Summary
Denne video viser en nem og pålidelig strategi for forberedelsen af rene kulturer af endotelceller fra den embryonale forhjernen indenfor 10-12 dage og vil være nyttigt for forskning fokuseret på mange aspekter af cerebral angiogenese.
Abstract
Embryonale hjerne endotelceller kan tjene som et vigtigt redskab i studiet af angiogenese og neurovaskulære udvikling og samspil. De to vaskulære netværk af embryonale forhjerne, pial og periventricular, er rumligt karakteristisk og har forskellige oprindelser og vækstmønstre. Endotelceller fra pial og periventrikulære vaskulære netværk har unikke genekspressionsprofiler og funktioner. Her præsenterer vi en trin-for-trin-protokollen for isolation, kulturforskelle, og verifikation af rene populationer af endotelceller fra periventrikulær vaskulære netværk (PVECs) i embryonale forhjerne (telencephalon). I denne fremgangsmåde er telencephalon mangler pial membran opnået fra embryonisk dag 15 mus hakket fordøjet med collagenase / dispase og dispergeres mekanisk til en enkelt cellesuspension. PVECs renses fra celle suspension ved hjælp af positiv selektion med anti-CD-31/PECAM-1 antistof konjugeret til mikroperler ved hjælp af et stærkt magnetiskseparationsmetode. Oprensede celler er dyrket på collagen 1 coatede dyrkningsskåle i endotel celledyrkningsmedium indtil de bliver sammenflydende og yderligere subdyrket. PVECs opnået med denne protokol udstille brosten og spindel formet fænotyper, som visualiseres ved fasekontrast lysmikroskopi og fluorescens mikroskopi. Renheden af pVec kulturer blev etableret med endotelcellespecifikke markører. I vores hænder, denne metode pålideligt og konsekvent giver rene populationer af PVECs. Denne protokol vil gavne undersøgelser med henblik på at opnå mekanistiske indblik i forebrain angiogenese, forståelse pVec interaktioner, og cross-samtaler med neuronale celletyper og rummer et enormt potentiale for terapeutisk angiogenese.
Introduction
Angiogenese, neurogenese og neuronal migration er kritiske hændelser i det centrale nervesystem (CNS) udvikling, reparation og regeneration. Flere elegante undersøgelser har vist, at endotelceller stimulere neuronal proliferation og vice versa via frigivelse af opløselige faktorer, og ved direkte kontakt. Vi fandt det mærkeligt, at i de fleste af disse undersøgelser 1-3, mens neuronal progenitorer / neurale stamceller er isoleret fra embryonale hjerne, er de samdyrket med endotelceller fra den voksne hjerne, andre voksne vævskilder eller endotheliale cellelinier. Dette kan delvis skyldes de tekniske vanskeligheder, der er forbundet med isolering og dyrkning af rene populationer af endotelceller fra embryonale hjerne. Men angiogenese, neurogenese, og neuronal migration er samtidige begivenheder i størrelsesordener mere robust i embryonale hjernen end i den normale voksne hjerne. Periventricular vaskulære netværk af embryonic forhjerne (telencephalon) stammer fra et skib beliggende inden basalganglierne primordium og udvikler sig i form af en ordentlig gradient fra ventrale til dorsal telencephalon af embryonal dag 11 (E11) 4,5. Denne plexus af fartøjer af periventrikulær vaskulære netværk adskiller sig fra pial fartøjer baseret på oprindelse, anatomiske placering, vækstmønstre og udviklingsmæssige regulering 4,5. Retningen af udbredelsen af periventricular angiogenese gradient matcher telencephalic tværgående neurogenetic gradient. Inden telencephalon, periventricular angiogenese gradient og gradienten af GABA-neuroner migrerer tangentielt overlapper rumligt samt 6. Med hensyn til timing, angiogenese gradient er forud for den neurogenetic gradient og GABA neuron gradient med omkring en dag. Således periventrikulære endotelceller er rumligt og tidsligt godt positioneret til at levere kritiske stikord til at understøtte telencephalic neurogenesis ogneuronal migration 4,6. Derfor, brug af embryonale periventrikulære endotelceller i cokultur eksperimenter med neuronale forfædre og / eller neuroner ville give en mere gunstig model til at studere neurovaskulære interaktioner og udvikle nye muligheder for behandling af neurodegenerativ sygdom eller iskæmisk / traumatisk hjerneskade.
Vi understreger vigtigheden af at fjerne pial membran, ikke kun for at begrænse forurening epitelcelle men også at adskille pial endotelceller, som er molekylært og funktionelt adskilt fra endotelceller periventricular vaskulære netværk 4,6 (betegnes PVECs at skelne fra pial ECS), . Her beskriver vi den metode, som vi rutinemæssigt bruger i vores laboratorium for at opnå en rig og ren udbytte af PVECs. Disse endotelceller er fremstillet ud fra embryonale forebrains isoleret fra en enkelt timed-gravide mus. De kan udvides, videredyrkes, og frosset ned med succes til fremtidig brug.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Fremstilling af reagenser og opløsninger
- Coating 35 mm dyrkningsskål: Collagen Type 1 opløsning leveres som en vandig opløsning i 20 mM eddikesyre (~ 100 mg protein / hætteglas). Fortynd en passende mængde af kollagen opløsning til en fungerende koncentration på 0,01% under anvendelse af sterilt vævskulturkvalitet vand. Frakke retter med 1 ml collagen løsning for 3-4 timer ved stuetemperatur (RT) eller 37 ° C eller natten over ved 2-8 ° C. Fjern overskydende løsning fra det coatede fad og lad den tørre natten over. Skyl fad med vævskulturkvalitet vand eller PBS, før du tilføjer medier. Coatede skåle kan opbevares ved 4 ° C i en måned.
- Klargør hele Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM). Supplement DMEM (500 ml) med 10% FBS og antibiotika-antimykotisk opløsning (1x koncentration 1 ml/100 ml). Komplet DMEM kan opbevares ved 4 ° C i to måneder.
- Forbered en portion (50 ml) af DMEM med DNase I (0,001 mg / ml), (herefter benævnt DMEM-DNase I).
- Forbered en anden portion (10 ml) DMEM med collagenase og dispase (1 mg / ml) (benævnt DMEM-collagenase/dispase).
- Forbered Endothelial Cell Culture Medium (ECCM, 500 ml), suppleret med EGF (5 ug), ECGS (100 mg) og 5 pi antibiotisk antimykotisk opløsning. ECCM kan opbevares ved 4 ° C i to måneder.
- Forvarm alle medier før brug.
- Forbered Oprensning buffer: PBS, pH 7,2 med 0,5% BSA og 2 mM EDTA. Hold puffer kold (2-8 ° C).
2. Fjernelse af embryoner og Dissektion af telencephalon
Alle forsøg med laboratoriedyr er godkendt af dyr pleje og brug udvalg McLean Hospital og i overensstemmelse med NIH retningslinjer for pasning og anvendelse af forsøgsdyr.
- Brug tidsindstillede gravide CD1 mus (embryonale dag 15). Dagen for vaginalprop opdagelse anses embryonisk dag 0 (E0). CD1 dæmninger generelt producerer store kuld, så 10-12 embryos forventes fra en gravid dæmningen.
- For hysterotomi, bedøver drægtige mus med en intraperitoneal injektion af ketamin (100 mg / kg) / xylazin (5 mg / kg). For mus 20-30 g, levere 0,3 ml af en 10 ml / kg Ketamin / Xylazin bedøvelsesmiddel løsning og sikre, at smerte og lidelse er minimal under intraperitoneale injektioner af bedøvelsesmiddel. Brug hånd tilbageholdenhed for injektioner.
- Tjek dyb anæstesi ved tå knivspids. Fjern embryoner fra dybt bedøvede mus. Halshugge hver embryo straks efter fjernelse fra moderen. Placer embryonale hoveder i sterile petriskåle i iskoldt PBS.
- Følg hysterektomi ved øjeblikkelig eutanasi med bedøvelsesmiddel overdosis (130 mg / kg pentobarbital, ip), en metode til aktiv dødshjælp, som er i overensstemmelse med AVMA retningslinjer for aflivning af dyr: 2013 Edition.
- Under et stereo mikroskop, fjerne hjernen fra hovedet med fine mikrospids saks og fine tænger. Bemærk: En høj kvalitet dissekereion er vigtigt at kunne fjerne pial membran fra embryonale hjerne. Dette opnås ved praksis. Fin pincet og microtip saks er også centrale redskaber til at få en god dissektion.
- Brug pincet til at få et fast greb om hjernen og mikrospids saks at skrælle væk pial membran. Fjern mesencephalon og metencephalon og isolere telencephalon. Overfør pial-fri telencephalon fra alle embryoner til en 35 mm kultur fad med 2 ml PBS i is.
3. Cell Isolation
- Hakke telencephalon i 1-2 mm fragmenter med en skalpel og samle vævet i et 15 ml Falcon-rør indeholdende 2 ml komplet DMEM.
- Adskille væv forsigtigt, men grundigt med en 1 ml pipette indtil klumper forsvinder, og en mælkeagtig suspension er opnået.
- Centrifuge dissocierede celler ved 800-1.000 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern forsigtigt supernatanten og resuspender pellet i DMEM-DNase I. forsigtigt adskille ceLLS igen under anvendelse af 1 ml pipette og centrifugeres ved 800-1.000 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Pellet resuspenderes i varmt komplet DMEM. Filter celler gennem en steril 70 um nylon mesh. Saml filtrerede celler og holde i is.
- Saml celle portioner tilbageholdt på mesh og fordøje videre med DMEM-collagenase/dispase (2 ml) i 1-2 minutter ved stuetemperatur. Vask cellerne 3x i DMEM-DNase I ved centrifugering ved 800-1.000 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Pool disse celler med de filtrerede celler opsamlet i trin 3.5. Vask totale celler én gang med komplet DMEM. Fortsæt at bestemme celleantallet og magnetiske mærkning trin. Bemærk: Det er vigtigt at opnå en enkelt-cellesuspension før magnetisk mærkning.
4.. Magnetisk Mærkning
- Denne protokol viser den magnetiske mærkning af 10 7-celler. For celle tal lavere end 10 7, skal du bruge det samme reagens volumen og for celle numre større end 10 7, skalere op alle reagensvolumener og de samlede mængdertilsvarende (f.eks 2 x 10 7 totale celler, skal du bruge det dobbelte af volumen af alle angivne reagenser). Hold alle reagenser og celler i is.
- Bestem celle nummer med et hæmocytometer.
- Centrifugeres cellesuspensionen ved 300 xg i 10 minutter ved stuetemperatur. Aspirer supernatanten fuldstændigt.
- Tilføj 90 μl/10 7 celler af oprensningspuffer til cellepelleten efterfulgt af 10 pi af CD31 mikroperler. De af producenten Microbeads konjugeres til monoklonale anti-mus CD31-antistof.
- Bland godt og inkuberes i 15 minutter i køleskab. Bemærk: Højere temperaturer og / eller længere inkubationstid under magnetisk mærkning kan resultere i uspecifik binding.
- Vask cellerne ved tilsætning af 1-2 ml/10 7 celler af rensning puffer og centrifugeres ved 300 xg i 10 min. Fjern supernatanten og resuspender cellerne i 500 pi oprensningspuffer. Fortsæt til magnetisk separation eller rensning skridt.
5.. Purification
- Placer MS kolonne i magnetfelt MACS Separator.
- Skyl kolonnen med 500 pi oprensningspuffer.
- Anvend cellesuspension på søjlen. Load passende antal celler til MS-søjle som højere celletal kan tilstoppe kolonnen. Forsigtig: Hver MS kolonne kan rumme et maksimalt antal på 2 x 10 7 celler, et højere celletal, bruge flere kolonner.
- Indsamle og kassér gennemstrømning indeholder umærkede celler.
- Vask søjlen med 500 pi oprensningspuffer tre gange. Under vasketrin, sørg for, at kolonnen reservoir er tom, før du tilføjer efterfølgende oprensningspuffer portioner.
- Fjern kolonnen fra MACS separator og placere den på en 15 ml Falcon rør.
- Et stempel er leveret sammen med MS kolonne. 1 ml af oprensningspuffer onto MS søjlen og straks skylle de magnetisk mærkede celler ved kraftigt at skubbe stemplet ind i kolonnen.
- Plate cells på en 35 mm dyrkningsskål præovertrukket med kollagen type 1 og dyrke celler i ECCM i en inkubator indstillet til 37 ° C med 95% O2 og 5% CO2.
- Skift medium hver fire dage. Brug PVECs for eksperimenter eller subkultur efter 10-12 dage, hvor fadet er sammenflydende.
6.. Subkultur af PV ECS
- Fjern ECCM og skyl monolag af PVECS med 1-2 ml sterilt PBS.
- Forsigtigt tilsættes 1,5 ml 0,25% trypsin-EDTA-opløsning for at dække cellemonolaget.
- Retur parabol til inkubatoren. Inden for 5-7 min, vil cellerne løsnes fra overfladen af skålen.
- Efter at cellerne har fritliggende straks tilsættes samme mængde trypsin inhibitor og tritureres flere gange.
- Overfør cellerne til et sterilt 15 ml Falcon-rør. Centrifuger røret ved 500 xg i 5 min.
- Fjern supernatanten og pellet resuspenderes i 1 ml forvarmet ECCM.
- Frø cellerne for at udvide kultur, imældning eller andre assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den fænotypiske karakterisering af PVECs fra dag 1-12 er vist ved fasekontrast lysmikroskopi (figur 2). Cellerne er knyttet til fadet på dag 1 viser morfologi karakteristisk for celledeling (figur 2A). Mellem 5-8 dage, til PVECs overgang fra brostensbelagte spindel formet morfologi typisk for endotelceller og mere beslægtet med dets in vivo tilstand (figur 2B og 2C). Ved dag 12 den pVec kulturen opnår fuld sammenløb (Figur 2D). PVECs kan videredyrkes nemt at udvide koloni (figur 2E-G). Renhed af endotel cellekulturer blev etableret med endotelcellespecifikke markører - Isolectin B4, CD-31/PECAM-1, Von Willebrand faktor (vWF), og VE-Cadherin og var bestemt til at være et hundrede procent efter subkultur (figur 2H-K).
Stor forstørrelse billeder af PVECs fremstillet af CD1 embryoner samt Tie2-GFP embryoner 4 (hvis endotelceller udtrykker GFP) er vist (figur 3). Ud over de fælles brosten og spindel formede morfologier (figur 3A-C), blev polygonale morfologier med slanke processer også observeret i isolectin B4-mærkede og Tie2-GFP + ve PVECs (figur 3D og 3E). I nogle af vore collagen coatede dyrkningsskåle (i fravær af Matrigel) PVECs dannede gitter mønstre ligner den unikke egenskab af in vivo periventricular vaskulære netværk (figur 3F). Det afspejler den høje angiogene potentiale PVECs. En angiogenese-assay blev udført, hvor PVECs (2 x 10 4 celler) blev tilsat til dyrkningsskålene coatet med Matrigel matrix. PVECs viste robust rør dannelse inden for 18 timer (figur 3G). Disse resultater giver stærke beviser for, at dette system kan anvendes som en in vitro-endotelcelle model. PVECs isoleredefra CD1 embryoner kan hurtigt mærkes med Qdot nanokrystaller (figur 3H), der leverer intens stabil fluorescens i cytoplasmaet i levende celler og kan bruges til langtidsstudier af levende PVECs, herunder migration, motilitet, morfologi, celle-funktion assays samt in vivo eksperimenter. PVECs kan transficeres med celle sporstoffer som Cellelys plasmamembran-RFP, BacMam 2,0 (figur 3I) ifølge producentens anvisninger for klar visualisering af cellemorfologi i levende celle billeddannelse eksperimenter.
Dyrkede vi PVECs ikke kun i ECCM, men også i rottehjerne endotelcellevækst-medium (RBECGM) og DMEM F12-medium. Både fasekontrast (4A, 4C og 4E), og isolectin B4 mærkede billeder (figur 4B, 4D og 4F) af PVECs dyrket i ECCM (4A og 4B) RBECGM (figur 4C og
Figur 1. Skematisk af pVec isolation. Den protokol, der bruges til isolering og purification af PVECs fra den embryonale telencephalon opsummeres i et skema. Klik her for at se større billede .
Figur 2. Fænotypisk karakterisering af PVECs. (AG) fasekontrast billeder af pVec kultur på forskellige tidspunkter efter plating. (A) pVec kultur på dag 1. Celler har vedhæftet og vise dividere morfologier. (B) pVec kultur på dag 5 og (C) på dag 8 skifter fra brosten til spindel form morfologi. (D) pVec kultur nået sammenløb på dag 12. (E) PVECs efter subkultur på dag 1 (F) dag 5 (G (HJ) immunmærkning af PVECs hjælp endotelceller markører: Isolectin B4 (H), Von Willebrand Factor (I), CD31/PECAM (J), og VE-cadherin (K). Skalapanelerne: A, 100 um (gælder BJ), K, 50 mM. Klik her for at se større billede .
Figur 3. Morfologier af PVECs. (AE) Høj forstørrelse billeder af isolectin B4-mærket og Tie2-GFP + ve PVECs viser brosten og spindel formet morfologi (AC) samt polygonal morfologi med slanke lange extensions (D, E). (<strong> F) PVECs viser høj angiogene potentiale i kultur fad selv i fravær af Matrigel. (G) PVECs viser robust dannelse rør i en angiogenese assay på Matrigel. (H) PVECs mærket med Qdot nanokrystaller. (I) PVECs transficeret med Cellelys plasmamembran-RFP, BacMam 2.0. Skalapanelerne: A, 50 mM, B, 15 pm (gælder CE), F, 100 um (gælder G, H), I, 50 mM. Klik her for at se større billede .
Figur 4.. PVECs dyrket i forskellige dyrkningsmedier show variant morfologi. (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PVec er er mere fysiologisk relevant end voksne hjerne endotelceller og ECS fra andre væv kilder til undersøgelser, der fokuserer på neurovaskulære interaktioner og også have terapeutisk potentiale. For pVec forberedelse, er det afgørende begyndelse med dissektion at arbejde hurtigt for at opnå en god rentabilitet, idet døde celler kan binde uspecifikt til CD31 mikroperler. Desuden, hvis en enkelt cellesuspension ikke opnås før den magnetiske mærkning trin, vil dette resultere i fejlfinding, da celleklynger vil tilstoppe kolonnen. En fordel ved denne metode er, at der ikke er behov for inkubering med trypsin for at frigøre cellerne fra magnetiske perler, en tidskrævende og ofte vanskeligt trin anvendes i andre magnetiske kugle-baserede adskillelsesmetoder for EF præparater 4,7. Hertil kommer, at denne isolation teknik kræver store mængder af embryonale hjernevæv. PVec er konsekvent kan fremstilles med brug af en enkelt tidsindstillet gravide mus i caoximately 12 dage videredyrkes, og anvendes i en lang række in vitro og in vivo eksperimenter.
Renheden af PVECs efter isolering er over 90%, men renheden af PVECs efter subkultur er 100%. Ud over endotelceller er PECAM-1 findes på overfladen af monocytter / makrofager. Microglia makrofag befolkning i CNS er imidlertid meget lav i embryonale musehjerne forhold til postnatal eller voksne hjerne 8. Monocytter / microglia brug medium suppleret med 10% føtalt kalveserum og specifikke vækstfaktorer til at vokse, de vil dø ud til sidst i ECCM og vil ikke vare efter subkultur af PVECs. Når der er behov for 100% rene PVECs straks efter isolering (for eksempel for at afprøve genekspression), bruger vi fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS)-metoden. PVECs isoleres derefter fra Tie2GFP embryoner (hvor kun endotelceller udtrykker GFP) og strengt sorteret efter dobbelt FACS-analyse. Renheden af sorterede endotelerL-celler sikres ved samling af celler, der er dobbelt positive for GFP og CD31/PECAM-1 6.
Kulturer er også observeres nøje i den første uge af isolation for at forurene celletyper som pericytes. Da pericyt celler uregelmæssigt er formet og vil aldrig danne et sammenflydende monolag modsætning endotelceller, som består af spindel formede eller polygonale, kontaktede celler, der vokser som kolonier, de er nemme at genkende, hvis til stede. Hvis der registreres pericyt forurening, en lavere koncentration af trypsin (0,05%), efterfulgt af en hurtig trypsinisering procedure (2-3 min) anvendes til subkultur af PVECs. Pericytes kræve en længere trypsinisering tid (7-10 min), og vil fortsat være tilknyttet. Desuden udpladningseffektivitet af trypsinbehandlede pericytes (hvis nogen) er meget dårlig. Disse trin fjerne pericyt forurening og sikre, at subdyrket PVECs er rene.
Den ECCM medium er et lavt serum-medium indeholdende hydrocortison,heparin og 2% kalvefosterserum og suppleret med epidermal vækstfaktor (EGF) og endotelcelle vækstsupplement (ECGS). PVECs dyrket i ECCM viste spindel formet morfologi konsekvent. Rottehjernen ECGM indeholder 10% føtalt bovint serum, vækstfaktorer og VEGF. PVECs dyrkes i dette medie har meget aflange morfologier og tage længere tid at nå sammenflydning. DMEM-F12-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, Glutamax og endotelcellevækst supplement og inducerer mere spredning end andre medier. Selvom PVECs dyrkes i dette medie viste meget hurtig vækst og opnået sammenflydning i 4 dage, deres morfologier var flad eller kun polygonal. Vi er vokset PVECs i ECCM i op til tre passager uden tab af fænotype og funktion. Derfor ECCM er det medium, som vi foretrækker for pVec kultur.
PVECs samdyrket med neuronale forstadier af denne protokol vil sandsynligvis stimulere neurogenese og neuronal migration til far-større omfang end endotelceller fra voksen hjerne eller fra andre kilder og kan være værdifulde for medvirken inddrivelse af neurologiske funktion i slagtilfælde, traumatisk hjerneskade eller neurodegeneration. Neuronale forstadier transplanteret i den voksne hjerne er ofte blevet rapporteret at stå, og undlader at migrere i regioner, der kræver nye neuroner. Dette problem er tegnede fraværet af substrater, der letter neuronal migration som radiale glial guides 9. Vasculature stigende grad værdsat som substrater for neuronal migration 6,10,11. PVECs kan tilbyde en løsning for disse strandede neuronale forstadier til transplantationscentre sites. Coimplantation af PVECs og neuroner i beskadigede områder af hjernen kan gøre det lettere guidet vandring af neuroner af endotelceller og hjælpe med at opnå funktionel genopretning. Den tætte sammenslutning af endotelceller med migrerer neuroner gør dem også unikt egnet til at levere vækstfaktorer og morfogener direkte og selektivt indmigrerer neuroner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en Nationale Alliance for forskning i Skizofreni og Depression (NARSAD) Young Investigator Award og National Institutes of Health indrømmer R01NS073635 til AV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNase I | Sigma | D-4527 | |
| Collagen, Type 1 solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| DPBS | Quality Biologicals | 114057-131 | |
| EDTA | Fisher Scientific | M4055 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| MS column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| CD31 microbeads | Miltenyi Biotech | 130-097-418 | |
| MACS separator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Bioscience | 352350 | |
| Antibiotic and antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| 35 mm Culture dish | BD Bioscience | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352097 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352098 | |
| ECCM kit | BD Bioscience | 355054 | Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF, and Soybean Trypsin Inhibitor |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Bioscience | 354006 | |
| RBECGM | Cell Applications | R819-500 | |
| DMEM F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 305050-061 | |
| Tissue culture grade water | Life Technologies | 15230162 | |
| 0.25% Trypsin | Life Technologies | 15050 | |
| Soybean trypsin inhibitor | BD Bioscience | 5425 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Life Technologies | Q25021 | |
| CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0 | Life Technologies | C10608 | |
| Biotinylated Isolectin B4 antibody | Sigma | L2140 | |
| Anti-Von Willebrand factor | Sigma | F3520 | |
| Anti-CD31/PECAM-1 | BD Pharmingen | 550274 | |
| VECTASHIELD Hardset Mounting Media with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Ketamine | Butler Schein Animal Health Supply | 44028 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 1009 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Inverted microscope | Olympus CK-40 | CK-40 | |
| Fluorescent microscope | Olympus FSX-100 | FSX-100 | |
| Fine forceps | Roboz Surgical Instrument | 7 inox | |
| Fine microtip scissors | Roboz Surgical Instrument | RS5611 |
References
- Shen, Q., S, G., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
- Milner, R. A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system. BMC Neurosci. 8, 3 (2007).
- Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo. 19, 1469-1485 (2008).
- Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).
- Vasudevan, A., Bhide, P. G. Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale. Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).
- Won, C. K., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).
- Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).
- Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One. 6, (2011).
- Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain. 2, 461-466 (1999).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
