Summary
Denne filmen viser en enkel og pålitelig strategi for fremstilling av rene kulturer av endotelceller fra den embryoniske forhjerne i 10 til 12 dager, og vil være nyttige for forskning fokusert på mange aspekter av cerebral angiogenese.
Abstract
Embryonale hjerne endotelceller kan tjene som et viktig verktøy i studiet av angiogenese og nevrovaskulære utvikling og samhandling. De to vaskulære nettverk av embryonale forhjerne, pial og periventricular, er romlig særegne og har ulik opprinnelse og vekst mønstre. Endotelceller fra pial og periventricular vaskulære nettverk har unike genekspresjonsprofiler og funksjoner. Her presenterer vi en steg-for-steg-protokollen for isolasjon, kultur, og verifisering av rene bestander av endotelceller fra periventricular vaskulære nettverk (PVECs) av embryonale forhjerne (telencephalon). I denne fremgangsmåten, blir telencephalon blottet for pial membran oppnådd fra embryoniske dag 15 mus farse, spaltet med kollagenase / dispase, og dispergeres mekanisk i en enkelt cellesuspensjon. PVECs er renset fra cellesuspensjonen med positiv utvelgelse med anti-CD-31/PECAM-1 antistoff konjugert til microbeads ved hjelp av en sterk magnetiskseparasjonsmetode. Rensede celler dyrkes på en kollagen belagt kultur retter i endotelial cellekulturmedium inntil de blir sammenflytende og videre subkultivert. PVECs oppnådd med denne protokollen utstillings brostein og spindel formet fenotyper, som visualiseres ved fase-kontrast lysmikroskopi og fluorescens mikroskopi. Purity of PVEC kulturer ble etablert med endotelcelle markører. I våre hender, denne metoden pålitelig og konsekvent gir rene bestander av PVECs. Denne protokollen vil gagne studier med sikte på å få mekanistiske innsikt i forhjernen angiogenese, forstå PVEC interaksjoner, og kryss-samtaler med nevronale celletyper og har et enormt potensial for terapeutisk angiogenese.
Introduction
Angiogenese, neurogenesis og neuronal migrasjon er kritiske hendelser i sentralnervesystemet (CNS) utvikling, reparasjon og regenerering. Flere elegante studier har vist at endotelceller stimulerer neuronal proliferasjon og vice versa ved frigivelse av løselige faktorer, og ved direkte kontakt. Vi har funnet det å vite at i mesteparten av disse studiene 1-3, mens neuronale progenitorer / neurale stamceller isolert fra den embryoniske hjernen, er de cocultured med endotelceller fra den voksne hjernen, andre voksne vev kilder, eller med endotel-cellelinjer. Dette kan delvis skyldes de tekniske problemer forbundet med å isolere og dyrke rene populasjoner av endotelceller fra den embryoniske hjernen. Men, angiogenese, neurogenesis, og neuronal migrasjon er sammenfallende hendelser i størrelsesordener mer robust i den embryonale hjernen enn i den normale voksne hjernen. Den periventricular vaskulære nettverk av embryonic forhjerne (telencephalon) stammer fra et fartøy plassert i basalgangliene primordium og utvikler seg i form av en ordnet gradient fra ventral til dorsal telencephalon ved embryonisk dag 11 (E11) 4,5. Dette plexus av fartøy av periventricular vaskulære nettverk er forskjellig fra pial fartøy basert på opprinnelse, anatomiske plassering, vekstmønster og utviklings regulering 4,5. Retning av spredning av periventricular angiogenese gradient matcher telencephalic tverr neurogenetic gradient. Innenfor telencephalon, den periventricular angiogenese gradient og gradient av GABA nevroner trekkende tangentielt lapper romlig samt seks. Med hensyn til timing, er angiogenese gradient i forkant av neurogenetic gradient og GABA nevron gradient med om lag en dag. Dermed periventricular endotelceller er romlig og tidsmessig godt posisjonert for å gi kritiske pekepinner for å støtte telencephalic neurogenesis ogneuronal migrasjon 4,6. Derfor vil bruk av embryonale periventrikulær endotelceller i coculture eksperimenter med neuronal stamceller og / eller nerveceller gir et gunstigere modell for å studere interaksjoner neurovascular og utvikle nye muligheter for behandling av nevrodegenerative sykdommer eller ischemisk / traumatisk hjerneskade.
Vi understreker viktigheten av å fjerne pial membran, ikke bare for å begrense epitelcelle forurensning, men også for å skille pial endotelceller som er molekylært og funksjonelt forskjellig fra endotelceller i periventricular vaskulære nettverk 4,6 (betegnes PVECs å skille fra pial egenkapitalbevis) . Her beskriver vi den metoden som vi rutinemessig bruk i vårt laboratorium for å få en rik og ren utbytte av PVECs. Disse endotelcellene er fremstilt fra embryoniske forebrains isolert fra en enkelt tidsstyrt-gravide mus. De kan bli utvidet, subkultiveres, og frosset ned med hell for fremtidig bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Utarbeidelse av reagenser og løsninger
- Belegg på 35 mm dyrkningsskål: Collagen Type 1 løsning tilføres som en vandig oppløsning i 20 mM eddiksyre (~ 100 mg protein / ampulle). Fortynn et passende volum av kollagenløsning til en arbeidskonsentrasjon på 0,01% ved hjelp av sterilt vevskultur grad av vann. Coat retter med 1 ml av kollagen-løsning i 3-4 timer ved romtemperatur (RT) eller 37 ° C eller over natten ved 2-8 ° C. Fjern overflødig løsning fra belagt fatet og la den tørke over natten. Skyll formen med vev kultur grade vann eller PBS før du legger medier. Belagt retter kan lagres ved 4 ° C i én måned.
- Forbered komplett Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM). Supplement av DMEM (500 ml) med 10% FBS og antibiotika-antimykotisk løsning (1x konsentrasjon, 1 ml/100 ml). Komplett DMEM kan lagres ved 4 ° C i to måneder.
- Tilbered en aliquot (50 ml) i DMEM med DNase I (0,001 mg / ml), (referert til som DMEM-DNase I).
- Tilbered en annen aliquot (10 ml) i DMEM med kollagenase og dispase (1 mg / ml) (referert til som DMEM-collagenase/dispase).
- Forbered Endothelial Cell Culture Medium (ECCM, 500 ml), supplert med EGF (5 mikrogram), ECGS (100 mg) og 5 pl av antibiotisk-antimykotisk løsning. ECCM kan lagres ved 4 ° C i to måneder.
- Prewarm alle medier før bruk.
- Forbered Rensing buffer: PBS, pH 7,2 med 0,5% BSA og 2 mM EDTA. Hold buffer kaldt (2-8 ° C).
2. Fjerning av embryo og Dissection of Telencephalon
Alle eksperimenter med forsøksdyr er godkjent av dyr omsorg og bruke komiteer av McLean Hospital og i samsvar med NIH retningslinjer for behandling og bruk av forsøksdyr.
- Bruk tidsbestemte gravide CD1-mus (embryonale dag 15). Dagen for vaginal plug oppdagelsen regnes embryonale dag 0 (E0). CD1 dammer generelt produsere store kull, så 10-12 embryos er forventet fra en gravid dam.
- For hysterotomy, anesthetize gravide mus med en intraperitoneal injeksjon av ketamin (100 mg / kg) / xylazin (5 mg / kg). For mus omtrent 20 til 30 g, gir 0,3 ml av en 10 ml / kg ketamin / xylazin bedøvelse løsning og sikre at smerte og ubehag er minimal ved intraperitoneale injeksjoner av narkosen. Bruk håndholdenhet for injeksjoner.
- Sjekk dyp anestesi ved tå klype. Fjern embryoer fra dypt bedøvet mus. Halshogge hvert embryo umiddelbart etter fjerning fra moren. Plasser de embryonale hoder i sterile petriskåler i iskald PBS.
- Følg hysterektomi ved umiddelbar dødshjelp med bedøvelse overdose (130 mg / kg pentobarbital, ip), en metode for aktiv dødshjelp, som er konsistent med de AVMA Retningslinjer for Avliving av dyr: 2013 Edition.
- Under en stereo mikroskop, fjerne hjernen fra hodet med fine mikrotip saks og fin pinsett. Merk: En høy kvalitet dissekereion er avgjørende for å lykkes fjerne pial membran fra embryonale hjernen. Dette oppnås i praksis. Fin pinsett og mikrotip saks er også viktige verktøy for å få en god disseksjon.
- Bruk pinsett for å få et fast grep om hjernen og mikrotip saks å skrelle bort pial membran. Fjern mesencephalon og metencephalon og isolere telencephalon. Overfør pial fritt telencephalon fra alle embryo til en 35 mm kultur parabolen med to ml PBS i isen.
Tre. Cell Isolation
- Finhakk telencephalon inn 1-2 mm fragmenter med en skalpell blad og samle vev i et 15 ml Falcon rør som inneholder 2 ml komplett DMEM.
- Distansere vev forsiktig, men grundig med en 1 ml pipette inntil klumper forsvinner og en melkeaktig suspensjon er oppnådd.
- Sentrifuger cellene dissosiert ved 800-1000 xg i 5 min ved RT.
- Fjern forsiktig supernatanten og resuspender pellet i DMEM-DNase I. forsiktig distansere cells igjen ved hjelp av en ml pipette og sentrifuger ved 800-1000 xg i 5 min ved RT.
- Resuspender pellet i varm komplett DMEM. Filter celler gjennom en steril 70 mikrometer nylon mesh. Samle filtrert celler og holde på is.
- Samle celle-delene tilbakeholdt på mesh og fordøye videre med DMEM-collagenase/dispase (2 ml) i 1-2 min ved RT. Vask cellene 3x i DMEM-DNase I gjennom sentrifugering ved 800-1000 x g i 5 min ved RT. Pool disse cellene med de filtrerte celler i trinna 3,5. Vask totale celler gang med komplett DMEM. Fortsett å bestemme celle nummer og magnetiske merking trinn. Merk: Det er viktig å fremskaffe en enkeltcelle-suspensjon før magnetisk merking.
4. Magnetisk Merking
- Denne protokollen viser den magnetiske merking av 10 7 celler. For celle tall lavere enn 10 7, bruke samme reagensvolum og for celle tall større enn 10 7, skalere opp alle reagensvolumene og totalvolumderetter (for eksempel for 2 x 10 7 totale celler, bruker to ganger volumet av alle angitte reagenser). Hold alle reagenser og celler i isen.
- Bestem celle nummer med en hemocytometer.
- Sentrifuger cellesuspensjon ved 300 xg i 10 min ved RT. Aspirer supernatanten helt.
- Legg 90 μl/10 7 celler av rensing buffer til cellepelleten, etterfulgt av 10 pl av CD31 mikroperler. De Microbeads gitt av produsenten er konjugert monoklonale anti-mus CD31 antistoff.
- Bland godt og inkuber i 15 minutter i kjøleskapet. Merk: Høyere temperaturer og / eller lengre inkubasjonstid under magnetisk merking kan føre til ikke-spesifikk binding.
- Vask cellene ved tilsetning av 1-2 ml/10 7 celler av rensing buffer og sentrifuger ved 300 xg i 10 min. Fjern supernatanten og resuspender celler i 500 mL av rensing buffer. Fortsett til magnetisk separasjon eller rensetrinn.
5. Purification
- Plasser MS kolonne i det magnetiske feltet i MACS Separator.
- Skyll kolonne med 500 mL av rensing buffer.
- Påfør cellesuspensjon på støtten. Legg i riktig antall celler til MS kolonne som høyere celle nummer kan tette kolonnen. Forsiktig: Hver MS kolonne kan romme maksimalt antall 2 x 10 7 celler, for en høyere celle nummer, bruke flere kolonner.
- Samle og kast gjennomstrømning som inneholder umerkede celler.
- Vask kolonnen med 500 mL av rensing buffer tre ganger. Under vasketrinn, sørg for at reservoaret kolonnen er tom før du legger påfølgende rensing buffer mengdene.
- Fjern kolonnen fra MACS separator og plassere den på en 15 ml Falcon rør.
- Et stempel tilføres sammen med MS-kolonnen. Pipetter 1 ml rensing bufferen til MS-kolonnen og straks skylle ut magnetisk merkede celler ved å ta godt skyve stempelet inn i kolonnen.
- Plate cells på et 35 mm dyrkningsskål-belagt med kollagen type 1 og dyrke cellene i ECCM i en inkubator innstilt på 37 ° C med 95% O2 og 5% CO2.
- Endre medium hver fjerde dag. Bruk PVECs for eksperimenter eller subkultur etter 10-12 dager når parabolen er konfluent.
6. Subkultur av PV ECS
- Fjern ECCM og skyll den monolayer av PVECS med 1-2 ml sterilt PBS.
- Tilsett 1,5 ml av 0,25% Trypsin-EDTA-løsning for å dekke cellemonolaget.
- Tilbake fatet til inkubatoren. I løpet av 5-7 minutter, blir cellene løsner fra overflaten av formen.
- Etter at cellene er frittliggende, umiddelbart tilføre et tilsvarende volum av trypsin-inhibitor og Triturer flere ganger.
- Overfør cellene til en steril 15 ml Falcon-røret. Sentrifuger røret ved 500 x g i 5 min.
- Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 1 ml forvarmet ECCM.
- Seed cellene for å utvide kultur, imaldring eller andre analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De fenotypiske karakteriseringen av PVECs fra dag 1-12 er vist ved fase-kontrastmikroskopi (figur 2). Cellene festet til fatet på dag 1 viser morfologi karakteristisk for celledeling (figur 2A). Mellom 5-8 dager, for å PVECs overgang fra brostensbelagte spindel formet morfologi typisk for endotelceller og mer beslektet med sin in vivo tilstand (Tall 2B og 2C). Ved dag 12 den PVEC kultur oppnår fullt samløpet (figur 2D). PVECs kan subkultiveres lett å utvide kolonien (Tall 2E-G). Purity av endothelial cellekulturer ble etablert med endotelcelle markører - Isolectin B4, CD-31/PECAM-1, von Willebrand faktor (vWF) og VE-cadherin og var fast bestemt på å være en hundre prosent etter subkultur (Tall 2H-K).
Høye forstørrelse bilder av PVECs forberedt fra CD1 embryoer samt Tie2-GFP embryoer 4 (som endoteliale celler uttrykker GFP) er vist (figur 3). I tillegg til den vanlige brostein og spindel formet morfologi (Tall 3A-C), ble polygonale morfologi med slanke prosesser også observert i isolectin B4-merket og Tie2-GFP + ve PVECs (Tall 3D og 3E). I noen av kollagen belagt kultur retter (i fravær av Matrigel), PVECs formet gittermønster som ligner den unike egenskap ved in vivo periventricular vaskulære nettverk (figur 3F). Dette gjenspeiler den høye angiogenic potensialet i PVECs. En angiogenese-analyse ble utført hvori PVECs (2 x 10 4 celler) ble tilsatt til kulturskåler belagt med Matrigel matrise. PVECs viste robust tube dannelse innen 18 timer (Figur 3G). Disse resultatene gir et sterkt bevis for at dette system kan anvendes som en in vitro endotelial cellemodell. PVECs isolertfra CD1 embryoer kan raskt merket med Qdot nanokrystaller (Figur 3H) som leverer intense stabil fluorescens i cytoplasma av levende celler, og kan brukes for langsiktige studier av levende PVECs, inkludert migrering, motilitet, morfologi, celle-funksjon analyser som samt in vivo eksperimenter. PVECs kan bli tilført med cellesporstoff som Cell Lett Plasma Membran-RFP, BacMam 2,0 (Figur 3I) som i henhold til produsentens instruksjoner for klar visualisering av cellemorfologi i levende celle bildebehandling eksperimenter.
Vi dyrket PVECs ikke bare i ECCM, men også i rottehjerne endotelial cellevekstmedium (RBECGM) og DMEM F12 medium. Både fase kontrast (Tall 4A, 4C, og 4E) og isolectin B4 merket bilder (Tall 4B, 4D, og 4F) av PVECs dyrket i ECCM (Tall 4A og 4B), RBECGM (Tall 4C og
Figur 1. Skjematisk av PVEC isolasjon. Protokollen som brukes for isolering og purification av PVECs fra embryonale telencephalon er oppsummert i et skjema. Klikk her for å se større bilde .
Figur 2. Fenotypisk karakterisering av PVECs. (AG) bilder fasekontrast av PVEC kultur på ulike tidspunkter etter plating. (A) PVEC kultur på dag en. Celler har festet og vise skillelinjene morfologi. (B) PVEC kultur på dag 5, og (C) på dag 8 overgangen fra brostein til spindel form morfologi. (D) PVEC kultur oppnådd samløpet på dag 12.. (E) PVECs etter subkultur på dag 1, (F) Dag 5 (G (HJ) immunolabeling av PVECs bruker endotelcelle markører: Isolectin B4 (H), von Willebrand faktor (I), CD31/PECAM (J) og VE-cadherin (K). Scale barer: A, 100 mikrometer (gjelder BJ), K, 50 mikrometer. Klikk her for å se større bilde .
Figur 3. Morfologi av PVECs. (AE) Høy forstørrelse bilder av isolectin B4-merket og Tie2-GFP + ve PVECs viser brostein og spindel formet morfologi (AC) samt kantet morfologi med slanke lange utvidelser (D, E). (<sterke> F) PVECs viser høy angiogen potensial i dyrkningsskål, selv i fravær av Matrigel. (G) PVECs viser robust tube dannelse i en angiogenese analysen på Matrigel. (H) PVECs merket med Qdot nanokrystaller. (I) PVECs transfektert med Cell Lett Plasma Membran-RFP, BacMam 2,0. Scale barer: A, 50 mikrometer, B, 15 mikrometer (gjelder CE), F, 100 mikrometer (gjelder G, H), I, 50 mikrometer. Klikk her for å se større bilde .
Figur 4. PVECs dyrket i forskjellig kultur media showet variant morfologi. (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PVEC-er er mer fysiologisk relevant enn voksne hjernen endotelceller og egenkapitalbevis fra andre vev kilder for studier som fokuserer på nevrovaskulære interaksjoner og også ha terapeutisk potensial. For PVEC forberedelse, er det avgjørende begynnelsen med disseksjon å jobbe fort for å oppnå en god levedyktighet siden døde celler kan binde nonspecifically til CD31 microbeads. I tillegg, hvis enkelt-cellesuspensjon ikke oppnås før den magnetiske merking trinn, vil dette resultere i feilsøking, siden celleklumper vil tilstoppe kolonnen. En fordel ved denne metoden er at det ikke er behov for inkubering med trypsin for å løsne cellene fra magnetiske kuler, en tidkrevende og ofte vanskelige trinn brukes i andre magnetiske kuler basert separasjonsmetoder for EC-preparater 4,7. I tillegg vil dette isolert teknikk krever ikke store mengder av embryonale hjernevev. PVEC er kan være gjennomgående fremstilt ved bruk av et enkelt tidsstyrt gravide mus i caoximately 12 dager, subkultivert, og anvendes i en rekke forskjellige in vitro-og in vivo eksperimenter.
Renheten av PVECs etter isolering er over 90%, men renheten av PVECs etter subkultur er 100%. I tillegg til endotelceller, er PECAM-1 finnes på overflaten av monocytter / makrofager. Microglia er makrofag befolkningen i CNS, men meget lav i den embryonale musehjerne når sammenlignet med postnatal eller voksen hjerne 8.. Monocytter / microglia trenger medium supplert med 10% føtalt kalveserum og bestemte vekstfaktorer for å vokse, vil de dø ut etter hvert i ECCM og vil ikke vare etter subkultur av PVECs. Ved 100% rene PVECs er nødvendig umiddelbart etter isolering (for eksempel for å teste genekspresjon), bruker vi fluorescens-aktivert cellesortering (FACS)-metoden. PVECs blir deretter isolert fra Tie2GFP embryoer (der bare endotelceller uttrykker GFP) og strengt sortert etter dual FACS analyse. Renheten av sortert endothelial cellene er sikret av samling av celler som er dobbelt positiv for GFP og CD31/PECAM-1 seks.
Kulturer er også nøye observert i den første uken i isolasjon for forurensende celletyper som pericytes. Siden pericyte cellene er uregelmessig formet, og vil aldri danne en konfluent monoskikt motsetning endotelceller som består av spindel formet eller mangekantet, kontaktet celler som vokser som kolonier, de er lette å kjenne igjen hvis det finnes. Hvis det registreres pericyte forurensning, en lavere konsentrasjon av trypsin (0,05%), etterfulgt av en rask trypsinisering fremgangsmåte (2-3 min) brukes for subkultur av PVECs. Pericytes krever en utvidet trypsinization tid (7-10 min) og vil forbli festet. I tillegg, er den plette effektiviteten av trypsinisert pericytes (hvis noen) meget dårlig. Disse trinnene eliminere pericyte forurensning og sikre at subkultiveres PVECs er ren.
Den ECCM medium er en lav serummedium inneholdende hydrokortison,heparin og 2% kalvefosterserum, og suppleres med epidermal vekstfaktor (EGF), og endotelcelle vekstsupplement (ECGS). PVECs dyrket i ECCM viste spindel formet morfologi konsekvent. Den rottehjerne ECGM inneholder 10% føtalt bovint serum, vekstfaktorer, og VEGF. PVECs dyrket i dette mediet har meget langstrakte morfologi og ta lengre tid å oppnå confluency. Den DMEM-F12-medium supplert med 10% føtalt bovint serum, Glutamax og endotelial celleveksttilskudd, og det induserer proliferasjon mer enn andre medier. Selv PVECs dyrket i dette mediet viste svært rask vekst og oppnådd konfluens i fire dager, deres morfologi var flat eller mangekantet bare. Vi har vokst PVECs i ECCM for opptil tre passeringer uten tap av fenotype og funksjon. Derfor er ECCM det mediet som vi foretrekker for PVEC kultur.
PVECs cocultured med nevrale forløpere ved denne protokollen er sannsynlig å stimulere neurogenesis og neuronal migrasjon til far-større grad enn endotelceller fra voksen hjerne eller fra andre kilder og kan være verdifulle for å hjelpe utvinning av nevrologisk funksjon i hjerneslag, traumatisk hjerneskade eller neurodegeneration. Nevrale forløpere transplantert i den voksne hjernen har ofte blitt rapportert til stall og ikke klarer å migrere inn i regioner som krever nye nerveceller. Dette problemet er regnskapsført til fravær av substrater som letter neuronal migrasjon som radiale gliaceller guider ni. Blodkar blir i økende grad verdsatt som underlag for neuronal migrasjon 6,10,11. PVECs kan tilby en løsning for disse fastlåste nevrale forløpere på transplantasjonssider. Coimplantation av PVECs og nevroner i skadede områder av hjernen kan rette guidet migrasjon av nerveceller ved endotelceller og bidra til å oppnå funksjonell bedring. Den nære tilknytning av endotelceller med trekkende nevroner gjør dem også unikt egnet til å levere vekstfaktorer og morphogens direkte og selektivt innmigrerer nevroner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et National Alliance for forskning på schizofreni og depresjon (NARSAD) Young Investigator Award og National Institutes of Health innvilger R01NS073635 til AV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNase I | Sigma | D-4527 | |
| Collagen, Type 1 solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| DPBS | Quality Biologicals | 114057-131 | |
| EDTA | Fisher Scientific | M4055 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| MS column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| CD31 microbeads | Miltenyi Biotech | 130-097-418 | |
| MACS separator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Bioscience | 352350 | |
| Antibiotic and antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| 35 mm Culture dish | BD Bioscience | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352097 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352098 | |
| ECCM kit | BD Bioscience | 355054 | Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF, and Soybean Trypsin Inhibitor |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Bioscience | 354006 | |
| RBECGM | Cell Applications | R819-500 | |
| DMEM F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 305050-061 | |
| Tissue culture grade water | Life Technologies | 15230162 | |
| 0.25% Trypsin | Life Technologies | 15050 | |
| Soybean trypsin inhibitor | BD Bioscience | 5425 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Life Technologies | Q25021 | |
| CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0 | Life Technologies | C10608 | |
| Biotinylated Isolectin B4 antibody | Sigma | L2140 | |
| Anti-Von Willebrand factor | Sigma | F3520 | |
| Anti-CD31/PECAM-1 | BD Pharmingen | 550274 | |
| VECTASHIELD Hardset Mounting Media with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Ketamine | Butler Schein Animal Health Supply | 44028 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 1009 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Inverted microscope | Olympus CK-40 | CK-40 | |
| Fluorescent microscope | Olympus FSX-100 | FSX-100 | |
| Fine forceps | Roboz Surgical Instrument | 7 inox | |
| Fine microtip scissors | Roboz Surgical Instrument | RS5611 |
References
- Shen, Q., S, G., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
- Milner, R. A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system. BMC Neurosci. 8, 3 (2007).
- Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo. 19, 1469-1485 (2008).
- Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).
- Vasudevan, A., Bhide, P. G. Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale. Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).
- Won, C. K., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).
- Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).
- Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One. 6, (2011).
- Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain. 2, 461-466 (1999).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
