Summary
וידאו זה מדגים אסטרטגיה קלה ואמינה להכנת תרבויות טהורות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי העוברי בתוך 10-12 ימים ויהיה שימושי עבור מחקר התמקד בהיבטים רבים של אנגיוגנזה מוחין.
Abstract
תאי האנדותל המוח עובריים יכולים לשמש ככלי חשוב במחקר של אנגיוגנזה ופיתוח neurovascular ואינטראקציות. שתי רשתות כלי הדם של המוח הקדמי העוברי, pial וperiventricular, הן במרחב ייחודיים ויש להם מקורות שונים ודפוסי צמיחה. יש תאי אנדותל מרשתות כלי דם pial וperiventricular פרופילים ייחודיים ביטוי גנים ופונקציות. כאן אנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד לבידוד, תרבות, ואימות של אוכלוסיות טהורות של תאי האנדותל מרשת periventricular כלי הדם (PVECs) של המוח הקדמי העוברי (telencephalon). בגישה זו, telencephalon נטולת קרום pial מתקבל מיום עוברי 15 עכברים טחונים, מעוכל עם collagenase / dispase, והתפזרה באופן מכאני לתוך השעיה תא בודדת. PVECs הם מטוהרים מהשעית תא באמצעות סלקציה חיובית עם נוגדן anti-CD-31/PECAM-1 מצומדת לmicrobeads באמצעות חזק מגנטישיטת הפרדה. תאים מטוהרים בתרבית על קולגן 1 מנות תרבות מצופים במדיום תרבית תאי האנדותל עד שהם הופכים ומחוברות וsubcultured נוסף. PVECs שהושג עם מרוצף זה פרוטוקול תערוכה ופנוטיפים ציר בצורה, כפי שדמיין ידי מיקרוסקופ אור שלב בניגוד ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. טוהר של תרבויות PVEC הוקם עם סמני תא האנדותל. בידיים שלנו, שיטה זו אמינה ועקבי תשואות אוכלוסיות טהורות של PVECs. פרוטוקול זה יהיה לטובת מחקרים שמטרתם להשיג תובנות מכניסטית לאנגיוגנזה המוח הקדמי, הבנת אינטראקציות PVEC, ושיחות צולבות עם סוגים עצביים תא ובעל פוטנציאל אדיר לאנגיוגנזה הטיפולית.
Introduction
אנגיוגנזה, נוירוגנזה ונדידת נוירונים הן אירועים קריטיים במערכת עצבים מרכזית (CNS) פיתוח, תיקון והתחדשות. מספר מחקרים אלגנטיים הראו כי תאי האנדותל לעורר התפשטות עצבית ולהיפך באמצעות שחרורם של גורמים מסיסים ועל ידי מגע ישיר. מצאנו את זה מוזר, כי ברוב המחקרים הללו 1-3, ואילו אבות עצביים / תאי גזע עצביים מבודדים מהמוח העוברי, הם cocultured עם תאי אנדותל מהמוח הבוגר, מקורות רקמות מבוגרים אחרים, או עם שורות תאי האנדותל. זה עשוי בחלקו להיות בשל הקשיים הטכניים הקשורים לבידוד וculturing אוכלוסיות טהורות של תאי האנדותל מהמוח העוברי. עם זאת, אנגיוגנזה, נוירוגנזה, ונדידת נוירונים הן אירועים מקבילים המתרחשים בסדרי גודל חזק יותר במוח העוברי מאשר במוח המבוגר הנורמלי. רשת כלי דם periventricular של embryoniמוח קדמי ג (telencephalon) מקורו בכלי הממוקם בתוך primordium הגרעינים הבזליים ומתפתח בצורת הדרגתית מסודר מגחון להגבה telencephalon ידי היום עוברי 11 (E11) 4,5. מקלעת זו של כלי שיט של רשת כלי דם periventricular נבדלת כלי pial מבוסס על מקורות, מיקום האנטומי, דפוסי צמיחה, ורגולציה התפתחותית 4,5. הכיוון של התפשטות של שיפוע אנגיוגנזה periventricular תואם את שיפוע neurogenetic הרוחבי telencephalic. בתוך telencephalon, שיפוע אנגיוגנזה periventricular והשיפוע של נוירונים GABA הנודדים בעקיפין חופף מרחבית, כמו גם 6. עם כל כבוד לעיתוי, שיפוע אנגיוגנזה הוא מראש של שיפוע השיפוע ונוירון GABA neurogenetic ידי על יום. לכן, תאי האנדותל periventricular הם מרחב ובזמן בעמדה טובה כדי לספק רמזים קריטיים לתמוך נוירוגנזה telencephalic ו4,6 נדידת נוירונים. לכן, שימוש בתאי אנדותל periventricular עובריים בניסויי coculture עם אבות ו / או נוירונים עצביים יספק מודל חיובי יותר ללימוד אינטראקציות עצבים וכלי דם ובפיתוח אפיקים חדשים לטיפול במחלות ניווניות או פגיעה המוחית איסכמי / טראומטית.
אנו מדגישים את החשיבות של הסרת קרום pial, לא רק כדי להגביל את זיהום תאי אפיתל, אלא גם כדי להפריד בין תאי האנדותל pial אשר מולקולריים ומובחנים מבחינה פונקציונלית מתאי האנדותל של הרשת periventricular כלי דם 4,6 (PVECs מכונה להבדיל מECs pial) . כאן, אנו מתארים את השיטה שאנו משתמשים באופן שיגרתי במעבדה שלנו כדי להשיג תשואה עשירה וטהורה של PVECs. תאי האנדותל אלה הוכנו מforebrains העוברי בודד מעכבר מתוזמן בהריון אחד. הם יכולים להיות מורחבים, subcultured, וקפוא למטה בהצלחה לשימוש עתידי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת ריאגנטים ופתרונות
- ציפוי של צלחת תרבות 35 מ"מ: פתרון סוג קולגן 1 מסופק כתמיסה מימית ב20 מ"מ חומצה אצטית (~ 100 חלבון מ"ג / בקבוקון). לדלל נפח מתאים של תמיסת קולגן לריכוז עבודה של 0.01% משימוש במים בכיתה רקמת סטרילית תרבות. מנות מעילים עם 1 מיליליטר של תמיסת קולגן ל3-4 שעות בטמפרטורת חדר (RT) או 37 מעלות צלזיוס, או הלילה ב 2-8 ° C. הסר פתרון עודף מהצלחת המצופה ולאפשר לו להתייבש במשך הלילה. יש לשטוף את הצלחת עם מים כיתה תרבית רקמה או PBS לפני הוספת מדיה. ניתן לאחסן כלים מצופים על 4 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד.
- הכן הנשר בינוני של Dulbecco המלא השתנה (DMEM). מוסף DMEM (500 מיליליטר) עם FBS 10% ופתרון האנטיביוטיקה antimycotic (ריכוז 1x; 1 ml/100 מיליליטר). ניתן לאחסן DMEM המלא על 4 מעלות צלזיוס במשך חודשים.
- הכן aliquot (50 מיליליטר) של DMEM עם DNase אני (0.001 מ"ג / מיליליטר), (המכונה DMEM-DNase אני).
- הכן aliquot אחר (10 מיליליטר) של DMEM עם collagenase וdispase (1 מ"ג / מיליליטר) (המכונה DMEM-collagenase/dispase).
- הכן תא האנדותל תרבות בינונית (ECCM 500 מיליליטר), בתוספת EGF (5 מיקרוגרם), ECGs (100 מ"ג) ו -5 μl של פתרון האנטיביוטיקה antimycotic. ניתן לאחסן ECCM על 4 מעלות צלזיוס במשך חודשים.
- Prewarm כל אמצעי התקשורת לפני השימוש.
- הכן את חיץ טיהור: PBS, pH 7.2 עם BSA 0.5% ו2 מ"מ EDTA. שמור על חיץ קר (2-8 ° C).
2. ההסרה של עוברים וDissection של telencephalon
כל הניסויים באמצעות חיות מעבדה מאושרים על ידי ועדות טיפול בבעלי חיים ושימוש בבית החולים מקלין ותואמים את הנחיות NIH לטיפול ושימוש בבעלי החיים במעבדה.
- השתמש בעכברים בעיתוי הריון CD1 (יום עוברי 15). היום של גילוי תוסף נרתיק נחשב יום עוברי 0 (E0). סכרי CD1 בדרך כלל מייצרים המלטות גדולות, ולכן 10-12 עוברים צפוי מסכר בהריון.
- לhysterotomy, להרדים עכברים בהריון עם זריקת intraperitoneal של קטמין / Xylazine (5 מ"ג / קילוגרם) (100 מ"ג / קילוגרם). לעכברים כ 20-30 גרם, לספק 0.3 מיליליטר של חומר הרדמה 10 מיליליטר / קילוגרם קטמין / Xylazine ולהבטיח שכאב והמצוקה היא מינימאלית במהלך זריקות intraperitoneal של חומר ההרדמה. השתמש ביד איפוק לזריקות.
- בדוק הרדמה עמוקה על ידי קמצוץ הבוהן. הסר את העוברים מעכברים בהרדמה עמוקה. לערוף כל עובר מייד עם ההסרה מהאם. מניחים את הראשים העובריים בצלחות פטרי סטרילית בקרח הקר PBS.
- עקוב כריתת רחם על ידי המתת חסד מיידית עם מנת יתר של חומר הרדמה (130 מ"ג / pentobarbital קילוגרם, ה-IP), שיטה להמתת חסד, אשר עולה בקנה אחד עם הנחיות AVMA להמתת החסד של בעלי חיים: 2013 Edition.
- תחת מיקרוסקופ סטריאו, להסיר את המוח מהראש במספריים microtip בסדר ומלקחיים בסדר. הערה: לנתח באיכות גבוההיון הוא חיוני כדי להסיר בהצלחה את קרום pial מהמוח העוברי. זו מושגת על ידי תרגול. מלקחיים בסדר ומספריים microtip גם כלים מרכזיים להשגת נתיחה טובה.
- השתמש במלקחיים כדי לקבל אחיזה איתנה על המוח ומספרי microtip לקלף את קרום pial. הסר את mesencephalon וmetencephalon ולבודד את telencephalon. העבר telencephalon pial נטול מכל העוברים למנת תרבות 35 מ"מ עם 2 מיליליטר PBS בקרח.
3. בידוד תא
- ברר בtelencephalon ל1-2 ברי מ"מ עם להב סכין מנתחים ולאסוף רקמה בצינור פלקון 15 מיליליטר המכיל 2 מיליליטר של DMEM המלא.
- לנתק את הרקמה בעדינות אך ביסודיות עם טפטפת מיליליטר 1 עד גושים נעלמים והשעיה חלבית מושגת.
- צנטריפוגה תאים ניתקה ב800-1,000 XG במשך 5 דקות ב RT.
- להסיר את supernatant וגלול resuspend ב DMEM-DNase I. בזהירות בעדינות לנתק את ceLLS שוב באמצעות פיפטה 1 מיליליטר ו צנטריפוגות ב XG 800-1,000 במשך 5 דקות ב RT.
- Resuspend את הכדור בDMEM המלא החם. תאי סינון דרך רשת ניילון 70 מיקרומטר סטרילי. איסוף תאים מסוננים ולשמור על קרח.
- לאסוף את תא החלקים נשמרו ברשת ולעכל נוסף עם DMEM-collagenase/dispase (2 מיליליטר) ל1-2 דקות ב RT. לשטוף 3x תאי DMEM-DNase אני באמצעות צנטריפוגה ב800-1,000 XG במשך 5 דקות ב RT. בריכת תאים אלה עם התאים המסוננים שנאספו בשלב 3.5. שטוף תאים בסך הכל פעם אחת עם DMEM מלא. המשך כדי לקבוע מספר תא וצעדי תיוג מגנטיים. הערה: חשוב לקבל השעיה תא בודד לפני תיוג מגנטי.
4. תיוג מגנטי
- פרוטוקול זה מראה את התיוג המגנטי של 10 7 תאים. למספרים סלולריים נמוך מ10 7, להשתמש באותו נפח ומגיבים למספרים סלולריים גדול מ10 7, בהיקף של עד כל הכרכים מגיב וכרכים בסך הכלבהתאם (למשל עבור 2 x 10 7 תאים בסך הכל, השתמש פעמיים בנפח של כל ריאגנטים מצויינים). שמור את כל חומרים כימיים ותאים בקרח.
- לקבוע את מספר סלולרי עם hemocytometer.
- צנטריפוגה השעיה תא XG 300 10 דקות ב RT. לשאוב supernatant לחלוטין.
- הוספת 90 μl/10 7 תאים של חיץ טיהור לתא גלולה ואחרי 10 μl של microbeads CD31. Microbeads המסופק על ידי יצרן הם מצומדת לmonoclonal נוגדן CD31 אנטי עכבר.
- מערבבים היטב דגירה במשך 15 דקות במקרר. הערה: בטמפרטורות גבוהות ו / או זמן דגירה ארוך יותר בתיוג מגנטי עלולות לגרום ספציפי מחייב.
- שטוף תאים על ידי הוספת 1-2 ml/10 7 תאים של חיץ טיהור ו צנטריפוגות XG 300 10 דקות. הסרת תאי supernatant ו resuspend ב 500 μl של חיץ טיהור. המשך להפרדה מגנטית או צעד טיהור.
5. פוrification
- מקום עמודת MS בשדה המגנטי של MACS מפריד.
- יש לשטוף את העמודה עם 500 μl של חיץ טיהור.
- החל השעיה תא על הטור. טען מספר המתאים של תאים לעמודת MS כמספר תאים גבוהים יותר עשוי לסתום את העמודה. זהירות: כל עמודת MS יכול להכיל מספר מרבי של 2 x 10 7 תאים, למספר תא גבוה יותר, להשתמש יותר עמודות.
- איסוף וזורקים זרימת דרך המכילה תאים ללא תווית.
- לשטוף טור עם 500 μl של חיץ טיהור שלוש פעמים. במהלך שלבים לשטוף, לוודא כי מאגר העמודה ריק לפני הוספת aliquots חיץ טיהור שלאחר מכן.
- הסר את העמודה ממפריד MACS ולמקם אותו על צינור פלקון 15 מיליליטר.
- בוכנה מסופקת יחד עם עמודת הטרשת הנפוצה. פיפטה 1 מיליליטר של חיץ טיהור על טור MS ומייד לשטוף את התאים שכותרתו מגנטית על ידי תקיפות דוחפים את הבוכנה לתוך הטור.
- cel פלייטls על צלחת תרבות 35 מ"מ precoated עם סוג קולגן 1 ולגדל תאים בECCM בחממה מוגדרת 37 ° C עם 95% O 2 ו 5% CO 2.
- לשנות את המדיום כל ארבעה ימים. השתמש PVECs לניסויים או תת לאחר 10-12 ימים כאשר המנה היא מחוברת.
6. תת של PV ECS
- הסר את ECCM ולשטוף monolayer של PVECS עם 1-2 מיליליטר של PBS סטרילית.
- בעדינות להוסיף 1.5 מיליליטר של 0.25% פתרון טריפסין-EDTA כדי לכסות את monolayer התא.
- להחזיר את הצלחת אל האינקובטור. בתוך 5-7 דקות, תאים להתנתק מהמשטח של המנה.
- אחרי התאים יש מנותקים, מייד להוסיף נפח שווה של מעכבי טריפסין וtriturate מספר פעמים.
- להעביר את תאי צינור פלקון 15 מיליליטר סטרילי. צנטריפוגות הצינור ב XG 500 למשך 5 דקות.
- הסר את supernatant ו resuspend את הכדור ב 1 מיליליטר של ECCM prewarmed.
- זרעי התאים להרחבת התרבות, imהזדקנות או מבחני אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
האפיון פנוטיפי של PVECs מהיום 1-12 מוצג על ידי מיקרוסקופ אור שלב בניגוד (איור 2). התאים מחוברים לצלחת על מאפיין מורפולוגיה מופע יום 1 של חלוקת תא (איור 2 א). בין 5-8 ימים, מעבר PVECs מאבן חלוק לציר מורפולוגיה בצורה אופיינית לתאי האנדותל ודומים יותר למצבו בvivo (2B דמויות ו2C). ביום 12 תרבות PVEC משיגה מפגש מלא (איור 2 ד). ניתן subcultured PVECs קלות להרחיב את המושבה (איורים 2E-G). הטוהר של תרביות תאי אנדותל הוקם עם סמני תא האנדותל - isolectin B4, CD-31/PECAM-1, פון Willebrand פקטור (VWF) וVE-cadherin והיה נחוש להיות מאה אחוז לאחר תת (איורים 2H-K).
תמונות בהגדלה גבוהה של PVECs הוכנו מעוברי CD1 כמו גם עניבהעוברי 2-GFP 4 (תאי האנדותל שמבטאים GFP) מוצגים (איור 3). בנוסף למרוצף המשותפת ומורפולוגיה ציר בצורה (איורים 3A-C), מורפולוגיות מצולעים עם תהליכים רזים נצפו גם בisolectin וTie2-GFP + יש PVECs (3D דמויות ו3E) שכותרתו B4. בחלק ממנות תרבות קולגן המצופה שלנו (בהעדר Matrigel), PVECs נוצר דפוסי סריג דומים למאפיין הייחודי של in vivo periventricular רשת כלי הדם (איור 3F). זה משקף את פוטנציאל angiogenic הגבוה של PVECs. Assay אנגיוגנזה בוצע בי PVECs (2 x 10 4 תאים) נוספו מנות תרבות מצופים במטריצת Matrigel. PVECs הראה היווצרות צינור חזקה בתוך 18 שעה (איור 3G). תוצאות אלו מספקות ראיות חזקות כי מערכת זו יכולה לשמש כמודל במבחנה תא האנדותל. PVECs מבודדמעוברים CD1 יכול להיות מתויג במהירות עם nanocrystals Qdot (איור 3H) המספקים הקרינה יציבה אינטנסיבית לתוך הציטופלסמה של תאי חיים ויכולים לשמש למחקרים ארוך טווח של PVECs החי, כולל הגירה, תנועתיות, מורפולוגיה, מבחני תא פונקציה כמו גם בניסויי vivo. ניתן transfected PVECs עם קליעים נותבים תא כמו תא אור פלזמה ממברנה-RFP, BacMam 2.0 (איור 3I) לפי הוראות יצרן להדמיה ברורה של מורפולוגיה של תאים בניסויי הדמיה תא חיים.
אנחנו מתורבת PVECs לא רק בECCM, אלא גם במדיום עכברוש אנדותל מוח צמיחת תאים (RBECGM) ובינוני F12 DMEM. שניהם בניגוד השלב (איורים 4 א, 4C, ו4E) וB4 isolectin כותרת תמונות (4B דמויות, 4D, ו4F) של PVECs תרבית ECCM (איורים 4 א ו -4 ב), RBECGM (4C דמויות ו
איור 1. סכמטי של בידוד PVEC. הפרוטוקול המשמש לבידוד וpurification של PVECs מtelencephalon העוברית מסוכם לסכימה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. אפיון פנוטיפי של PVECs. (AG) בניגוד שלב תמונות של תרבות PVEC בנקודות זמן שונה לאחר ציפוי. () תרבות PVEC ביום 1. התאים מצורפים ולהראות מורפולוגיות החלוקה. (ב) תרבות PVEC ביום 5 ו (ג) ביום במעבר 8 ממרוצפים לציר מורפולוגיה צורה. (ד) PVEC תרבות השיגה נקודת המפגש ביום 12. (ה) לאחר תת PVECs ביום 1, היום (ו ') 5 (G (HJ) immunolabeling של PVECs באמצעות סמני תא האנדותל: isolectin B4 (H), פון Willebrand פקטור (I), CD31/PECAM (J) וVE-cadherin (K). סולם ברים:, 100 מיקרומטר (חל ב"ג), K, 50 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. מורפולוגיות של PVECs. (AE) תמונות בהגדלה גבוהה של isolectin וTie2-GFP + יש PVECs מראה מרוצף ומורפולוגיה ציר בצורה (AC), כמו גם מורפולוגיה מצולעים עם סיומות ארוכות ודקים (D, E) שכותרתו B4. (<PVECs strong> F) מראה פוטנציאל angiogenic גבוה בצלחת התרבות גם בהיעדר של Matrigel. PVECs (G) מראה היווצרות צינור חזקה בassay אנגיוגנזה על Matrigel. PVECs (H) שכותרתו עם nanocrystals Qdot. PVECs (I) transfected עם תא אור פלזמה ממברנה-RFP, BacMam 2.0. סולם ברים:, 50 מיקרומטר, B, 15 מיקרומטר (חל לספירה), F, 100 מיקרומטר (חל G, H), אני, 50 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 4. PVECs גדל במורפולוגיה גרסת מופע תרבות תקשורת שונה. (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PVEC של יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית מאשר תאי בוגרים מוח אנדותל וECs ממקורות רקמות אחרים ללימודים המתמקדים באינטראקציות עצבים וכלי דם וגם יש פוטנציאל טיפולי. להכנת PVEC, זה קריטי עם תחילת נתיחה כדי לעבוד מהר כדי להשיג את כדאיות טובה שכן תאים מתים עלולים להיקשר nonspecifically לmicrobeads CD31. בנוסף, אם ההשעיה תא בודד לא תושג לפני צעד התיוג המגנטי, זה יביא לפתרון בעיות שכן גושי תא יהיה לסתום את העמודה. יתרון של שיטה זו הוא שאין צורך בדגירה עם טריפסין לנתק את התאים מחרוזים מגנטיים, צעד זמן רב וקשה המשמש לעתים קרובות בשיטות אחרות מגנטיות מבוסס חרוז הפרדה להכנות EC 4,7. בנוסף, טכניקת הבידוד הזה אינה דורשת כמויות גדולות של רקמת מוח עוברית. ניתן להכין PVEC של עקביות עם השימוש בעכבר בהריון בעיתוי בודד בapproximately 12 ימים, subcultured, ולהשתמש במגוון רחב של במבחנה בניסויי vivo.
טוהר PVECs לאחר הבידוד הוא מעל 90% אבל טוהר PVECs לאחר תת 100%. בנוסף לתאי אנדותל, PECAM-1 נמצא על פני השטח של מונוציטים / מקרופאגים. מיקרוגליה, אוכלוסיית macrophage של מערכת העצבים המרכזית הוא אולם נמוך מאוד במוח העכבר העוברי בהשוואה לאחרי לידה או מוח בוגר 8. מונוציטים / מיקרוגליה צריכים בינוניים בתוספת 10% עוברי עגל בסרום וגורמי גדילה ספציפיים לגדול, הם יגוועו בסופו של דבר ECCM ולא יחזיקו מעמד אחרי תת של PVECs. כאשר PVECs הטהור 100% יש צורך מייד לאחר בידוד (לדוגמא, כדי לבדוק את ביטוי הגנים), אנו משתמשים בתא קרינה המופעל מיון שיטה (FACS). אז PVECs מבודדים מעוברי Tie2GFP (שבו רק תאי אנדותל להביע GFP) ומסודר בקפדנות על ידי ניתוח FACS כפול. טוהר endothelia הממויןתאי l מובטחים על ידי אוסף של תאים, כי הם חיוביים כפולים עבור ה-GFP וCD31/PECAM-1 6.
תרבויות גם הם נצפו מקרוב בשבוע של הבידוד הראשון לזיהום סוגי תאים כמו pericytes. מאחר ותאי pericyte סדירות הם בצורה ולא יהוו monolayer ומחוברות בניגוד לתאי האנדותל אשר מורכב של ציר בצורה או תאי מצולעים, פנו הגדלים כמושבות, הם קלים לזיהוי אם הוא קיים. אם זיהום pericyte מזוהה, ריכוז נמוך של טריפסין (0.05%) ואחריו הליך trypsinization מהיר (2-3 דק ') משמש לתת של PVECs. Pericytes דורש זמן ממושך trypsinization (7-10 דק ') ויישאר מחובר. בנוסף, יעילות ציפוי של pericytes trypsinized (אם בכלל) היא גרועה מאוד. צעדים אלה למנוע זיהום pericyte ולהבטיח כי PVECs subcultured הם טהורים.
בינוני ECCM הוא מדיום בסרום נמוך המכיל הידרוקורטיזון,הפרין ו -2% בסרום שור העובר והוא השלימו עם עוריות Growth Factor (EGF) ותוספת צמיחת תאי האנדותל (ECGs). PVECs גדל בECCM הראה מורפולוגיה ציר בצורה עקבית. ECGM מוח החולדה מכיל 10% בסרום שור עוברי, גורמי גדילה, וVEGF. יש לי PVECs גדל בתקשורת זה מורפולוגיות מאוד מוארכות וייקח זמן רב יותר כדי להשיג confluency. מדיום DMEM-F12 הוא תוספת 10% בסרום שור עוברי, Glutamax ותוספת צמיחת תאי אנדותל וזה גורם ליותר תפוצה מאשר אמצעי תקשורת אחרת. למרות PVECs גדל בתקשורת זה הראה צמיחה מהירה מאוד וconfluency שהושג ב4 ימים, המורפולוגיות שלהם היו שטוחות או מצולעים בלבד. יש לנו גדלו PVECs בECCM לתקופה של עד שלושה קטעים ללא הפסד של הפנוטיפ ותפקוד. לכן, ECCM הוא המדיום שאנחנו מעדיפים לתרבות PVEC.
PVECs cocultured עם מבשרים עצביים על ידי פרוטוקול זה, צפוי לעורר נוירוגנזה ונדידת נוירונים לfaהיקפים r-גדולים מתאי אנדותל ממוח בוגר או ממקורות אחרים ועשויים להיות בעל ערך לסיוע להתאוששות של תפקוד נוירולוגים בשבץ מוחי, פגיעה מוחית טראומטית או ניוון מוחיים. מבשרים עצביים המושתלים במוח הבוגר כבר דיווחו פעמים רבות לדוכן ולא מצליחים להעביר לאזורים שדורשים נוירונים חדשים. בעיה זו היוותה להיעדרות של מצעים המאפשרים העברה עצבית כמו מדריכי גליה רדיאלי 9. כלי דם הוא יותר ויותר מוערך כמו מצעים לנדידת נוירונים 6,10,11. PVECs עשויה להציע פתרון למבשרים עצביים נתקע אלה באתרי השתלה. Coimplantation של PVECs ונוירונים לאזורי מוח פגועים עשוי להקל על הגירה מודרכת של הנוירונים על ידי תאי האנדותל ולסייע בהשגת התאוששות תפקודית. הקשר ההדוק של תאי האנדותל עם נוירונים נודדים גם גורם להם מתאים באופן ייחודי כדי לספק גורמי גדילה וmorphogens ישירות ובאופן סלקטיבי לתוךנודד תאי עצב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי ברית לאומית לחקר סכיזופרניה ודיכאון (NARSAD) פרס חוקר צעיר ומכונים הלאומיים לבריאות מענק R01NS073635 לAV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNase I | Sigma | D-4527 | |
| Collagen, Type 1 solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| DPBS | Quality Biologicals | 114057-131 | |
| EDTA | Fisher Scientific | M4055 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| MS column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| CD31 microbeads | Miltenyi Biotech | 130-097-418 | |
| MACS separator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Bioscience | 352350 | |
| Antibiotic and antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| 35 mm Culture dish | BD Bioscience | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352097 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352098 | |
| ECCM kit | BD Bioscience | 355054 | Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF, and Soybean Trypsin Inhibitor |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Bioscience | 354006 | |
| RBECGM | Cell Applications | R819-500 | |
| DMEM F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 305050-061 | |
| Tissue culture grade water | Life Technologies | 15230162 | |
| 0.25% Trypsin | Life Technologies | 15050 | |
| Soybean trypsin inhibitor | BD Bioscience | 5425 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Life Technologies | Q25021 | |
| CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0 | Life Technologies | C10608 | |
| Biotinylated Isolectin B4 antibody | Sigma | L2140 | |
| Anti-Von Willebrand factor | Sigma | F3520 | |
| Anti-CD31/PECAM-1 | BD Pharmingen | 550274 | |
| VECTASHIELD Hardset Mounting Media with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Ketamine | Butler Schein Animal Health Supply | 44028 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 1009 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Inverted microscope | Olympus CK-40 | CK-40 | |
| Fluorescent microscope | Olympus FSX-100 | FSX-100 | |
| Fine forceps | Roboz Surgical Instrument | 7 inox | |
| Fine microtip scissors | Roboz Surgical Instrument | RS5611 |
References
- Shen, Q., S, G., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
- Milner, R. A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system. BMC Neurosci. 8, 3 (2007).
- Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo. 19, 1469-1485 (2008).
- Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).
- Vasudevan, A., Bhide, P. G. Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale. Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).
- Won, C. K., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).
- Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).
- Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One. 6, (2011).
- Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain. 2, 461-466 (1999).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
