مئوية. إزالة الزائدة حل من الطبق المغلفة واتركه حتى يجف بين عشية وضحاها. شطف الطبق مع الماء زراعة الأنسجة الصف أو برنامج تلفزيوني قبل إضافة وسائل الإعلام. ويمكن تخزين الأطباق المغلفة في 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد.
- إعداد كاملة Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM). تكملة DMEM (500 مل) مع 10٪ FBS وحل المضادات الحيوية مضاد فطري (تركيز 1X؛ ml/100 1 مل). DMEM كاملة يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة شهرين.
- إعداد قسامة (50 مل) من DMEM مع الدناز الأول (0.001 ملغ / مل)، (ويشار إلى DMEM-الدناز الأول).
- إعداد قسامة آخر (10 مل) من DMEM مع كولاجيناز وdispase (1 ملغ / مل) (ويشار إلى DMEM-collagenase/dispase).
- إعداد الخلايا البطانية الثقافة المتوسطة (ECCM، 500 مل)، على أن تستكمل مع EGF (5 ميكروغرام)، رسم القلب (100 ملغ) و 5 ميكرولتر من محلول مضاد فطري للمضادات الحيوية. ECCM يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة شهرين.
- Prewarm جميع وسائل الإعلام قبل الاستخدام.
- إعداد تنقية العازلة: برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.2 مع 0.5٪ BSA و 2 ملي EDTA. إبقاء العازلة الباردة (2-8 درجة مئوية).
2. إزالة الأجنة وتشريح الدماغ الانتهائي
تمت الموافقة على جميع التجارب باستخدام الحيوانات المختبرية بواسطة رعاية الحيوان واستخدام لجان من مستشفى ماكلين وتتفق مع المبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.
- استخدام توقيت الفئران CD1 الحوامل (اليوم الجنينية 15). ويعتبر اليوم من اكتشاف المكونات المهبلية اليوم الجنينية 0 (E0). السدود CD1 تنتج عادة الفضلات كبيرة، لذلك الجنين 10-12ويتوقع من سد الحوامل ق.
- لبضع الرحم، تخدير الفئران الحوامل مع حقنة داخل الصفاق من الكيتامين (100 ملغ / كلغ) / زيلازين (5 ملغ / كلغ). بالنسبة للفئران حوالي 20-30 غرام، تقديم 0.3 مل من محلول مخدر 10 مل / كغ الكيتامين / زيلازين والتأكد من أن الألم والضيق هو الحد الأدنى أثناء الحقن داخل الصفاق من تأثير المخدر. استخدام اليد لضبط النفس الحقن.
- تحقق التخدير العميق عن طريق قرصة أخمص قدميه. ازالة الأجنة من الفئران تخدير عميق. قطع رأس كل جنين فور إزالة من الأم. وضع رؤساء الجنينية في أطباق بتري معقمة في الجليد الباردة PBS.
- متابعة استئصال الرحم عن طريق القتل الرحيم مع جرعة زائدة من مخدر فوري (130 ملغ / كغ بنتوباربيتال، والملكية الفكرية)، وهي طريقة للقتل الرحيم، وهو ما يتسق مع المبادئ التوجيهية اخر احصاء للالقتل الرحيم للحيوانات: 2013 الطبعة.
- تحت المجهر ستيريو، وإزالة المخ من الرأس مع مقص microtip غرامة وملقط غرامة. ملاحظة: A تشريح عالية الجودةأيون هو ضروري لإزالة الغشاء حنوني بنجاح من المخ الجنينية. ويتحقق ذلك عن طريق الممارسة. ملقط غرامة ومقص microtip هي أيضا الأدوات الرئيسية من أجل الحصول على تشريح جيدة.
- استخدام ملقط للحصول على احكام قبضتهم على الدماغ ومقص microtip لقشر بعيدا الغشاء حنوني. إزالة الدماغ المتوسط والدماغ التالي وعزل لل telencephalon. نقل مجانية حنوني-الدماغ الانتهائي من جميع الأجنة إلى صحن الثقافة 35 ملم مع 2 مل PBS في الجليد.
3. عزل الخلايا
- تخطر لل telencephalon إلى 1-2 ملم شظايا بشفرة المشرط وجمع الأنسجة في 15 مل فالكون أنبوب يحتوي على 2 مل من DMEM كاملة.
- فصل الأنسجة بلطف ولكن بدقة مع ماصة 1 مل حتى كتل تختفي ويتم التوصل إلى وقف حليبي.
- الطرد المركزي الخلايا في فصل 800-1،000 x ج لمدة 5 دقائق في RT.
- إزالة بعناية طاف و resuspend بيليه في DMEM الدناز أولا بلطف يفرق بين مLLS مرة أخرى باستخدام ماصة 1 مل وأجهزة الطرد المركزي في 800-1،000 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
- resuspend الكرية في DMEM كاملة الدافئة. تصفية الخلايا من خلال العقيمة 70 ميكرومتر شبكة النايلون. جمع الخلايا التي تمت تصفيتها والاحتفاظ بها في الجليد.
- جمع أجزاء الخلية، احتفظت على شبكة وهضم المزيد مع DMEM-collagenase/dispase (2 مل) لمدة 1-2 دقيقة في RT. غسل الخلايا 3X في DMEM الدناز أنا من خلال الطرد المركزي في 800-1،000 x ج لمدة 5 دقائق على RT. تجمع هذه الخلايا مع الخلايا التي تمت تصفيتها جمعها في الخطوة 3.5. غسل خلايا مرة واحدة مع مجموعه كاملة DMEM. المضي قدما لتحديد عدد الخلايا وخطوات وضع العلامات المغناطيسي. ملاحظة: من المهم الحصول على تعليق خلية واحدة قبل وضع العلامات المغناطيسي.
4. وصفها المغناطيسي
- يظهر هذا البروتوكول وصفها المغناطيسي من 10 7 الخلايا. لأرقام الخلية أقل من 10 7، استخدام نفس حجم الكاشف وللأرقام الخلية أكبر من 10 7، زيادة كافة وحدات التخزين وكاشف إجمالي حجموفقا لذلك (على سبيل المثال ل2 × 10 7 مجموع الخلايا، استخدم مرتين حجم كل الكواشف المشار إليها). إبقاء كل الكواشف والخلايا في الجليد.
- تحديد عدد الخلايا مع عدادة الكريات.
- تعليق خلية الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. نضح طاف تماما.
- إضافة 90 μl/10 7 خلايا العازلة تنقية لبيليه الخلية تليها 10 ميكرولتر من بلي CD31. ومترافق وبلي المقدمة من قبل الشركة المصنعة لوحيدة النسيلة المضادة للماوس CD31 الأجسام المضادة.
- تخلط جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة في الثلاجة. ملاحظة: ارتفاع درجات الحرارة و / أو أطول فترة حضانة خلال وضع العلامات المغناطيسي قد يؤدي إلى الربط غير محددة.
- غسل الخلايا بإضافة 1-2 ml/10 7 خلايا العازلة تنقية وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة. إزالة الخلايا وطاف resuspend في 500 ميكرولتر من العازلة تنقية. انتقل إلى الفصل المغناطيسي أو خطوة التنقية.
5. بوrification
- وضع العمود MS في المجال المغناطيسي للفاصل MACS.
- شطف العمود مع 500 ميكرولتر من العازلة تنقية.
- تنطبق على تعليق خلية العمود. تحميل عدد مناسب من الخلايا إلى العمود MS عن ارتفاع عدد الخلايا قد تسد العمود. تحذير: كل عمود MS يمكن أن تستوعب أكبر عدد ممكن من 2 × 10 7 خلايا، وذلك لعدد الخلايا أعلى، واستخدام أكثر من الأعمدة.
- جمع وتجاهل التدفق من خلال الخلايا التي تحتوي على أونلبلد.
- غسل العمود مع 500 ميكرولتر من العازلة تنقية ثلاث مرات. خلال خطوات الغسيل، تأكد من أن خزان العمود فارغة قبل إضافة اللاحقة مأخوذة العازلة تنقية.
- إزالة عمود من فاصل MACS ووضعه على أنبوب فالكون 15 مل.
- ويتم تزويد المكبس مع عمود MS. ماصة 1 مل من العازلة تنقية على عمود MS وعلى الفور طرد الخلايا المسمى مغناطيسيا عن طريق دفع المكبس بقوة في العمود.
- لوحة سلليرة سورية على طبق ثقافة 35 مم precoated مع الكولاجين من النوع 1 وتنمو الخلايا في ECCM في حاضنة تعيين إلى 37 درجة مئوية مع 95٪ O 2 و 5٪ CO 2.
- تغيير المتوسطة كل أربعة أيام. استخدام PVECs للتجارب أو ثقافة فرعية بعد 10-12 يوما عندما طبق هو متموجة.
6. ثقافة فرعية من PV ECS
- إزالة ECCM وشطف أحادي الطبقة من PVECS مع 1-2 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة.
- بلطف إضافة 1.5 مل من 0.25٪ التربسين EDTA-حل لتغطية أحادي الطبقة الخلية.
- العودة الطبق إلى الحاضنة. في غضون 5-7 دقائق، وفصل الخلايا من سطح الطبق.
- بعد أن فصل الخلايا، إضافة على الفور حجم مساو من مثبط التربسين ويسحن عدة مرات.
- نقل الخلايا إلى أنبوب العقيمة 15 مل فالكون. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب في 500 x ج لمدة 5 دقائق.
- إزالة طاف و resuspend بيليه في 1 مل من prewarmed ECCM.
- بذر خلايا لتوسيع الثقافة، والتراسل الفوريالشيخوخة أو فحوصات أخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يظهر توصيف المظهري من PVECs من يوم 1-12 خلال المرحلة على النقيض المجهر الضوئي (الشكل 2). الخلايا تعلق على طبق في يوم 1 عرض التشكل سمة من انقسام الخلايا (الشكل 2A). بين 5-8 أيام، PVECs الانتقال من المرصوفة بالحجارة لالمغزل التشكل على شكل نموذجي للخلايا البطانية وأقرب إلى الجسم الحي في الدولة (أرقام 2B و 2C). بعد يوم 12 ثقافة PVEC يحقق التقاء الكامل (الشكل 2D). PVECs يمكن subcultured بسهولة لتوسيع مستعمرة (أرقام 2E-G). تأسست نقاء مزارع الخلايا البطانية مع علامات الخلية البطانية - Isolectin B4، CD-31/PECAM-1، عامل فون ويلبراند (VWF) وVE كادهيرين وكان مصمما على أن يكون مئة في المئة بعد ثقافة فرعية (أرقام 2H-K).
الصور التكبير عالية من PVECs المحضرة من الأجنة CD1 فضلا عن التعادلالأجنة 2-GFP تظهر 4 (الذي الخلايا البطانية التعبير عن GFP) (الشكل 3). بالإضافة إلى الحصوه المشتركة والمغزل على شكل الأشكال التضاريسية (أرقام 3A-C)، لوحظت الأشكال التضاريسية المضلعة مع العمليات نحيلة أيضا في isolectin وTie2-GFP + لقد PVECs (أرقام 3D و 3E) المسمى B4. في بعض الكولاجين المغلفة أطباق ثقافتنا (في غياب Matrigel)، PVECs شكلت أنماط شعرية تشبه السمة الفريدة للفي الجسم الحي المحيطة بالبطين شبكة الأوعية الدموية (الشكل 3F). هذا يعكس إمكانات عائية عالية من PVECs. تم إجراء مقايسة الأوعية الدموية التي PVECs (2 × 10 4 خلايا) تمت إضافتها إلى الأطباق الثقافة المغلفة مع Matrigel المصفوفة. أظهرت PVECs تشكيل أنبوب قوية في غضون 18 ساعة (الشكل 3G). تقدم هذه النتائج دليلا قويا على أن هذا النظام يمكن أن تستخدم في المختبر البطانية نموذج الخلية. PVECs معزولةمن أجنة CD1 يمكن أن توصف بسرعة مع البلورات النانوية Qdot (الشكل 3H) التي تقدم مضان مستقرة مكثفة في سيتوبلازم الخلايا الحية، ويمكن استخدامها لدراسات طويلة الأجل من PVECs الحية، بما في ذلك الهجرة، الحركة، مورفولوجيا، المقايسات خلية وظيفة كذلك في التجارب المجراة. يمكن transfected PVECs مع استشفاف خلية مثل خلية ضوء البلازما غشاء طلب تقديم العروض، BacMam 2.0 (الشكل 3I) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة لتصور واضح للمورفولوجيا الخلايا الحية في تجارب التصوير الخلية.
نحن مثقف PVECs ليس فقط في ECCM، ولكن أيضا في الفئران البطانية الدماغ نمو الخلايا المتوسطة (RBECGM) وDMEM F12 المتوسط. كلا النقيض من المرحلة (أرقام 4A، 4C، و4E) وisolectin B4 صفت الصور (أرقام 4B، 4D، و4F) من PVECs مثقف في ECCM (أرقام 4A و 4B)، RBECGM (أرقام 4C و
الشكل 1. التخطيطي PVEC العزلة. بروتوكول يستخدم لعزل وعوتتلخص urification من PVECs من لل telencephalon الجنينية في المخطط. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 2. توصيف المظهري من PVECs. (AG) وصور المرحلة النقيض من ثقافة PVEC في نقاط زمنية مختلفة بعد الطلاء. (A) في يوم الثقافة PVEC 1. وقد أرفقت الخلايا وتظهر الأشكال التضاريسية الانقسام. (ب) الثقافة PVEC في يوم 5 و (C) في يوم 8 الانتقال من الحصوه إلى المغزل شكل التشكل. (D) PVEC الثقافة حققت التقاء في يوم 12. (E) PVECs بعد ثقافة فرعية في يوم 1، (F) يوم 5 (G (HJ) Immunolabeling من PVECs باستخدام علامات الخلية البطانية: Isolectin B4 (H)، عامل فون ويلبراند (I)، CD31/PECAM (J) وVE كادهيرين (K). أشرطة النطاق: A، 100 ميكرومتر (ينطبق BJ)، K، 50 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الرقم 3. الأشكال التضاريسية من PVECs. (AE) صور عالية التكبير من isolectin وTie2-GFP + لقد PVECs تظهر الحصوه والمغزل على شكل التشكل (AC)، وكذلك التشكل المضلعة ذات امتدادات طويلة نحيلة (D، E) المسمى B4. (<تظهر قوية> F) PVECs المحتملة عائية عالية في صحن الثقافة حتى في غياب Matrigel. (G) PVECs تظهر تشكيل أنبوب قوية في فحص الأوعية الدموية في Matrigel. (H) PVECs المسمى مع البلورات النانوية Qdot. (I) PVECs transfected مع خلية ضوء البلازما غشاء طلب تقديم العروض، BacMam 2.0. أشرطة النطاق: A، 50 ميكرون، B، 15 ميكرومتر (ينطبق CE)، F، و 100 ميكرومتر (ينطبق G، H)، I، 50 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 4. PVECs تزرع في مختلف وسائل الإعلام ثقافة المعرض البديل التشكل. (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في PVEC هي أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية من الخلايا البطانية الكبار الدماغ وECS من مصادر الأنسجة الأخرى للدراسات تركز على التفاعلات الوعائية العصبية وأيضا لديها الإمكانات العلاجية. لإعداد PVEC، فمن بداية حاسمة مع تشريح للعمل بسرعة لتحقيق الجدوى جيدة منذ الخلايا الميتة قد ربط nonspecifically لبلي CD31. بالإضافة إلى ذلك، إذا لم يتحقق تعليق خلية واحدة قبل الخطوة وضع العلامات المغناطيسي، وهذا سوف يؤدي إلى استكشاف الأخطاء وإصلاحها منذ كتل الخلايا سوف تسد العمود. ميزة هذا الأسلوب هو أنه ليست هناك حاجة للحضانة مع التربسين لفصل الخلايا من حبات مغناطيسية، وهي خطوة تستغرق وقتا طويلا وغالبا ما يصعب استخدامها في الطرق الأخرى القائمة على حبة المغناطيسي الانفصال عن استعدادات المفوضية الأوروبية 4،7. بالإضافة إلى ذلك، لا تتطلب هذه التقنية العزلة كميات كبيرة من أنسجة المخ الجنينية. في PVEC يمكن إعداد باستمرار مع استخدام ماوس الحوامل توقيت واحد في APPRoximately 12 يوما، subcultured، واستخدامها في مجموعة متنوعة واسعة من في التجارب المختبرية والتجارب المجراة.
نقاء PVECs بعد عزل أكثر من 90٪ ولكن نقاء PVECs بعد ثقافة فرعية هي 100٪. بالإضافة إلى الخلايا البطانية، وجدت PECAM-1 على سطح حيدات / الضامة. الخلايا الدبقية الصغيرة، والسكان البلاعم في الجهاز العصبي المركزي هو إلا منخفضة جدا في مخ الفأر الجنينية بالمقارنة مع ما بعد الولادة أو الدماغ الكبار 8. حيدات / الخلايا الدبقية الصغيرة تحتاج المتوسطة تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين وعوامل النمو محددة لتنمو، بل سوف يموت في نهاية المطاف في ECCM ولن يدوم بعد ثقافة فرعية من PVECs. عندما تكون هناك حاجة PVECs نقية 100٪ فورا بعد العزلة (على سبيل المثال، لاختبار التعبير الجيني)، ونحن نستخدم مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) الأسلوب. ثم يتم عزل PVECs من أجنة Tie2GFP (في الخلايا البطانية التي فقط التعبير عن GFP) وفرزها بشكل صارم من خلال تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية المزدوجة. نقاء بطائن فرزهاوتكفل خلايا ل من خلال مجموعة من الخلايا التي هي مزدوجة إيجابية لGFP وCD31/PECAM-1 6.
كما لوحظ بشكل وثيق الثقافات في الأسبوع الأول من العزلة لتلويث أنواع الخلايا مثل pericytes. منذ الخلايا خلية حوطية وغير منتظمة الشكل، وسوف تشكل أبدا أحادي الطبقة متموجة على عكس الخلايا البطانية التي تتكون من المغزل على شكل أو خلايا متعددة الأضلاع اتصلت التي تنمو كما المستعمرات، فهي سهلة للاعتراف إذا كان موجودا. إذا تم الكشف عن خلية حوطية التلوث، يليه تركيز أقل من التربسين (0.05٪) عن طريق إجراء trypsinization سريعة يستخدم (2-3 دقيقة) للثقافة فرعية من PVECs. Pericytes تتطلب الوقت trypsinization الممتدة (7-10 دقيقة) وسيبقى المرفقة. بالإضافة إلى ذلك، كفاءة الطلاء من pericytes trypsinized (إن وجدت) هي سيئة للغاية. هذه الخطوات إزالة التلوث خلية حوطية وضمان PVECs subcultured هي محض.
المتوسط ECCM هو وسيلة المصل منخفضة تحتوي على الهيدروكورتيزون،وتستكمل الهيبارين و 2٪ مصل بقري جنيني ومع عامل نمو البشرة (صندوق تعديل العولمة الأوروبي) والبطانية الملحق نمو الخلايا (رسم القلب). أظهرت PVECs تزرع في ECCM المغزل التشكل على شكل باستمرار. يحتوي على ECGM الدماغ الفئران 10٪ مصل بقري جنيني، عوامل النمو، وVEGF. PVECs تزرع في هذه الوسائط لديك الأشكال التضاريسية ممدود جدا ويستغرق وقتا أطول لتحقيق confluency. وتستكمل المتوسطة DMEM-F12 مع 10٪ مصل بقري جنيني، GlutaMAX والبطانية تكملة نمو الخلايا وأنه يدفع أكثر من انتشار وسائل الإعلام الأخرى. على الرغم من PVECs تزرع في هذه الوسائط أظهرت نموا سريعا جدا وconfluency تحققت في 4 أيام، كانت الأشكال التضاريسية شقتهما أو متعددة الأضلاع فقط. لقد نمت PVECs في ECCM لمدة تصل إلى ثلاثة مقاطع دون فقدان النمط الظاهري وظيفة. وبالتالي، ECCM هي الوسيلة التي نفضل للثقافة PVEC.
PVECs cocultured مع السلائف الخلايا العصبية عن طريق هذا البروتوكول من المرجح أن تحفز الخلايا العصبية والخلايا العصبية الهجرة لكرة القدمR-بدرجات أكبر من الخلايا البطانية من الدماغ الكبار أو من مصادر أخرى، وربما تكون ذات قيمة لمساعدة استعادة وظيفة الجهاز العصبي في المخ، إصابات في الدماغ أو تنكس عصبي. وغالبا ما تم الإبلاغ عن السلائف الخلايا العصبية المزروعة في الدماغ الكبار للمماطلة وعدم الهجرة الى المناطق التي تتطلب خلايا عصبية جديدة. يتم احتساب هذه المشكلة لعدم وجود ركائز التي تسهل الهجرة العصبية مثل أدلة الدبقية شعاعي 9. يتزايد تقدير الأوعية الدموية بمثابة ركائز للهجرة الخلايا العصبية 6،10،11. PVECs قد تقدم حلا لهذه السلائف العصبية المتوقفة في مواقع الزرع. Coimplantation من PVECs والخلايا العصبية في مناطق الدماغ التالفة قد تسهل الهجرة الموجهة من الخلايا العصبية بواسطة الخلايا البطانية ويساعد على تحقيق الانتعاش وظيفية. الارتباط الوثيق الخلايا البطانية مع الخلايا العصبية المهاجرة أيضا يجعلها مناسبة فريدة لتقديم عوامل النمو وmorphogens مباشرة وبشكل انتقائي فيهجرة الخلايا العصبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
أعلن عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل التحالف الوطني لأبحاث الفصام والاكتئاب (NARSAD) جائزة الباحث الشاب والمعاهد الوطنية للصحة منح R01NS073635 لAV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNase I | Sigma | D-4527 | |
| Collagen, Type 1 solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| DPBS | Quality Biologicals | 114057-131 | |
| EDTA | Fisher Scientific | M4055 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| MS column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| CD31 microbeads | Miltenyi Biotech | 130-097-418 | |
| MACS separator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Bioscience | 352350 | |
| Antibiotic and antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| 35 mm Culture dish | BD Bioscience | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352097 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352098 | |
| ECCM kit | BD Bioscience | 355054 | Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF, and Soybean Trypsin Inhibitor |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Bioscience | 354006 | |
| RBECGM | Cell Applications | R819-500 | |
| DMEM F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 305050-061 | |
| Tissue culture grade water | Life Technologies | 15230162 | |
| 0.25% Trypsin | Life Technologies | 15050 | |
| Soybean trypsin inhibitor | BD Bioscience | 5425 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Life Technologies | Q25021 | |
| CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0 | Life Technologies | C10608 | |
| Biotinylated Isolectin B4 antibody | Sigma | L2140 | |
| Anti-Von Willebrand factor | Sigma | F3520 | |
| Anti-CD31/PECAM-1 | BD Pharmingen | 550274 | |
| VECTASHIELD Hardset Mounting Media with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Ketamine | Butler Schein Animal Health Supply | 44028 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 1009 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Inverted microscope | Olympus CK-40 | CK-40 | |
| Fluorescent microscope | Olympus FSX-100 | FSX-100 | |
| Fine forceps | Roboz Surgical Instrument | 7 inox | |
| Fine microtip scissors | Roboz Surgical Instrument | RS5611 |
References
- Shen, Q., S, G., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
- Milner, R. A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system. BMC Neurosci. 8, 3 (2007).
- Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo. 19, 1469-1485 (2008).
- Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).
- Vasudevan, A., Bhide, P. G. Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale. Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).
- Won, C. K., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).
- Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).
- Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One. 6, (2011).
- Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain. 2, 461-466 (1999).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
