Summary
Denna video visar en enkel och tillförlitlig strategi för beredning av rena kulturer av endotelceller från embryonala framhjärnan inom 10-12 dagar och kommer att vara användbart för forskning fokuserad på många aspekter av cerebral angiogenes.
Abstract
Embryonala hjärnans endotelceller kan fungera som ett viktigt verktyg i studier av angiogenes och neurovaskulära utveckling och interaktioner. De två vaskulära nätverk av embryonala framhjärnan, pial och periventrikulär, är rumsligt distinkt och har olika ursprung och tillväxtmönster. Endotelceller från pial och periventrikulära vaskulära nätverk har unika genuttryck profiler och funktioner. Här presenterar vi ett steg-för-steg-protokoll för isolering, kultur, och verifiering av rena populationer av endotelceller från periventrikulär vaskulära nätverket (PVECs) hos embryonal framhjärna (telencefalon). I detta tillvägagångssätt är telencefalon saknar pial membran erhölls från embryonala dag 15-möss hackats, spjälkades med kollagenas / dispas och dispergerades mekaniskt till en enkelcellsuspension. PVECs renas från cellsuspension med användning av positiv selektering med anti-CD-31/PECAM-1 antikropp konjugerad till mikrokulor med hjälp av ett starkt magnetfältseparationsmetod. Renat celler odlas på kollagen 1 belagda kultur rätter i endotelceller kulturmedium tills de blir sammanflytande och ytterligare subkultur. PVECs erhålls med detta protokoll uppvisar kullersten och spindelformade fenotyper, som visualiseras genom faskontrast ljusmikroskopi och fluorescensmikroskopi. Renhet av PVEC kulturer etablerades med endoteliala cellmarkörer. I våra händer, är denna metod ett tillförlitligt och konsekvent ger rena populationer av PVECs. Detta protokoll kommer att gynna studier som syftar till att få mekanistiska insikter i framhjärnan angiogenes, förstå PVEC växelverkan och kors samtal med neuronala celltyper och har enorm potential för terapeutisk angiogenes.
Introduction
Angiogenes, nybildning av nervceller och neuronala migration är kritiska händelser i centrala nervsystemet (CNS) utveckling, reparation och förnyelse. Flera eleganta studier har visat att endotelceller stimulera neuronal proliferation och vice versa genom frisättning av lösliga faktorer och genom direkt kontakt. Vi fann det märkligt att i majoriteten av dessa studier 1-3, medan neuronala stamceller / neurala stamceller isoleras från den embryonala hjärnan, de samodlades med endotelceller från den vuxna hjärnan, andra vuxna vävnadskällor, eller med endothelial cell-linjer. Detta kan delvis bero på de tekniska svårigheterna med att isolera och odling rena populationer av endotelceller från den embryonala hjärnan. Men angiogenes, nybildning av nervceller, och neuronal migration är samtidiga händelser som inträffar i storleksordningar mer robust i den embryonala hjärnan än i normala vuxna hjärnan. Den periventrikulär vaskulära nätverket av embryonic framhjärnan (telencefalon) kommer från ett fartyg som ligger i de basala ganglierna primordium och utvecklas i form av en ordnad gradient från ventrala till bröst-telencefalon från embryonala dag 11 (E11) 4,5. Denna plexus av kärlen i periventrikulär vaskulära nätverket skiljer sig från pial fartyg baserat på ursprung, anatomisk lokalisation, tillväxtmönster och utvecklings reglering 4,5. Utbredningsriktningen för periventrikulär angiogenes lutning matchar telencephalic tvärgående neurogenetiska lutning. Inom telencephalon, överlappar den periventrikulär angiogenes gradienten och gradienten av GABA nervceller migrerar tangentiellt spatialt samt 6. Med avseende på timing, är angiogenes-gradient i förskott av neurogenetiska gradienten och GABA-neuron-gradient av omkring en dag. Således periventrikulära endotelceller är rumsligt och tidsmässigt väl positionerat för att ge viktiga ledtrådar för att stödja telencephalic neurogenes ochneuronal migration 4,6. Därför skulle användning av embryonala periventrikulära endotelceller i samodling experiment med neuronala stamceller och / eller nervceller ger en mer gynnsam modell för att studera neurovaskulära interaktioner och utveckla nya vägar för behandling av neurodegenerativa sjukdomar eller ischemisk / traumatisk hjärnskada.
Vi betonar vikten av att ta bort den pial membran, inte bara för att begränsa epitelial cellerna kontamineras, utan också för att separera pial endotelceller som är molekylärt och funktionellt distinkt från endotelceller i periventrikulär vaskulära nätverket 4,6 (kallas PVECs att skilja från pial EC) . Här beskriver vi den metod som vi rutinmässigt använder i vårt laboratorium för att få en rik och ren avkastning PVECs. Dessa endotelceller är beredda från embryonala framhjärnorna isolerat från en enda tidsinställd-gravid mus. De kan utökas, subkultiveras, och fryses ned med framgång för framtida bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av reagenser och lösningar
- Beläggning av 35 mm odlingsskål: kollagen typ 1-lösning tillförs som en vattenlösning i 20 mM ättiksyra (~ 100 mg protein / injektionsflaska). Späd en lämplig volym av kollagenlösningen till en arbetskoncentration av 0,01% med användning av steril vävnadskulturgrad vatten. Coat rätter med en ml av kollagenlösningen efter 3-4 h vid rumstemperatur (RT) eller 37 ° C eller över natten vid 2-8 ° C. Ta bort överflödig lösning från den belagda skålen och låt den torka över natten. Skölj skålen med vävnadskulturgrad vatten eller PBS innan du lägger media. Belagda rätter kan lagras vid 4 ° C i en månad.
- Förbered komplett Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM). Komplettera DMEM (500 ml) med 10% FBS och antibiotika-antimykotika-lösning (1 x koncentration; 1 ml/100 ml). Komplett DMEM kan lagras vid 4 ° C under två månader.
- Framställ en alikvot (50 ml) av DMEM med DNas I (0,001 mg / ml), (hänvisad till som DMEM-DNas I).
- Förbered en alikvot (10 ml) i DMEM med kollagenas och dispas (1 mg / ml) (kallas DMEM-collagenase/dispase).
- Förbered Endothelial cellkulturmedium (ECCM, 500 ml), kompletterat med EGF (5 mikrogram), ECGS (100 mg) och 5 pl av antibiotika-antimykotika lösning. ECCM kan lagras vid 4 ° C under två månader.
- Prewarm alla medier före användning.
- Förbered Rening buffert: PBS, pH 7,2 med 0,5% BSA och 2 mM EDTA. Behåll buffert kallt (2-8 ° C).
2. Borttagning av embryon och Dissektion av telencefalon
Alla experiment med försöksdjur är godkända av Animal Care och användning kommittéer McLean Hospital och uppfyller NIH riktlinjer för vård och användning av försöksdjur.
- Använd tidsinställda gravida CD 1-möss (embryonal dag 15). Dagen för vaginal plugg upptäckten anses embryonala dag 0 (E0). CD1 dammar producerar vanligen stora kullar, så 10-12 embryos väntas från en gravid dammen.
- För hysterotomi, söva gravida möss med en intraperitoneal injektion av ketamin (100 mg / kg) / xylazin (5 mg / kg). För möss cirka 20-30 g, levererar 0,3 ml av en 10 ml / kg ketamin / Xylazine bedövningsmedel lösning och se till att smärta och ångest är minimal under intraperitoneala injektioner av bedövningsmedel. Använd återhållsamhet hand för injektionerna.
- Kontrollera djup anestesi med tå nypa. Ta bort embryon från djupt sövda möss. Halshugga varje embryo omedelbart när det tas från modern. Placera embryonala huvuden i sterila petriskålar i iskall PBS.
- Följ hysterektomi med omedelbar dödshjälp med bedövningsmedel överdos (130 mg / kg pentobarbital, ip), en metod för dödshjälp, vilket överensstämmer med de AVMA Riktlinjer för eutanasi av djur: 2013 Edition.
- Under ett stereomikroskop, ta bort hjärnan från huvudet med fina microtip sax och fin pincett. Anm: En högkvalitativ dissekerajon är nödvändig för att framgångsrikt avlägsna pial membranet från den embryonala hjärnan. Detta uppnås genom praktiken. Fin pincett och microtip saxar är också viktiga verktyg för att få ett bra dissektion.
- Använd pincett för att få ett fast grepp om hjärnan och microtip sax för att skala bort pial membranet. Ta bort mitthjärnan och metencephalon och isolera telencefalon. Överför pial fria telencefalon från alla embryon till en 35 mm odlingsskål med 2 ml PBS i is.
3. Cellisolering
- Finhacka telencephalon till 1-2 mm fragment med ett skalpellblad och samla in vävnad i ett 15 ml Falcon-rör innehållande 2 ml komplett DMEM.
- Dissociera vävnaden försiktigt men grundligt med en 1 ml pipett tills klumpar försvinner och en mjölkaktig suspension erhålls.
- Centrifugera dissocierade celler vid 800-1000 x g under 5 min vid rumstemperatur.
- Ta försiktigt bort supernatanten och suspendera pelleten i DMEM-DNas I. försiktigt dissociera cells igen med 1 ml pipett och centrifugera vid 800-1000 x g under 5 min vid rumstemperatur.
- Återsuspendera pelleten i varm fullständigt DMEM. Filter celler genom en steril 70 um nylonnät. Samla filtrerade celler och hålla på is.
- Samla cellpartier kvarhålls på nätet och smälta ytterligare med DMEM-collagenase/dispase (2 ml) under 1-2 min vid rumstemperatur. Tvätta cellerna 3x i DMEM-DNas genom centrifugering vid 800-1000 xg under 5 minuter vid RT. Pool dessa celler med de filtrerade celler som samlats in i steg 3,5. Tvätta totala celler en gång med fullständigt DMEM. Gå vidare för att bestämma cellantalet och magnetiska märkningsstegen. OBS: Det är viktigt att få en encelliga suspension innan magnetisk märkning.
4. Magnetisk märkning
- Detta protokoll visar magnetisk märkning av 10 7-celler. För cell nummer är lägre än 10 7, använder samma reagensvolym och för cell nummer större än 10 7, skala upp alla reagensvolymer och totala volymerenlighet med detta (t.ex. för 2 x 10 7 totala celler, använd två gånger volymen av alla indikerade reagenser). Förvara alla reagenser och celler i is.
- Bestäm antalet celler med en hemocytometer.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 300 x g under 10 min vid rumstemperatur. Sug ut supernatant helt.
- Lägg 90 μl/10 7 celler av rening buffert till cellpelleten, följt av 10 pl av CD31 mikrokulor. De Microbeads tillhandahålls av tillverkaren är konjugerade till monoklonala anti-mus-CD31-antikropp.
- Blanda väl och inkubera under 15 minuter i kylskåp. Obs! Högre temperaturer och / eller längre inkubationstiden under magnetisk märkning kan resultera i icke-specifik bindning.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 1 till 2 ml/10 7 celler av rening buffert och centrifugera vid 300 xg under 10 min. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 500 l av reningsbuffert. Gå vidare till magnetisk separation eller reningssteg.
5. Purification
- Placera MS-kolonn i det magnetiska fältet av MACS avskiljare.
- Skölj kolonnen med 500 l av reningsbuffert.
- Applicera cellsuspension på kolonnen. Fyll på lämpligt antal celler för att MS-kolonn såsom högre celltal kan täppa till kolonnen. Varning: Varje MS kolumn rymmer ett antal av högst 2 x 10 7 celler, för en högre cellnummer, använda flera kolumner.
- Samla in och kasta genomströmning innehåller omärkta celler.
- Tvätta kolonnen med 500 l av reningsbuffert tre gånger. Under tvättsteg, se till att kolumnen behållaren är tom innan du lägger efterföljande rening buffert portioner.
- Ta kolumn från MACS separator och placera den på en 15 ml Falcon rör.
- En kolv tillförs tillsammans med MS-kolonn. Pipettera 1 ml reningsbuffert har laddats in i MS-kolumnen och omedelbart spola ut magnetiskt märkta cellerna genom att stadigt trycka in kolven i kolonnen.
- Plansch cells på en 35 mm odlingsskål förbelagts med kollagen typ 1 och växer celler i ECCM i en inkubator inställd på 37 ° C med 95% O2 och 5% CO2.
- Ändra mediet var fjärde dag. Använd PVECs för experiment eller subkultur efter 10-12 dagar när skålen är sammanflytande.
6. Subkultur av PV ECS
- Avlägsna ECCM och skölj monolager av PVECS med 1-2 ml steril PBS.
- Försiktigt lägga 1,5 ml 0,25% trypsin-EDTA-lösning för att täcka cellmonoskiktet.
- Återgå skålen till inkubatorn. Inom 5-7 min, kommer celler lossnar från ytan av skålen.
- När cellerna har fristående, omedelbart lägga en lika stor volym av trypsin inhibitor och mal sönder flera gånger.
- Överför cellerna till en steril 15 ml Falcon-rör. Centrifugera röret vid 500 xg under 5 min.
- Avlägsna supernatanten och suspendera pelleten i 1 ml förvärmd ECCM.
- Seed cellerna för att expandera kulturen, imåldrande eller andra analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den fenotypisk karakterisering av PVECs från dag 1-12 visas av fas-kontrast ljusmikroskop (Figur 2). De celler fästa till skålen på dag 1 visar morfologi karakteristisk för celldelning (Figur 2A). Mellan 5-8 dagar, till PVECs övergång från kullersten spindel formad morfologi som är typiskt för endotelceller och mer besläktad med dess in vivo-tillstånd (figur 2B och 2C). Vid dag 12 i PVEC kulturen uppnår fullt sammanflödet (figur 2D). PVECs kan subodlas lätt att expandera kolonin (figurerna 2E-G). Renhet av endothelial cellkulturer etablerades med endothelial cellmarkörer - isolectin B4, CD-31/PECAM-1, von Willebrand-faktor (vWF) och VE-cadherin och var fast besluten att vara hundra procent efter subkultur (figur 2H-K).
Hög förstoring bilder av PVECs beredd från CD1 embryon samt Tie2-GFP embryon 4 (vars endotel celler uttrycker GFP) visas (Figur 3). Förutom den gemensamma gatsten och spindelformad morfologi (fig. 3A-C), var polygonala morfologier med slanka processer också observerats i isolectin B4-märkta och Tie2-GFP + ve PVECs (figurerna 3D och 3E). I vissa av våra kollagenbelagda odlingsskålar (i frånvaro av Matrigel) PVECs bildade gittermönster som liknar den unika egenskapen av den in vivo periventrikulär vaskulära nätverket (Figur 3F). Detta återspeglar den höga angiogena potential PVECs. En angiogenes analys utfördes i vilka PVECs (2 x 10 4 celler) tillsattes till odlingsskålar belagda med Matrigel matris. PVECs visade robust tub bildas inom 18 timmar (figur 3G). Dessa resultat ger starka bevis för att detta system kan användas som en in vitro-endotelcell-modell. PVECs isoleradefrån CD1 embryon kan snabbt märkas med Qdot nanokristaller (figur 3H) som levererar intensiv stabil fluorescens i cytoplasman av levande celler och kan användas för långtidsstudier av levande PVECs, inklusive migration, rörlighet, morfologi, cellfunktionsanalyser som såväl som in vivo experiment. PVECs kan transfekteras med cellspårämnen som Celljusstyrka Plasma Membrane-RFP, BacMam 2,0 (Figur 3I) enligt tillverkarens instruktioner för tydlig visualisering av cellmorfologi i levande cell imaging experiment.
Vi odlade PVECs inte bara i ECCM, men också i råtthjäma endotelcell-tillväxtmedium (RBECGM) och DMEM-F12-medium. Både faskontrast (fig. 4A, 4C och 4E) och isolectin B4 märkta bilder (figurerna 4B, 4D och 4F) av PVECs odlade i ECCM (fig. 4A och 4B), RBECGM (Figurerna 4C och
Figur 1. Schematisk bild av PVEC isolering. Det protokoll som används för isolering och purification av PVECs från embryonala telencefalon sammanfattas i ett schema. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Fenotypisk karakterisering av PVECs. (AG) Fas kontrastbilder av PVEC kultur vid olika tidpunkter efter plätering. (A) PVEC kulturen på dag 1. Celler har fäst och visa skilje morfologier. (B) PVEC kulturen på dag 5 och (C) på dag 8 övergår från gatsten till spindelform morfologi. (D) PVEC kulturen uppnådde konfluens på dag 12. (E) PVECs efter subkultur på dag ett, (F) dag 5 (G (HJ) immunomärkning av PVECs använder endothelial cellmarkörer: isolectin B4 (H), von Willebrand-faktor (I), CD31/PECAM (J) och VE-cadherin (K). Skala barer: A, 100 nm (gäller BJ), K, 50 pm. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Morfologier av PVECs. (AE) Hög förstoring bilder av isolectin B4-märkta och Tie2-GFP + ve PVECs visar kullersten och spindelformade morfologi (AC) samt polygonal morfologi med smala långa förlängningar (D, E). (<strong> F) PVECs visar hög angiogena potential i odlingsskål, även i frånvaro av Matrigel. (G) PVECs visar robust tub bildning i en angiogenesanalys på Matrigel. (H) PVECs märkta med Qdot nanokristaller. (I) PVECs transfekterade med Celljusstyrka plasmamembran-RFP, BacMam 2.0. Skala barer: A, 50 um, B, 15 m (gäller CE), F, 100 nm (gäller G, H), jag, 50 pm. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. PVECs odlas i olika odlingsmedier show variant morfologi. (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PVEC: s är mer fysiologiskt relevant än vuxna hjärnans endotelceller och EC från andra källor vävnad för studier som fokuserar på neurovaskulära interaktioner och även har terapeutisk potential. För PVEC förberedelser, är det kritiskt början med dissektion att arbeta snabbt för att uppnå en god lönsamhet sedan döda celler kan binda ospecifikt till CD31 mikrokulor. Dessutom, om encelliga fjädring inte uppnås före den magnetiska steg märkning, kommer detta att resultera i felsökning eftersom cellklumpar kommer att täppa till kolonnen. En fördel med denna metod är att det inte finns något behov av inkubation med trypsin för att lösgöra cellerna från magnetiska pärlor, en tidskrävande och ofta svåra steg som används i andra magnetisk pärla baserade separationsmetoder för EC beredningar 4,7. Dessutom går detta isoleringsteknik inte kräver stora mängder embryonal hjärnvävnad. PVEC s konsekvent kan framställas med användning av en enda tids gravid mus i caoximately 12 dagar subodlades, och används i en mängd olika in vitro-och in vivo-experiment.
Renheten hos PVECs efter isolering är över 90% men renheten hos PVECs efter subkultur är 100%. Förutom endotelceller är PECAM-1 som finns på ytan av monocyter / makrofager. Mikroglia, är makrofag befolkningen i CNS dock mycket låg i den embryonala mus hjärna jämfört med postnatal eller vuxna hjärnan 8. Monocyter / mikroglia behöver mediet kompletteras med 10% fetalt kalvserum och specifika tillväxtfaktorer för att växa, de kommer att dö ut så småningom i ECCM och kommer inte att pågå efter subkultur av PVECs. När det behövs 100% rena PVECs omedelbart efter isolering (till exempel för att testa genuttryck), använder vi fluorescens aktiverad cell sorteringsmetod (FACS). PVECs isoleras sedan från Tie2GFP embryon (i vilken endast endotelceller uttrycka GFP) och stringent sortering genom dubbel FACS-analys. Renheten av sorterat endotelL-celler säkerställs genom insamling av celler som är dubbla positiva för GFP och CD31/PECAM-1 6.
Kulturer är också noga observeras under den första veckan av isolering för kontaminerande celltyper som pericyter. Sedan pericyte celler är oregelbundet formade och kommer aldrig att bilda ett sammanflytande monoskikt i motsats till endotelceller, vilka består av spindelformade eller polygonala, kontaktade celler som växer som kolonier, de är lätta att känna igen om de är närvarande. Om kontamination pericyte upptäcks, en lägre koncentration av trypsin (0,05%), följt av en snabb trypsinization förfarande (2-3 min) används för subkultur av PVECs. Pericyter kräver ett utökat trypsinization tid (7-10 min) och förblir bifogas. Vidare är pläteringen effektivitet trypsinerade pericyter (om någon) mycket dålig. Dessa steg eliminerar föroreningar pericyte och se till att subkultiverades PVECs är rena.
Den ECCM medium är en låg serummedium innehållande hydrokortison,heparin och 2% fetalt bovint serum och är kompletterat med epidermal tillväxtfaktor (EGF) och Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS). PVECs odlas i ECCM visade spindel formade morfologi konsekvent. Den råtthjäma ECGM innehåller 10% fetalt bovint serum, tillväxtfaktorer och VEGF. PVECs odlas i detta medium har mycket avlånga morfologier och tar längre tid att uppnå sammanflytning. Den DMEM-F12-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum, GlutaMAX och endotelcelltillväxt tillskott och den inducerar mer spridning än andra medier. Även PVECs odlas i detta medium uppvisade en mycket snabb tillväxt och uppnått sammanflytande i 4 dagar, deras morfologier var platt eller endast polygonal. Vi har vuxit PVECs i ECCM för upp till tre passager utan förlust av fenotyp och funktion. Därför är ECCM det medium som vi föredrar för PVEC kultur.
PVECs samodlades med neuronala prekursorer av detta protokoll kommer sannolikt att stimulera nybildning av nervceller och neuronala migration till far-större utsträckning än endotelceller från vuxen hjärna eller från andra källor och kan vara värdefull för medhjälp återhämtning av neurologisk funktion vid stroke, traumatisk hjärnskada eller neurodegeneration. Neuronala prekursorer transplanterade i den vuxna hjärnan har ofta rapporterats att stall och misslyckas med att migrera in i områden som kräver nya nervceller. Detta problem stod till frånvaron av substrat som underlättar neuronal migration liknande radiella gliaceller styrningar 9. Kärl alltmer uppskattad som substrat för neuronal migration 6,10,11. PVECs kan erbjuda en lösning för dessa avstannade neuronala prekursorer vid transplantationssajter. Coimplantation av PVECs och nervceller i skadade hjärnregioner kan underlätta guidad vandring av nervceller av endotelceller och bidra till att uppnå funktionell återhämtning. Nära anknytning endotelceller med migrerar nervceller gör dem också unikt anpassad för att leverera tillväxtfaktorer och morfogener direkt och selektivt tillmigrerar nervceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en National Alliance för forskning om schizofreni och depression (NARSAD) Young Investigator Award och National Institutes of Health bevilja R01NS073635 till AV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNase I | Sigma | D-4527 | |
| Collagen, Type 1 solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| DPBS | Quality Biologicals | 114057-131 | |
| EDTA | Fisher Scientific | M4055 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| MS column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| CD31 microbeads | Miltenyi Biotech | 130-097-418 | |
| MACS separator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Bioscience | 352350 | |
| Antibiotic and antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| 35 mm Culture dish | BD Bioscience | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352097 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352098 | |
| ECCM kit | BD Bioscience | 355054 | Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF, and Soybean Trypsin Inhibitor |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Bioscience | 354006 | |
| RBECGM | Cell Applications | R819-500 | |
| DMEM F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 305050-061 | |
| Tissue culture grade water | Life Technologies | 15230162 | |
| 0.25% Trypsin | Life Technologies | 15050 | |
| Soybean trypsin inhibitor | BD Bioscience | 5425 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Life Technologies | Q25021 | |
| CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0 | Life Technologies | C10608 | |
| Biotinylated Isolectin B4 antibody | Sigma | L2140 | |
| Anti-Von Willebrand factor | Sigma | F3520 | |
| Anti-CD31/PECAM-1 | BD Pharmingen | 550274 | |
| VECTASHIELD Hardset Mounting Media with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Ketamine | Butler Schein Animal Health Supply | 44028 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 1009 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Inverted microscope | Olympus CK-40 | CK-40 | |
| Fluorescent microscope | Olympus FSX-100 | FSX-100 | |
| Fine forceps | Roboz Surgical Instrument | 7 inox | |
| Fine microtip scissors | Roboz Surgical Instrument | RS5611 |
References
- Shen, Q., S, G., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
- Milner, R. A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system. BMC Neurosci. 8, 3 (2007).
- Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo. 19, 1469-1485 (2008).
- Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).
- Vasudevan, A., Bhide, P. G. Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale. Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).
- Won, C. K., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).
- Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).
- Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One. 6, (2011).
- Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain. 2, 461-466 (1999).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
