Summary
Dieses Video zeigt eine einfache und zuverlässige Strategie zur Herstellung von Reinkulturen von Endothelzellen aus dem embryonalen Vorderhirn innerhalb von 10-12 Tagen und wird nützlich für die Forschung über viele Aspekte der Gehirn Angiogenese konzentriert sein.
Abstract
Embryonale Endothelzellen des Gehirns kann als ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung der Angiogenese und neurovaskulären Entwicklung und Wechselwirkungen dienen. Die beiden Gefäßnetze der embryonalen Vorderhirn, Pia und periventrikuläre, räumlich markante und haben unterschiedliche Ursprünge und Wachstumsmuster. Endothelzellen aus der Pia-und periventrikuläre Gefäßnetze haben einzigartige Genexpressionsprofilen und Funktionen. Hier präsentieren wir Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Isolierung, Kultur, und die Überprüfung der reine Populationen von Endothelzellen aus der periventrikulären Gefäßnetz (PVECs) der embryonalen Vorderhirn (Telencephalon). In diesem Ansatz wird Telen ohne Pia Membran aus embryonalen Tag 15 Mäusen zerkleinert, mit Collagenase / Dispase verdaut und mechanisch in eine Einzelzellsuspension dispergiert. PVECs werden aus Zellsuspension mit positiven Selektion mit anti-CD-31/PECAM-1 Antikörper MicroBeads konjugiert mit einem starken Magnet gereinigtTrennverfahren. Gereinigte Zellen auf Kollagen 1 beschichtet Kulturschalen in endothelialen Zellkulturmedium kultiviert, bis sie konfluent und weitere Subkultur geworden. PVECs erhalten mit diesem Protokoll Ausstellung mit Kopfsteinpflaster und spindelförmigen Phänotypen, wie Phasenkontrast-Lichtmikroskopie und Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. Die Reinheit der Kulturen wurde mit PVEC Endothelzellmarker etabliert. In unseren Händen, diese Methode zuverlässig und konsequent ergibt reine Populationen PVECs. Dieses Protokoll wird mechanistische Studien an gewinnen Einblicke in Vorderhirn Angiogenese, Verständnis PVEC Wechselwirkungen und Quer Gespräche mit neuronalen Zelltypen und hält ein enormes Potenzial für therapeutische Angiogenese gerichtet profitieren.
Introduction
Angiogenese, Neurogenese und neuronale Migration sind kritische Ereignisse im zentralen Nervensystem (ZNS), Entwicklung, Reparatur und Regeneration. Mehrere elegant Studien haben gezeigt, dass Endothelzellen neuronalen Proliferation und umgekehrt stimulieren durch Freisetzung von löslichen Faktoren und durch direkten Kontakt. Wir fanden es merkwürdig, dass in der Mehrzahl dieser Studien 1-3, während die neuronalen Vorläuferzellen / neuralen Stammzellen aus dem embryonalen Gehirn isoliert, sie sind mit Endothel-Zellen aus dem erwachsenen Gehirn, andere erwachsene Gewebequellen oder mit einer endothelialen Zelllinien kokultiviert. Dies kann zum Teil aufgrund der technischen Schwierigkeiten bei der Isolierung und Kultivierung reine Populationen von Endothelzellen aus dem embryonalen Gehirn. , Angiogenese, Neurogenese und neuronale Migration sind jedoch gleichzeitigen Veranstaltungen in Größenordnungen robuster im embryonalen Gehirn auftreten als in der normalen erwachsenen Gehirn. Die periventrikulärer Gefäßnetz des embryonic Vorderhirn (Telencephalon) stammt von einem Schiff in den Basalganglien Primordium gelegen und entwickelt sich in Form einer geordneten Gradienten von ventral Telen von embryonalen Tag 11 (E11) 4,5 dorsal. Dieses Geflecht von Schiffen der periventrikulären Gefäßnetz unterscheiden sich von Pia-Gefäße basierend auf Herkunft, anatomische Lage, Wachstumsmuster und Entwicklungsregulation 4,5. Die Ausbreitungsrichtung der periventrikulären Angiogenese Steigung entspricht der neurogenetischen Quer telencephalic Steigung. Innerhalb der Telen, die periventrikuläre Angiogenese Steigung und das Gefälle der GABA-Neuronen Migration tangential überlappt räumlich als auch 6. In Bezug auf Timing, ist die Angiogenese Gradienten im Vorfeld der neurogenetischen Gradienten-und GABA-Neuronen Gradienten von etwa einem Tag. So sind periventrikuläre Endothelzellen räumlich und zeitlich gut positioniert, um kritische Hinweise liefern, um telencephalic Neurogenese zu unterstützen undneuronalen Migration 4,6. Daher würde die Verwendung von embryonalen periventrikulärer Endothelzellen in Kokultur Experimente mit neuronalen Vorläuferzellen und / oder Neuronen eines günstigeren Modell zum Studium der Wechselwirkungen neurovaskuläre und Entwicklung neuer Wege für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen oder ischämischer / traumatische Gehirnverletzung ist.
Wir unterstreichen die Bedeutung der Entfernung der Pia-Membran, nicht nur um epithelialen Zellkontamination zu begrenzen, sondern auch auf Pia-Endothelzellen, die molekular und funktionell von Endothelzellen der Gefäßnetz periventrikulärer 4,6 (bezeichnet als PVECs von Pia-ECs zu unterscheiden) sind zu trennen . Hier beschreiben wir die Methode, die wir verwenden in unserem Labor routinemäßig, um einen reichen und Reinausbeute von PVECs erhalten. Diese Endothelzellen aus embryonalen Vorderhirn von einem Einzelzeit-schwangeren Maus isoliert vorbereitet. Sie können für die zukünftige Nutzung erweitert werden, subkultiviert und frorene erfolgreich.
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Protocol
1. Vorbereitung der Reagenzien und Lösungen
- Beschichtung von 35 mm Kulturschale: Kollagen Typ 1-Lösung wird als wässrige Lösung in 20 mM Essigsäure (~ 100 mg Protein / Röhrchen) zugeführt. Verdünnen Sie eine entsprechende Volumen der Kollagenlösung zu einer Arbeitskonzentration von 0,01% mit sterilen Gewebekultur-Wasser. Mantel Gerichte mit 1 ml Kollagenlösung für 3-4 Stunden bei Raumtemperatur (RT) oder 37 ° C oder über Nacht bei 2-8 ° C. Entfernen Sie überschüssige Lösung von der beschichtete Schale und lassen Sie es über Nacht trocknen. Spülen Sie die Schale mit Gewebekultur-Wasser oder PBS vor der Zugabe Medien. Beschichtete Platten können bei 4 ° C für einen Monat gelagert werden.
- Bereiten komplette Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium (DMEM). Ergänzen das DMEM (500 ml) mit 10% FBS und Antibiotika-Antimykotika-Lösung (1x Konzentration; 1 ml/100 ml). Komplettem DMEM bei 4 ° C für zwei Monate gelagert werden.
- Vorbereitung eines Aliquots (50 ml) DMEM mit DNase I (0,001 mg / ml) (als D bezeichnetMEM-DNase I).
- Vorbereitung weiteres Aliquot (10 ml) DMEM mit Kollagenase und Dispase (1 mg / ml) (als DMEM-collagenase/dispase bezeichnet).
- Vorbereitung Endothelzell-Kulturmedium (ECCM, 500 ml), mit EGF (5 &mgr; g) ergänzt, ECGS (100 mg) und 5 &mgr; l von Antibiotika-Antimykotika-Lösung. ECCM können bei 4 ° C für zwei Monate gelagert werden.
- Vorwärmen alle Medien vor dem Gebrauch.
- Vorbereitung Reinigungspuffer: PBS, pH 7,2 mit 0,5% BSA und 2 mM EDTA. Halten Puffer kalt (2-8 ° C).
2. Entfernung von Embryonen und Präparation der Telen
Alle Experimente mit Labortieren durch die Tierpflege und die Nutzung Ausschüsse des McLean-Krankenhaus zugelassen und entsprechen den NIH-Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren.
- Verwenden zeitlich schwanger CD1-Mäuse (embryonalen Tag 15). Der Tag der Vaginalpfropf Entdeckung gilt als embryonale Tag 0 (E0). CD1 Staudämme produzieren im Allgemeinen große Würfe, so 10-12 Embryos werden von einer schwangeren Damm erwartet.
- Für hysterotomy, betäuben trächtige Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (100 mg / kg) / Xylazin (5 mg / kg). Bei Mäusen ca. 20-30 g, liefern 0,3 ml einer 10 ml / kg Ketamin / Xylazin Anästhesielösung und sicherzustellen, dass Schmerzen und Leiden ist minimal, während die intraperitoneale Injektion des Narkosemittels. Verwenden Sie Handstütze für die Injektionen.
- Überprüfen tiefe Narkose durch Zehe Prise. Embryonen entfernen tief narkotisierten Mäusen. Köpfen jedem Embryo sofort nach der Entfernung von der Mutter. Legen Sie die embryonalen Köpfe in sterilen Petrischalen in eiskaltem PBS.
- Folgen Hysterektomie durch sofortige Euthanasie mit Narkosedosis (130 mg / kg Pentobarbital, ip), ein Verfahren zur Euthanasie, die im Einklang mit den Richtlinien für die AVMA Euthanasie von Tieren ist: 2013 Edition.
- Unter einem Stereomikroskop, entfernen Sie das Gehirn aus dem Kopf mit feinen Mikro Schere und feinen Pinzette. Hinweis: Eine hohe Qualität sezierenIonen ist wichtig, die Pia-Membran erfolgreich aus dem embryonalen Gehirn zu entfernen. Dies wird durch die Praxis erreicht. Feinen Pinzette und Schere Mikrospitze sind ebenfalls wichtige Werkzeuge für einen guten Präparation.
- Verwenden Sie die Pinzette, um einen festen Griff auf das Gehirn und die Mikro Schere bekommen abziehen der Pia-Membran. Entfernen Sie die Hirn und metencephalon und Isolierung des Telen. Übertragen Pia frei Telen von allen Embryonen auf eine 35 mm Kulturschale mit 2 ml PBS im Eis.
3. Zellisolierung
- Mince das Telen in 1-2 mm Fragmente mit einer Skalpellklinge und sammeln Gewebe in einem 15 ml Falcon-Röhrchen mit 2 ml komplettem DMEM.
- Distanzieren Gewebe vorsichtig, aber gründlich mit einer 1 ml-Pipette bis Klumpen verschwinden und eine milchige Suspension erreicht.
- Zentrifuge dissoziierte Zellen bei 800-1.000 x g für 5 min bei RT.
- Den Überstand und Pellet erneut in DMEM-DNase I. vorsichtig entfernen Sie vorsichtig distanzieren die cells erneut mit 1 ml Pipette und Zentrifuge bei 800-1.000 x g für 5 min bei RT.
- Das Pellet in warmen kompletten DMEM. Filterzellen durch ein steriles 70 um Nylon-Mesh. Sammeln gefiltert Zellen und halten im Eis.
- Sammle die Zellen-Bereiche auf dem Sieb zurückgehalten und zu verdauen ferner mit DMEM-collagenase/dispase (2 ml) für 1-2 min bei RT. Waschen der Zellen 3x in DMEM-DNase durch Zentrifugation bei 800-1000 x g für 5 min bei RT. Bündeln diese Zellen mit dem filtrierten Zellen in Schritt 3.5 gesammelt. Waschen Gesamt Zellen einmal mit komplettem DMEM. Gehen Sie auf die Zellzahl und magnetischen Markierungsschritte bestimmen. Hinweis: Es ist wichtig, um eine Einzelzellsuspension vor der magnetischen Markierung zu erhalten.
4. Magnetische Beschriftungs
- Dieses Protokoll zeigt die magnetische Kennzeichnung 10 7 Zellen. Für Zellzahlen von weniger als 10 7, das gleiche Volumen und Reagenz für Zellzahlen von mehr als 10 7, Scale-up alle Reagenzienvolumina und Gesamtvoluminaentsprechend (zB für 2 x 10 7 Zellen insgesamt, verwenden Sie zweimal die Lautstärke aller angegebenen Reagenzien). Halten Sie alle Reagenzien und Zellen im Eis.
- Bestimmen der Zellzahl mit einer Zählkammer.
- Zentrifuge Zellsuspension bei 300 × g für 10 min bei RT. Absaugen des Überstandes.
- Hinzufügen 90 μl/10 7 Zellen Reinigungspuffer zu dem Zellpellet, gefolgt von 10 ul CD31-MicroBeads. Die vom Hersteller bereitgestellten Mikroperlen sind konjugierte monoklonale anti-Maus-CD31-Antikörpers.
- Gut mischen und die Proben für 15 min in den Kühlschrank stellen. Hinweis: Höhere Temperaturen und / oder längere Inkubationszeit während magnetische Markierung kann unspezifische Bindung führen.
- Waschen der Zellen durch Zugabe von 1-2 ml/10 7-Zellen der Reinigung Puffer und Zentrifuge bei 300 g für 10 min. Überstand entfernen und resuspendieren Zellen in 500 &mgr; l Reinigungspuffer. Gehen Sie zur magnetischen Trennung oder Reinigungsschritt.
5. Purification
- Platzieren MS Säule in das Magnetfeld des MACS Separator.
- Spülen Säule mit 500 ul Reinigungspuffer.
- Gelten Zellsuspension auf die Säule. Legen entsprechende Anzahl von Zellen in MS-Spalte als höhere Zellzahl kann die Spalte verstopfen. Achtung: Jeder MS-Spalte kann eine maximale Anzahl von 2 x 10 7 Zellen, für eine höhere Zellzahl aufnehmen, verwenden Sie mehr Spalten.
- Sammeln und entsorgen Durchfluss unmarkierten Zellen enthält.
- Mit 500 ul Reinigungspuffer dreimal waschen Spalte. Während der Waschschritte, stellen Sie sicher, dass die Spalte Behälter leer ist, bevor die anschließende Reinigung Puffer Aliquots.
- Entfernen Spalte aus der MACS-Separator und legen Sie es auf einem 15 ml Falcon-Röhrchen.
- Ein Kolben ist mit dem MS-Säule zugeführt. Je 1 ml Reinigungspuffer auf die Säule MS und sofort spülen die magnetisch markierten Zellen durch festes Drücken Sie den Kolben in die Spalte.
- Teller cells auf einer 35 mm Kulturschale mit Kollagen Typ 1 schwemmt und wachsen Zellen in ECCM in einem Inkubator auf 37 ° C mit 95% O 2 und 5% CO 2 eingestellt.
- Ändern Sie das Medium alle vier Tage. Verwenden PVECs für Experimente oder Subkultur nach 10-12 Tagen, wenn der Teller ist konfluent.
6. Subkultur von PV-ECS
- Entfernen Sie die ECCM und spülen Sie die Monolage von PVECS mit 1-2 ml sterilem PBS.
- Sanft fügen 1,5 ml 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung, um die Zellschicht zu bedecken.
- Gibt die Schale in den Inkubator. Innerhalb von 5-7 Minuten, werden die Zellen von der Oberfläche der Schale zu lösen.
- Nachdem die Zellen abgelöst, sofort das gleiche Volumen von Trypsin-Inhibitor und verreiben mehrmals.
- Übertragen der Zellen in ein steriles 15 ml Falcon-Röhrchen. Das Röhrchen bei 500 xg für 5 min.
- Entfernen Sie den Überstand und das Pellet in 1 ml vorgewärmten ECCM.
- Samen, die Zellen für den Ausbau der Kultur, imAlterung oder andere Tests.
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Representative Results
Die phänotypische Charakterisierung von PVECs von Tag 1-12 wird durch Phasenkontrast-Lichtmikroskopie (Abbildung 2) gezeigt. Die Zellen in die Schale am Tag 1 zeigen charakteristische Morphologie der Zellteilung (2A) befestigt. Zwischen 5-8 Tage, PVECs Übergang von Kopfstein typisch für Endothelzellen und eher an seine in vivo-Zustand (2B und 2C) förmige Morphologie an der Spindel. Am Tag 12 der Kultur erreicht PVEC volle Zusammenfluss (2D). PVECs leicht subkultiviert, um die Kolonie (2E-G) zu erweitern. Reinheit der endothelialen Zellkulturen wurde mit Endothelzellmarker etabliert - Isolectin B4, CD-31/PECAM-1, Von-Willebrand-Faktor (vWF) und VE-Cadherin und war entschlossen, zu hundert Prozent nach Subkultur (Abbildungen 2H-K) sein.
Hohe Vergrößerung Bilder PVECs von CD1 Embryonen sowie vorbereitet Krawatte2-GFP-Embryonen 4 (deren Endothelzellen exprimieren GFP) gezeigt (Fig. 3). Neben der gemeinsamen gepflasterten und spindelförmige Morphologie (Fig. 3A-C) wurden polygonale Morphologie mit schlanken Prozessen auch beobachtet isolectin B4-markierte und Tie2-GFP + ve PVECs (Fig. 3D und 3E). In einigen unserer Kollagen beschichteten Kulturschalen (in Abwesenheit von Matrigel) gebildet PVECs Gittermuster ähnelt die einzigartige Eigenschaft des in vivo periventrikulärer Gefäßnetz (Fig. 3F). Dies spiegelt die hohe angiogene Potential von PVECs. Ein Angiogenese-Assay wurde durchgeführt, in dem PVECs (2 × 10 4 Zellen) wurden in Kulturschalen mit Matrigel-Matrix beschichtet sind. PVECs zeigte robuste Schlauchbildung innerhalb von 18 h (Abb. 3G). Diese Ergebnisse liefern starke Beweise dafür, dass dieses System als ein in vitro endotheliale Zellmodell verwendet werden. PVECs isoliertvon CD1 Embryonen können schnell mit Qdot Nanokristalle (Abbildung 3H), die intensive stabile Fluoreszenz liefern in das Zytoplasma lebender Zellen und kann für Langzeitstudien von Live PVECs, einschließlich Migration, Motilität, Morphologie, Zellfunktionstests wie verwendet werden dürfen sowie in vivo-Experimenten. PVECs können mit Zell Tracer wie Zelle Light Plasmamembran-RFP, BacMam 2.0 (3I) nach Anweisungen des Herstellers für klare Visualisierung der Zellmorphologie im Live Cell Imaging Experimente transfiziert werden.
Man kultiviert PVECs nicht nur in ECCM, sondern auch im Rattenhirn endothelialen Zellwachstumsmedium (RBECGM) und DMEM-F12-Medium. Beide Phasenkontrast (4A, 4C und 4E) und isolectin B4 markierten Bilder (4B, 4D und 4F) von PVECs in ECCM kultiviert (4A und 4B), RBECGM (4C und
Fig. 1 ist. Schematische Darstellung der PVEC Isolation. Die für die Isolierung und p verwendete Protokollurification von PVECs von der embryonalen Telen wird in einem Schema zusammengefasst. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
2. Die phänotypische Charakterisierung von PVECs. (AG) Phasenkontrastbilder von PVEC Kultur zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Beschichtung. (A) PVEC Kultur am Tag ein. Die Zellen wurden angebracht und zeigen Division Morphologien. (B) PVEC Kultur am Tag 5 und (C) am Tag 8 Übergang von Kopfsteinpflaster, die Form Morphologie Spindel. (D) PVEC Kultur erreicht Einmündung am 12. Tag. (E) PVECs nach Subkultur am Tag 1 (F) Tag 5 (G (HJ) Immunmarkierung von PVECs Verwendung Endothelzellmarkern: Isolectin B4 (H), von Willebrand-Faktor (I), CD31/PECAM (J) und VE-Cadherin (K). Maßstabsbalken: A, 100 um (gilt BJ), K 50 um. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
3. Morphologien der PVECs. (AE) Hohe Vergrößerung Bilder isolectin B4-markierten und Tie2-GFP + ve PVECs Kopfsteinpflaster und zeigt spindelförmige Morphologie (AC) als auch polygonale Morphologie mit langen schlanken Erweiterungen (D, E). (<strong> F) PVECs zeigen eine hohe angiogene Potenzial im Kulturschale auch in Abwesenheit von Matrigel. (G) PVECs zeigen robuste Schlauchbildung in einem Angiogenese-Assay auf Matrigel. (H) mit PVECs Qdot Nanokristallen markiert. (I) mit PVECs Zelle Light Plasmamembran-RFP, BacMam 2.0 transfiziert. Maßstabsbalken: A, 50 um, B, 15 um (gilt CE), F, 100 um (gilt G, H), I, 50 um. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
4. PVECs in verschiedenen Kulturmedien zeigen Variante Morphologie gewachsen. (
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Discussion
PVEC sind mehr als physiologisch relevanten erwachsenen Gehirn Endothelzellen und ECs von anderen Gewebequellen für Studien, die sich auf neurovaskulären Interaktionen und auch therapeutisches Potenzial. Für PVEC Vorbereitung ist es wichtig, zu Beginn mit Dissektion um schneller zu arbeiten, um eine gute Rentabilität zu erreichen, da tote Zellen unspezifisch an CD31 MicroBeads binden. Darüber hinaus, wenn Einzelzellsuspension wird nicht vor der magnetischen Markierungsschritt erreicht, wird diese bei der Fehlersuche führen, da Zellklumpen aus der Säule zu verstopfen. Ein Vorteil dieses Verfahrens ist, dass es keine Notwendigkeit für die Inkubation mit Trypsin, um Zellen aus magnetischen Kügelchen zu lösen, eine zeitraubenden und oftmals schwierigen Schritt bei anderen Magnetkügelchen-Trennverfahren basierend auf EG Zubereitungen 4,7 verwendet. Darüber hinaus bedeutet das Isolationstechnik keine großen Mengen von embryonalen Hirngewebe. PVEC ist konsistent mit der Verwendung eines Einzelzeit schwangere Maus in ca. vorbereitet werdenoximately 12 Tage, subkultiviert und in einer Vielzahl von in vitro-und in vivo-Experimenten verwendet.
Die Reinheit des PVECs nach Isolierung über 90%, aber die Reinheit der PVECs nach Subkultur ist 100%. Zusätzlich zu Endothelzellen ist PECAM-1 auf der Oberfläche von Monozyten / Makrophagen gefunden. Mikrogliazellen, die Makrophagenpopulation des ZNS jedoch im embryonalen Gehirn der Maus sehr niedrig im Vergleich zu postnatale oder adulte Gehirn 8. Monozyten / Mikroglia brauchen Medium mit 10% fötalem Kälberserum und spezifische Wachstumsfaktoren zu wachsen ergänzt, sie werden sich schließlich in ECCM sterben und werden nicht nach der Subkultur der PVECs dauern. Wenn 100% rein PVECs werden sofort nach der Isolierung (zum Beispiel, um die Genexpression zu testen) erforderlich ist, verwenden wir Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS)-Methode. PVECs werden dann von Tie2GFP Embryonen isoliert (in der nur Endothelzellen exprimieren GFP) und stringent durch duale FACS-Analyse sortiert. Die Reinheit der sortierten Endothelienl Zellen werden durch Ansammlung von Zellen gewährleistet, die doppelt positiv für GFP und CD31/PECAM-1 6 sind.
Kulturen sind auch eng in der ersten Woche der Trennung für verunreinigenden Zelltypen wie Perizyten beobachtet. Da pericyte Zellen unregelmäßig geformt und wird nie eine konfluente Monoschicht im Gegensatz zu Endothelzellen, die von spindelförmigen oder polygonalen, kontaktierten Zellen, die als Kolonien wachsen zu bilden, bestehen, sind sie leicht zu erkennen, falls vorhanden. Wenn pericyte Kontamination festgestellt wird, folgte eine geringere Konzentration von Trypsin (0,05%) mit einem Schnellverfahren Trypsinierung (2-3 min) ist für die Subkultur der PVECs verwendet. Perizyten, ist ein erweiterter Trypsinierung Zeit (7-10 min) und bleibt angebracht. Darüber hinaus ist die Effizienz der Plattierung trypsiniert Perizyten (wenn überhaupt) sehr schlecht. Diese Schritte beseitigen pericyte Kontamination und gewährleisten, dass subkultivierten PVECs rein sind.
Die ECCM Medium ist ein niedriger Serum-Medium enthält Hydrocortison,Heparin und 2% fetales Rinderserum und mit Epidermal Growth Factor (EGF) und Endothelzellen-Wachstumsergänzung (ECGS) ergänzt. PVECs in ECCM gewachsen zeigte Spindelform Morphologie konsequent. Die Rattenhirn ostmdt enthält 10% fötales Rinderserum, Wachstumsfaktoren und VEGF. PVECs in diesem Medium gezüchtet haben sehr länglichen Morphologien und länger dauern, bis Konfluenz zu erreichen. Das DMEM-F12-Medium mit 10% fötalem Rinderserum, Glutamax und Endothelzellen-Wachstumsergänzungsmittel ergänzt und weitere Proliferation induziert als in anderen Medien. Obwohl PVECs in dieser Medien gewachsen zeigte sehr schnelles Wachstum und Konfluenz erreicht innerhalb von 4 Tagen, waren ihre Morphologien flach oder nur polygonal. Wir haben PVECs in ECCM für bis zu drei Passagen gezüchtet ohne Verlust des Phänotyps und der Funktion. Daher ist ECCM das Medium, das wir lieber für PVEC Kultur.
PVECs mit neuronalen Vorläufer dieses Protokoll kokultiviert wahrscheinlich Neurogenese und neuronale Migration zu stimulieren far-größere Ausmaße als Endothelzellen aus erwachsenen Gehirn oder von anderen Quellen und wertvolle Unterstützung für Wiederherstellung der neurologischen Funktion bei Schlaganfall, Schädel-Hirn-Verletzungen oder Neurodegeneration sein. Neuronalen Vorläuferzellen im erwachsenen Gehirn transplantiert wurde oft berichtet, Stall und nicht in Regionen, die neue Nervenzellen benötigen migrieren. Dieses Problem wird auf die Abwesenheit von Substraten, wie neuronale Migration radialen Gliazellen Führungen 9 zu erleichtern berücksichtigt. Gefäß wird zunehmend als Substrate für die neuronale Migration 6,10,11 geschätzt. PVECs eine Lösung für diese neuronalen installiert Vorstufen bei Transplantation Sites bieten. Coimplantation von PVECs und Neuronen in den Hirnregionen, kann geführte Wanderung von Neuronen durch endotheliale Zellen zu erleichtern und dazu beitragen, funktionelle Erholung. Die enge Verbindung der Endothelzellen bei der Migration Neuronen macht sie auch einzigartig geeignet, um Wachstumsfaktoren und Morphogenen direkt und selektiv in liefernMigration von Neuronen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression (NARSAD) Young Investigator Award und National Institutes of Health gewähren R01NS073635 AV unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNase I | Sigma | D-4527 | |
| Collagen, Type 1 solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| DPBS | Quality Biologicals | 114057-131 | |
| EDTA | Fisher Scientific | M4055 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| MS column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| CD31 microbeads | Miltenyi Biotech | 130-097-418 | |
| MACS separator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Bioscience | 352350 | |
| Antibiotic and antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| 35 mm Culture dish | BD Bioscience | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352097 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352098 | |
| ECCM kit | BD Bioscience | 355054 | Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF, and Soybean Trypsin Inhibitor |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Bioscience | 354006 | |
| RBECGM | Cell Applications | R819-500 | |
| DMEM F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 305050-061 | |
| Tissue culture grade water | Life Technologies | 15230162 | |
| 0.25% Trypsin | Life Technologies | 15050 | |
| Soybean trypsin inhibitor | BD Bioscience | 5425 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Life Technologies | Q25021 | |
| CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0 | Life Technologies | C10608 | |
| Biotinylated Isolectin B4 antibody | Sigma | L2140 | |
| Anti-Von Willebrand factor | Sigma | F3520 | |
| Anti-CD31/PECAM-1 | BD Pharmingen | 550274 | |
| VECTASHIELD Hardset Mounting Media with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Ketamine | Butler Schein Animal Health Supply | 44028 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 1009 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Inverted microscope | Olympus CK-40 | CK-40 | |
| Fluorescent microscope | Olympus FSX-100 | FSX-100 | |
| Fine forceps | Roboz Surgical Instrument | 7 inox | |
| Fine microtip scissors | Roboz Surgical Instrument | RS5611 |
References
- Shen, Q., S, G., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
- Milner, R. A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system. BMC Neurosci. 8, 3 (2007).
- Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo. 19, 1469-1485 (2008).
- Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).
- Vasudevan, A., Bhide, P. G. Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale. Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).
- Won, C. K., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).
- Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).
- Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One. 6, (2011).
- Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain. 2, 461-466 (1999).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
