Summary
このビデオでは、10〜12日以内に、胚前脳からの内皮細胞の純粋培養を調製するための簡単で信頼性の高い戦略を示し、脳血管新生のさまざまな側面に焦点を当てた研究のために有用であろう。
Abstract
胚の脳内皮細胞は、血管新生および神経血管の発達との相互作用の研究における重要なツールとして機能することができる。胚前脳、軟膜および脳室周囲の2血管網は、空間的に独特であり、異なる起源と成長パターンを持っている。軟膜および脳室周囲血管網からの内皮細胞は、固有の遺伝子発現プロフィールおよび機能を有している。ここでは、胚前脳（終脳）の脳室周囲血管網（PVECs）からの内皮細胞の純粋な集団の単離、文化、および検証のためのステップバイステップのプロトコルを提示する。このアプローチでは、胎齢15日のマウスから得た軟膜膜を欠く終脳は、みじん切りされたコラゲナーゼ/ディスパーゼを用いて消化し、単一細胞懸濁液中に機械的に分散した。 PVECsは強い磁場を使用してマイクロビーズに結合させanti-CD-31/PECAM-1抗体で陽性選択を用いて細胞懸濁液から精製される分離方法。コンフルエントとなるまで、さらに継代培養細胞は、精製された内皮細胞培養培地中のコラーゲン1コーティングした培養皿上で培養される。位相差光学顕微鏡、蛍光顕微鏡で可視化されるようPVECsは、このプロトコルの展示石畳と紡錘形の表現型を用いて得られる。 PVEC培養の純度は、内皮細胞のマーカーで設立されました。私たちの手では、この方法では、確実にかつ一貫してPVECsの純粋な集団が得られます。このプロトコルは、前脳の血管新生への機械論的な洞察を得るPVEC相互作用、および神経細胞の種類とのクロストークを理解し、治療的血管形成のための途方もない可能性を秘めていることを目的とした研究の利益になる。
Introduction
血管新生、神経発生および神経細胞移動は、中枢神経系（CNS）の開発、修復および再生における重要な事象である。いくつかのエレガントな研究は、内皮細胞が可溶性因子の放出を介して直接接触することによりニューロンの増殖およびその逆を刺激することが示されている。我々はそれが好奇心これらの研究1-3の大部分であることが見出さ神経前駆細胞/神経幹細胞は、胚の脳から単離されている間、それらは成人の脳、他の成体組織源から、または内皮細胞株と内皮細胞と共培養される。これは、部分的には、胚の脳から内皮細胞の純粋な集団を単離し、培養に関連する技術的な問題が原因である可能性があります。しかし、血管形成、神経発生、および神経細胞の移行は、より堅牢な胚の脳の正常な成人の脳に比べて桁違いに生じる同時イベントです。 embryoniの脳室周囲血管網Cの前脳（終脳）は、大脳基底核の原基内にある容器から発信され、胎生11（E11）4,5で終脳背側腹側からの整然とした勾配の形で開発しています。脳室周囲血管網の血管のこの神経叢は起源、解剖学的位置、成長パターン、および発生調節4,5に基づき、軟膜血管とは異なります。脳室周囲の血管新生勾配の伝播方向は、終脳の横断神経遺伝勾配と一致します。終脳内では、脳室周囲の血管新生勾配及び移行のGABAニューロンの勾配は接線方向にも空間的に6に重なる。タイミングに関しては、血管新生勾配は、約日までに神経遺伝勾配及びGABAニューロン勾配の進んでいる。したがって、内皮細胞は、脳室周囲空間的および時間的によく終脳の神経発生をサポートするために重要な手がかりを提供するように配置され、ニューロン移動4,6。したがって、神経前駆細胞及び/又はニューロンと共培養実験において、胚性脳室周囲の内皮細胞の使用は、神経血管の相互作用を研究し、神経変性疾患または虚血性/外傷性脳損傷の治療のための新規な手段を開発するためのより良好なモデルを提供するであろう。
我々は、上皮細胞の混入を制限することなく、分子的および脳室周囲血管網4,6（軟膜のECと区別するPVECs称される）の内皮細胞からの機能的に区別される軟膜血管内皮細胞を分離するだけでなく、軟膜膜を除去することの重要性を強調。ここでは、私たちが日常的にPVECsの豊かで純粋な収量を得るために、我々の研究室で使用する方法について説明します。これらの内皮細胞は、単一の時限妊娠マウスから単離された胚性前脳から調製される。これらは、膨張継代培養し、将来の使用のために正常に凍結することができる。
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Protocol
1。試薬および溶液の調製の
- 35mm培養皿のコーティング：コラーゲン1型溶液を、20mM酢酸（〜100mgのタンパク質/バイアル）中の水溶液として供給される。滅菌組織培養グレードの水を用いて0.01％の使用濃度にコラーゲン溶液の適切な容量に希釈する。 2〜8℃で、室温（RT）又は37℃で3-4時間、コラーゲン溶液1ml、または一晩でコートディッシュコートディッシュから余分な溶液を除去し、それを一晩乾燥させます。メディアを追加する前に、組織培養グレードの水またはPBSでお皿を洗浄します。被覆皿1ヶ月間4℃で保存することができる。
- 完全ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を準備します。 （;吸油量1 mlの1×濃度）を、10％FBSおよび抗生物質 - 抗真菌溶液でDMEM（500ml）に補う。完全DMEM 2ヶ月間4℃で保存することができる。
- アリコートをDNアーゼI（0.001 mg / ml）を有するDMEM（50 ml）を調製し、（Dと称されるMEM-DNアーゼI）。
- コラゲナーゼおよびディスパーゼ（DMEM-collagenase/dispaseと呼ぶ）（1 mg / ml）を含むDMEMの別のアリコート（10ml）に調製する。
- EGF（5μg）を、ECGS（100mg）および抗生物質 - 抗真菌溶液5μlを加えた内皮細胞培養培地（ECCM、500ミリリットル）を、準備します。 ECCM 2ヶ月間4℃で保存することができる。
- 使用前にすべてのメディアを予熱し。
- 0.5％BSAおよび2mM EDTAを含むPBS、pHが7.2：精製緩衝液を準備します。冷緩衝を維持（2〜8℃）。
2。終脳の胚および解剖の除去
実験動物を用いて、全ての実験は、マクリーン病院の動物のケアと使用委員会によって承認され、実験動物の管理と使用に関するNIHガイドラインに準拠している。
- 時限妊娠CD1マウス（胎生15日目）を使用します。膣栓の発見の日は、胎生0（E0）と考えられている。 CD1ダムは一般的に大規模なリットルを生産するため、10月12日胚Sは妊娠ダムから期待されている。
- 子宮切開のために、ケタミン（100 mg / kgの）/キシラジン（5 mg / kg）を腹腔内注射で妊娠マウスを麻酔。マウス約20〜30 gで、10ミリリットル/キログラムケタミン/キシラジン麻酔液の0.3ミリリットルを提供し、その痛みや苦痛は麻酔薬の腹腔内注射時に最小限であることを確認してください。注射のために手の拘束を使用してください。
- 足指のピンチで深麻酔をチェックしてください。深く麻酔したマウスから胚を取り出します。母親から除去すると、すぐに各胚を首を切る。氷冷PBS中の滅菌ペトリ皿に胚ヘッドを配置します。
- 2013版：麻酔薬の過剰投与（130 mg / kgのペントバルビタール、IP）、動物の安楽死のためのAVMAガイドラインと一致して安楽死させる方法、とすぐに安楽死により子宮摘出に従ってください。
- 実体顕微鏡下で、細かいマイクロチップはさみや細かい鉗子で頭から脳を削除します。注：高品質の解剖イオンが正常胚の脳から軟膜膜を除去することが不可欠である。これは実施によって達成される。細かい鉗子とマイクロチップのはさみはまた、良好な解剖を取得するための重要なツールです。
- 軟膜膜を剥がすために、脳やマイクロチップのはさみをしっかりグリップを得るために鉗子を使用してください。中脳と後脳を取り出して、終脳を分離します。氷の中の2ミリリットルPBSで35mm培養皿にすべての胚から軟膜フリー終脳を転送します。
3。細胞単離
- メスの刃との1〜2mmの断片に終脳をミンチし、完全DMEM 2ミリリットルを含む15ミリリットルファルコンチューブ内の組織を収集します。
- 塊が消え、乳白色の懸濁液が達成されるまで、1ミリリットルピペットで静かに徹底的に組織を解離する。
- 遠心分離機は、室温で5分間800〜1,000×gで細胞を解離し。
- 慎重にゆっくりとCEの関連付けを解除したDMEM-DNアーゼIの上清を再懸濁ペレットを削除LLS再度RTで5分間、800〜1,000×gでで1 mlピペット及び遠心分離機を用いて。
- 暖かい完全DMEMにペレットを再懸濁。無菌70μmのナイロンメッシュを通してフィルタセル。フィルタリング細胞を収集し、氷中に保管してください。
- 細胞部分がメッシュ上に保持され、RTで1〜2分間DMEM-collagenase/dispase（2ml）でさらに消化集める。室温で5分間800〜1,000×gの遠心分離によって、DMEM-DNアーゼIにセル3回洗浄します。ステップ3.5で収集フィルタリング細胞とこれらの細胞をプール。完全DMEMで一度全細胞を洗浄します。細胞数および磁気標識ステップを決定するために進んでください。注：これは、磁気標識の前に単一細胞懸濁液を得ることが重要である。
4。磁気標識
- このプロトコルは、10 7個の細胞の磁気標識を示す。 10 7以上の細胞数が低いため、同じ試薬量および10 7を超える細胞数のために使うと、試薬容量と総容量のスケールアップこのため（ 例えば、2×10 7全細胞のために、すべての示された試薬の二倍のボリュームを使用します）。氷の中のすべての試薬および細胞を維持する。
- 血球計数器で細胞数を決定します。
- 室温で10分間300×gで遠心細胞懸濁液。完全に上清を吸引し。
- CD31マイクロビーズを10μlに続く細胞ペレットに精製緩衝液の90μl/107セルを追加。製造業者によって提供されるマイクロビーズ、抗マウスCD31のモノクローナル抗体をコンジュゲートされる。
- よく混ぜ、冷蔵庫で15分間インキュベートする。注：磁気標識の間より高い温度および/またはより長いインキュベーション時間は、非特異的結合をもたらし得る。
- 10分間300×gで精製緩衝遠心1-2エルフテックス7細胞を追加することで細胞を洗浄。上清を除去し、精製緩衝液500μl中に細胞を再懸濁。磁気分離または精製ステップに進みます。
5。 PUrification
- MACSセパレーターの磁場中でMSカラムに配置します。
- 精製緩衝液500μlでカラムを洗浄します。
- カラムに細胞懸濁液を適用します。高い細胞数が列を詰まらせる可能性があるMSカラムに適切な数の細胞をロードします。注意：各MSカラムは、2×10 7セルの最大数を収容することができ、より高い細胞数を、より多くの列を使用しています。
- 収集および非標識細胞を含むフロースルーを捨てる。
- 精製緩衝液500μlで3回カラムを洗浄。洗浄工程の間に、列のリザーバは、その後の精製緩衝液の一定分量を追加する前に空であることを確認してください。
- MACS分離器から列を削除し、15ミリリットルファルコンチューブの上に置きます。
- プランジャは、MSカラムと共に供給される。 MSのカラムにピペット精製緩衝液の1ミリリットル、すぐにしっかりと列にプランジャーを押すことにより、磁気的に標識した細胞を洗い流す。
- プレートCEL35mm培養皿上のlsは、コラーゲンタイプ1でプレコートし、95％O 2および5％CO 2、37℃に設定したインキュベーター中ECCM中の細胞を成長させる。
- 4日ごとに培地を変更します。料理がコンフルエントのとき10〜12日後に実験やサブカルチャーのためのPVECsを使用してください。
6。 PV ECのサブカルチャー
- ECCMを取り外し、滅菌PBS、1〜2 mlのPVECSの単層をすすぎます。
- 穏やかに細胞単層を覆うように、0.25％トリプシン-EDTA溶液1.5mlを加える。
- インキュベーターに料理を返します。 5-7分以内に、細胞は、皿の表面から剥離します。
- 細胞が剥離した後、直ちにトリプシンインヒビター等量のを追加し、数回粉砕する。
- 無菌15ミリリットルファルコンチューブに細胞を移す。 5分間500×gでチューブを遠心分離する。
- 上清を除去し、予め温めECCMの1ミリリットル中にペレットを再懸濁します。
- 文化、IMを拡大するために細胞を播種老化または他のアッセイ。
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Representative Results
1-12日目からPVECsの表現型の特徴は、位相差光学顕微鏡検査（ 図2）によって示されている。細胞分裂（ 図2A）の1日目を表示形態学特性上皿に付着した細胞。 5-8日の間、石畳からPVECs遷移は、内皮細胞およびそのin vivoの状態（ 図2Bおよび2C）により類似の典型的な形の形態をスピンドルます。 12日目までにPVEC文化が完全な合流点（ 図2D）を実現。 PVECsは、コロニー（ 図2E-G）を拡大することが容易で継代培養することができます。内皮細胞培養の純度は、内皮細胞のマーカーで設立されました-イソレクチンB4、CD-31/PECAM-1、フォンヴィレブランド因子（VWF）とVE-カドヘリンとサブカルチャー（ 図2H-K）の後に百パーセントであることが決定された。
高倍率のCD1胚から調製PVECsの画像だけでなく、タイ（その内皮細胞がGFPを発現する）2-GFP胚を4（ 図 3）が示されている。一般的な石畳や紡錘形の形態（ 図3A〜C）に加えて、細身のプロセスとの多角形の形態も観察されたイソレクチンB4-標識及びTie2-GFP +は（ 図3Dと3E）PVECsを見る。 （マトリゲルがない場合）私たちのコラーゲンコートした培養皿のいくつかでは、PVECsは、生体内脳室周囲血管網（ 図3F）のユニークな特徴に似た格子状のパターンを形成した。これはPVECsの高い血管新生の可能性を反映している。血管新生アッセイがどのPVECs（2×10 4個の細胞）で実施したマトリゲルマトリックスでコーティングした培養皿に添加した。 PVECs 18時間（ 図3G）内に堅牢管形成を示した。これらの結果は、このシステムは、インビトロの内皮細胞モデルとして使用することができるという強力な証拠を提供する。孤立PVECsCD1胚から急速に生細胞の細胞質に強い安定した蛍光を提供し、移動、運動性、形態、細胞機能アッセイなどを含むライブPVECsの長期試験のために使用することができるのQdotナノ結晶（ 図3H）で標識することができるだけでなく、in vivo実験 。 PVECs BacMamによっては、2.0（ 図3I）は、生細胞イメージング実験における細胞形態の明確な可視化のために当たり、製造業者の指示として、細胞形質膜ライト-RFP様細胞トレーサーをトランスフェクトすることができる。
我々は、ECCMでなく、ラット脳内皮細胞増殖培地（RBECGM）およびDMEM F12培地だけでなくPVECsを培養した。位相コントラスト（ 図4A、4C、および4E）およびイソレクチンB4 ECCMで培養しPVECsの画像（ 図4B、4Dおよび4F）（図4Aおよび図4B）、RBECGM（図4C標識の両方と
図1。 PVEC分離の概略。アイソレーションと、Pのために使用されるプロトコル胚終脳からPVECsのurificationがスキーマにまとめられている。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。 PVECsの表現型の特徴。（AG）めっき後の異なる時点でPVEC文化の位相差像。 1日目（A）PVEC文化。細胞が付着した形態を分割表示しています。 （B）PVECの5日目の文化や形状形態をスピンドルに石畳から8日目移行に（C）。 （D）PVEC文化の日12日の合流を達成した。 1日目のサブカルチャーした後、（E）PVECs、（F）5日目（G B4（H）、フォンウィルブランド因子（I）、CD31/PECAM（J）およびVE-カドヘリン（K）：内皮細胞マーカーを用いPVECsの（HJ）免疫標識。スケールバー：A、100ミクロン（BJを適用）、K、50μmである。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3。 PVECsの形態を。（A〜E）イソレクチンB4-標識及びTie2-GFP +の高倍率の画像は、細身のロングエクステンション（D、E）で石畳と紡錘形の形態（AC）だけでなく、多角形態を示しPVECsを見る。 （<強い> F）PVECsさえマトリゲルがない状態で培養皿の高い血管新生の可能性を示しています。 （G）PVECsは、マトリゲル上の血管新生アッセイにおいてロバスト管形成を示す。 ®標識ナノクリスタルで標識（H）PVECs。携帯ライト形質膜-RFP、BacMamによって2.0でトランスフェクション（I）PVECs。スケールバー：A、50ミクロン、B、15ミクロン（CEを適用）、F、100ミクロン（G、Hを適用）、I、50μmである。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図4。異なる培養培地を表示バリアントの形態で成長させPVECs。（
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Discussion
PVEC年代は、より生理学的に関連する神経血管の相互作用に焦点を当てた研究のための他の組織源からの大人の脳内皮細胞とのECよりもあり、また治療の可能性を持っている。 PVECの準備のためには、死んだ細胞は、CD31マイクロビーズに非特異的に結合することができるので、優れた実行可能性を達成するために、高速動作するように郭清を伴う重要な始まりです。単一細胞懸濁液は、従来の磁気標識工程により達成されていない場合も、これは、細胞塊がカラムの目詰まりの原因となるので、トラブルシューティングをもたらすであろう。この方法の利点は、磁気ビーズ、時間がかかり、EC製剤4,7用の磁気ビーズに基づく分離方法において使用されることがしばしば困難工程から細胞を剥離するために、トリプシンとのインキュベーションのために必要がないことである。さらに、この分離技術は、胚脳組織を大量に必要としない。 PVECのは一貫APPRの単一時限妊娠マウスを利用して製造することができるoximately、12日間継代培養し、 インビトロでの多種多様およびin vivo実験に使用した。
単離後PVECsの純度は90％以上であるが、継代培養後のPVECsの純度は100％である。内皮細胞に加えて、PECAM-1は、単球/マクロファージの表面上に見出される。生後または成体脳8と比較すると、小膠細胞、CNSのマクロファージ集団は、胚性マウス脳内しかしながら、非常に低い。単球/ミクログリアは、10％ウシ胎児血清および成長する特定の成長因子を添加した培地を必要とする、彼らはECCMで最終的に死ぬとPVECsのサブカルチャーの後に続かないだろう。 100％純粋なPVECsが（例えば、遺伝子発現をテストするために）すぐに分離した後に必要とされているとき、私たちは（FACS）メソッドを蛍光活性化細胞選別を使用しています。 PVECsはその後（のみ内皮細胞がGFPを発現する）Tie2GFP胚から単離され、厳重に二重FACS分析によって並べ替えられています。ソートされた内皮の純度L細胞は、GFPとCD31/PECAM-1 6に陽性ダブルアール細胞の採取によって保証されています。
培養物はまた、密接に周皮細胞のような細胞型を汚染するための単離の最初の週に観察される。周皮細胞は、不規則な形状していると、紡錘状又は多角形で構成された内皮細胞とは異なり、コロニーとして成長接触させた細胞をコンフルエントな単層を形成することはありませんので、もし存在すれば認識するのは簡単です。周皮細胞の混入が検出された場合、迅速なトリプシン処理の手順（2-3分）、続いて低濃度のトリプシン（0.05％）をPVECsの継代培養のために使用される。周皮細胞は、拡張トリプシン処理時間（7月10日分）を必要とし、取り付けられたままになります。また、周皮細胞トリプシン処理（もしあれば）のめっき効率が非常に悪い。これらのステップは、周皮細胞の混入を排除し、継代培養PVECsが純粋であることを確認してください。
ECCM媒体はヒドロコルチゾンを含有する低血清培地であり、ヘパリンおよび2％ウシ胎児血清および上皮成長因子（EGF）および血管内皮細胞増殖サプリメント（ECGS）が補充される。 ECCMで栽培PVECsは一貫して、スピンドル形の形態を示した。ラット脳ECGMは、10％ウシ胎児血清、成長因子、およびVEGFを含有する。この培地で増殖させPVECsは非常に細長い形態を持ち、集密度を達成するために時間がかかります。 DMEM-F12培地、10％ウシ胎児血清、グルタおよび内皮細胞成長サプリメントを補充し、それは他の媒体よりも増殖を誘導する。この培地で増殖させPVECsは4日間で非常に急速な成長と達成エンシーを示したが、その形態は、フラットまたは唯一の多角た。私たちは、表現型および機能を喪失することなく、最大3継代ECCM中PVECs成長している。したがって、ECCMは、我々がPVEC培養に好む媒体である。
このプロトコルによって神経前駆細胞と共培養PVECsはFAに神経発生および神経細胞移動を刺激する可能性が高いR-大きい成人の脳から、または他の供給源からの内皮細胞よりエクステントとは、脳卒中、外傷性脳損傷や神経変性における神経機能の回復を支援するための貴重な場合があります。成体の脳に移植し、神経前駆体は、多くの場合、失速や新しいニューロンを必要とする領域に移行するために失敗することが報告されている。この問題は、放射状グリアガイド9のようなニューロンの移動を容易に基板が存在しない場合に計上される。血管系はますます神経細胞移動6,10,11のための基質として認識されています。 PVECsは、移植部位でのこれらの機能停止ニューロン前駆体のためのソリューションを提供することがあります。損傷した脳領域にPVECsとニューロンのCoimplantationは、内皮細胞による神経細胞のガイド付きの移行を容易にし、機能回復を達成するのを助けることがあります。また、神経細胞の移行と内皮細胞の密接な関連を直接成長因子およびモルフォゲンを提供し、選択的にするには、それらを独自に最適ですニューロンの移行。
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Disclosures
利害の対立が宣言されていません。
Acknowledgments
この作品は、統合失調症研究のための国民の同盟とうつ病（NARSAD）若手研究者賞と米国立衛生研究所のAVにR01NS073635を助成金によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNase I | Sigma | D-4527 | |
| Collagen, Type 1 solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| DPBS | Quality Biologicals | 114057-131 | |
| EDTA | Fisher Scientific | M4055 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| MS column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| CD31 microbeads | Miltenyi Biotech | 130-097-418 | |
| MACS separator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Bioscience | 352350 | |
| Antibiotic and antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| 35 mm Culture dish | BD Bioscience | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352097 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352098 | |
| ECCM kit | BD Bioscience | 355054 | Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF, and Soybean Trypsin Inhibitor |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Bioscience | 354006 | |
| RBECGM | Cell Applications | R819-500 | |
| DMEM F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 305050-061 | |
| Tissue culture grade water | Life Technologies | 15230162 | |
| 0.25% Trypsin | Life Technologies | 15050 | |
| Soybean trypsin inhibitor | BD Bioscience | 5425 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Life Technologies | Q25021 | |
| CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0 | Life Technologies | C10608 | |
| Biotinylated Isolectin B4 antibody | Sigma | L2140 | |
| Anti-Von Willebrand factor | Sigma | F3520 | |
| Anti-CD31/PECAM-1 | BD Pharmingen | 550274 | |
| VECTASHIELD Hardset Mounting Media with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Ketamine | Butler Schein Animal Health Supply | 44028 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 1009 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Inverted microscope | Olympus CK-40 | CK-40 | |
| Fluorescent microscope | Olympus FSX-100 | FSX-100 | |
| Fine forceps | Roboz Surgical Instrument | 7 inox | |
| Fine microtip scissors | Roboz Surgical Instrument | RS5611 |
References
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