Summary
Bu video 10-12 gün içinde embriyonik ön beyin endotel hücreleri saf kültürlerin hazırlanması için kolay ve güvenilir bir strateji gösterir ve serebral damar birçok açıdan odaklanmış araştırma için yararlı olacaktır.
Abstract
Embriyonik beyin endotel hücreleri anjiyogenez ve nörovasküler gelişim ve etkileşim çalışmasında önemli bir araç olarak hizmet edebilir. Embriyonik ön beyin, PIAL ve periventriküler iki damar ağları, mekansal farklı ve farklı kökenleri ve büyüme desenler var. Pial ve periventriküler damar ağlarından endotel hücreleri benzersiz gen ekspresyon profillerini ve işlevleri vardır. Burada embriyonik ön beyin (telencephalon) periventriküler damar ağı (PVECs) endotel hücrelerinin saf popülasyonlarının izolasyonu, kültür ve doğrulama için bir adım adım protokol mevcut. Bu yaklaşımda, embriyonik gün 15 farenin elde pial membran yoksun telencephalon, doğrandı kolajenaz / dispaz ile sindirilir ve tek bir hücre süspansiyonu içine mekanik olarak dağıtılabilir. PVECs güçlü bir manyetik kullanılarak mikro, konjüge anti-CD-31/PECAM-1 antikoru ile pozitif seçim kullanılarak hücre süspansiyonundan saflaştınlırayırma yöntemi. Bunlar birbirine karıştırılmış ve bundan başka, alt-kültürlenmiş olana kadar saflaştırılmış hücreler, endotelyal hücre kültür ortamı içinde 1 kollajen kaplı kültür tabakları üzerinde kültürlenmiştir. Faz-kontrast ışık mikroskobu ve floresan mikroskobu ile görüntülenmiştir gibi PVECs, bu protokol sergi parkelerde ve iğ biçimli fenotipleri ile elde. PVEC kültürlerin saflığı endotel hücre belirleyicileri ile kurulmuştur. Bizim ellerde, bu yöntem güvenilir ve tutarlı PVECs saf popülasyonları verir. Bu protokol, ön beyin anjiyojenezde içine mekanik bakış açısı kazanıyor PVEC etkileşimleri ve nöronal hücre tipleri ile çapraz görüşmeleri anlayış ve terapötik anjiyogenez için muazzam bir potansiyele sahiptir hedefleyen çalışmaları yararlanacaktır.
Introduction
Anjiyogenezis, nöron ve nöronal göç merkezi sinir sistemi (MSS) geliştirme, onarım ve rejenerasyon kritik olaylar. Çeşitli çalışmalar, zarif, endotel hücreleri, çözünebilir faktörleri serbest bırakılması yoluyla ve doğrudan temas ile nöronal proliferasyonu ve tersi uyardığını göstermiştir. Biz meraklı nöronal progenitorlar / nöral kök hücre, embriyonik beyninden izole ise bu çalışmaların çoğunda 1-3, bunlar yetişkin beyin, diğer yetişkin doku kaynakları, veya endotelyal hücre hatları ile endotel hücreleri ile kültürlenmiş olduğu bulundu. Bu kısmen embriyonik beyin endotel hücreleri popülasyonları saf izole edilmesi ve kültür ile ilgili teknik zorluklar nedeniyle olabilir. Ancak, anjiyogenez, nöron oluşumu, ve nöronal migrasyon, normal erişkin beyinde daha embriyonik beyinde daha sağlam büyüklükte emir meydana gelen eşzamanlı olaylardır. Embryoni ait periventriküler damar ağıc ön beyin (telencephalon) bazal ganglia primordiumunun içinde yer alan bir kaptan kaynaklanan ve embriyonik gün 11 (E11) 4,5 ile telencephalon dorsal ventral gelen düzenli bir gradyan şeklinde gelişir. Periventriküler damar ağı damarlarının Bu pleksus kökenleri, anatomik konumu, büyüme modelleri ve gelişim düzenlemesi 4,5 dayalı Pial gemiler farklıdır. Periventriküler anjiyogenez degrade yayılma yönü telencephalic enine nörogenetik degrade eşleşir. Telencephalon içinde, periventriküler anjiyogenez degrade ve göç GABA nöron degrade teğet yanı sıra mekansal 6 çakışıyor. Zamanlama ile ilgili olarak, anjiyojenez gradyan yaklaşık bir gün ile nörogenetik gradyanı ve GABA nöron gradyanı önceden olduğu. Böylece, periventriküler endotel hücreleri mekansal ve zamansal iyi telencephalic nörogenezi desteklemek için kritik ipuçları sağlamak için konumlandırılmış venöronal migrasyon 4,6. Bu nedenle, nöronal soylarının ve / veya nöronlarla kokültürü deneylerde embriyonik periventriküler endotel hücrelerinin kullanımı nörovasküler etkileşimlerin incelenmesinde ve nörodejeneratif hastalık veya iskemik / travmatik beyin hasarı tedavisi için yeni yollar geliştirmek için daha uygun bir modeli sağlayacaktır.
Biz, epitel hücre bulaşma sınırlamak için değil, aynı zamanda moleküler ve periventriküler damar ağı 4,6 (Pial EC'ler ayırmak adlandırılır PVECs) endotel hücrelerinden fonksiyonel olarak farklı olan Pial endotel hücreleri ayırmak için değil, sadece Pial membran kaldırma önemini vurgulamaktadır . Burada, biz rutin PVECs zengin ve saf verim elde etmek bizim laboratuvarımızda kullandığımız yöntem tarif. Bu endotel hücreleri, tek bir zaman ayarlı gebe fare izole edilmiş embriyonik forebrains hazırlanır. Onlar ileride kullanmak için başarılı bir şekilde, genişletilmiş alt kültürleri ve aşağı donmuş olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Reaktifler ve Çözümleri hazırlanması
- 35 mm kültür çanağı Kaplama: Kolajen Tip 1 çözeltisi, 20 mM asetik asit (~ 100 mg protein / şişe) içinde bir sulu çözelti olarak temin edilir. Steril doku kültürü dereceli su kullanarak,% 0.01 'lik bir konsantrasyona kadar çalışma kollajen çözeltisinin uygun bir hacmi ile seyreltilir. 1, oda sıcaklığında (RT) 3-4 saat boyunca kollajen çözeltisinin ml ya da 37 ° C arasında veya bir gece boyunca 2-8 ° C'de kaplayın yemekler Kaplı çanak aşırı çözüm çıkarın ve bir gecede kurumasını bekleyin. Medya eklemeden önce doku kültürü dereceli su veya PBS ile çanak durulayın. Kaplı yemekler bir ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
- Tam Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) hazırlayın. (, 1 ml/100 ml konsantrasyonu 1x),% 10 FBS ve antibiyotik-antimikotik çözelti ile DMEM (500 mi) Ek. Tam DMEM iki ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
- Bir kısım DNase I (0.001 mg / ml) ile birlikte DMEM (50 mi) Hazırlama, (D olarak anılacaktırMEM-DNase I).
- Kolajenaz ve dispaz (DMEM-collagenase/dispase olarak anılacaktır) (1 mg / ml) ile birlikte DMEM bir kısım (10 ml) hazırlayın.
- EGF (5 ug) ile takviye edilmiş endotel hücre kültür ortamı (ECCM, 500 mi), hazırlama, ECGS (100 mg) ve antibiyotik-antimikotik çözelti 5 ul. ECCM iki ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
- Kullanmadan önce tüm medya Prewarm.
- % 0.5 BSA ve 2 mM EDTA ile PBS, pH 7.2 Saflaştırma tamponu hazırlayın. Soğuk tampon Ol (2-8 ° C).
2. Telencephalon Embriyolar Dissekan Kaldırma
Laboratuvar hayvanları kullanan tüm deneyler McLean Hastanesi hayvan bakım ve kullanım komiteleri tarafından onaylanan ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için NIH yönergelere uygun edilmektedir.
- Zamanlanmış hamile CD1 fareleri (embriyonik gün 15) kullanın. Vajinal fiş keşif günü embriyonik gün 0 (E0) olarak kabul edilir. CD1 barajlar genellikle büyük ibrelerin üretmek, yani 10-12 embriyos hamile baraj bekleniyor.
- Histerotomi için, Ketamin (100 mg / kg) / ksilazin (5 mg / kg) intraperitonal enjeksiyonu ile anestezi hamile farelere. Farenin yaklaşık 20-30 g, bir 10 ml / kg Ketamin / Ksilazin anestetik çözeltisi 0,3 ml sunmak ve bu ağrı sağlar ve tehlikeli anestezik intraperitoneal enjeksiyonu sırasında az. Enjeksiyonlar için el kısıtlama kullanın.
- Ayak tutam ile derin anestezi edin. Derin anestezi farelerden embriyolar çıkarın. Hemen anneden uzaklaştırılması üzerine her embriyo başını kesmek. Buz soğukluğunda PBS içinde steril Petri kaplarında embriyonik kafaları yerleştirin.
- 2013 Sürümü: anestezik aşırı doz (130 mg / kg pentobarbital, ip), Hayvanların ötanazi AVMA Yönergeleri ile tutarlıdır ötenazi için bir yöntem ile hemen ötenazi histerektomi izleyin.
- Stereo mikroskop altında, ince mikrotip makas ve ince forseps ile baş beyin kaldırmak. Not: Yüksek kaliteli bir teşrihiyon başarıyla embriyonik beyinden Pial membran kaldırmak için gereklidir. Bu uygulama ile elde edilir. Ince forseps ve mikrotip makas aynı zamanda iyi bir diseksiyon almak için önemli araçlardır.
- Pial zardan soymak için beyin ve mikrotip makas bir tutuş elde etmek için forseps kullanabilir. Mesencephalon ve metencephalon çıkarın ve telencephalon izole. Buz içinde 2 ml PBS ile bir 35 mm kültür çanağı için her embriyolardan Pial içermeyen telencephalon aktarın.
3. Hücre İzolasyonu
- Bir neşter ile 1-2 mm parçalar halinde telencephalon kıyma ve tam DMEM 2 ml ihtiva eden bir 15 ml Falcon tüpüne doku toplamak.
- Kümeleri kaybolur ve sütsü süspansiyon elde edilene kadar, 1 ml'lik bir pipet ile yavaşça ancak iyice doku ayrıştırmaları.
- Santrifüj, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800-1.000 xg'de hücreleri ayrışmış.
- Dikkatli ce ayırmak yavaşça DMEM-DNase I süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarınLLS tekrar oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800-1.000 xg'de 1 ml pipet ve santrifüj kullanılarak.
- Sıcak tam DMEM'de pelletini. Steril bir 70 um naylon elekle filtre hücreleri. Süzülür hücreleri toplamak ve buz tutmak.
- Meşin üzerinde tutulan hücreye bölümlerini toplamak ve oda sıcaklığında 1-2 dakika boyunca DMEM-collagenase/dispase (2 mi) ile daha da kolaylaştırırlar. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800-1.000 xg santrifüj yoluyla DMEM-DNase I hücreler 3 kez yıkayın. Adım 3.5, toplanan süzülmüş hücrelerle, bu hücreleri havuzda toplayın. Bitmiş DMEM ile bir kez toplam hücrelerin yıkayın. Hücre sayısı ve manyetik etiketleme adımları belirlemek için devam edin. Not: Bu manyetik etiketleme önce, tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için önemlidir.
4. Manyetik Etiketleme
- Bu protokol, 10 7 hücrelerinin manyetik etiketleme göstermektedir. Hücre sayıları 10'dan az 7, aynı reaktif hacmi kullanımı ve hücre sayıları 10'dan büyük 7, tüm reaktif hacimlerini ve toplam birimler büyütmekbuna göre (örneğin 2 x 10 7 toplam hücre için, gösterilen tüm reaktiflerin iki hacmi kullanın). Buz içinde tüm reaktifler ve hücreler tutun.
- Bir hemositometreyle ile hücre sayısını belirlemek.
- Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin hücre süspansiyonu. Aspire tamamen yüzer.
- CD31 mikro, 10 ul ve ardından hücre pelletine arıtma tamponu 90 μl/10 7 hücreleri ekleyin. Üretici tarafından sağlanan mikro-anti-fare CD31 monoklonal antikoru konjuge edilir.
- İyice karıştırın ve buzdolabında 15 dakika boyunca inkübe edin. Not: Manyetik etiketleme sırasında yüksek sıcaklıklar ve / veya daha uzun bir enkübasyon süresi spesifik olmayan bağlanma ile sonuçlanabilir.
- 10 dakika boyunca 300 xg'de arıtma tampon ve santrifüj 1-2 ml/10 7 hücreleri eklenerek hücreler yıkayın. Arıtma tampon 500 ul süpernatan ve hücreler tekrar süspansiyon çıkarın. Manyetik ayırma veya saflaştırma aşamasına geçin.
5. Puaralığında olacak şekilde yapılır
- MACS Ayırıcı manyetik alan MS sütun yerleştirin.
- Arıtma tampon 500 ul ile sütun durulayın.
- Kolona hücre süspansiyonu uygulanır. Yüksek bir hücre sayısı sütunu tıkayabilir olarak MS kolona hücrelerin uygun sayıda yükleyin. Dikkat: Her MS sütun daha sütunları kullanmak, daha yüksek bir hücre sayısı için 2 x 10 7 hücre sayısını ağırlayacak.
- Toplayın ve etiketsiz hücreleri içeren flow-through atın.
- Arıtma tampon 500 ul üç kez sütun yıkayın. Yıkama adımları sırasında, kolon rezervuar müteakip arıtma tampon bölüntülerin eklemeden önce boş olduğundan emin olun.
- MACS ayırıcı gelen sütun çıkarın ve 15 ml Falcon tüp üzerine yerleştirin.
- Bir piston MS sütunu ile birlikte temin edilir. Pipet MS kolona ve hemen arıtma tampon 1 ml sıkıca sütuna pistonu iterek manyetik etiketli hücreleri yıkayın.
- Plaka celKollajen Tip 1 ile kaplanmış ve% 95 O 2 ve% 5 CO 2 ile 37 ° C'ye ayarlanmış bir kuluçka ECCM hücreleri büyümek bir 35 mm kültür çanak ls.
- Her dört gün orta değiştirin. Çanak konfluent olduğunda, 10-12 gün sonra deney ya da alt-kültür için PVECs kullanın.
6. PV ECS alt kültür
- ECCM çıkarın ve steril PBS içinde 1-2 ml PVECS olan tek tabaka durulayın.
- Yavaşça hücre tek katmanının karşılamak için% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi 1,5 ml ekleyin.
- Inkübatör tabak dönmek. 5-7 dakika içinde, hücreler tabak yüzeyinden ayırır.
- Hücreler müstakil hemen sonra tripsin inhibitörü eşit hacimde ve birkaç kez çiğnemek.
- , Steril bir 15 ml Falcon tüpüne hücreleri aktarın. 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj tüpü.
- Süpernatantı ve prewarmed ECCM 1 ml pelletini.
- Kültür, im genişletilmesi için hücreleri tohumyaşlanma ya da başka deneyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Günde 1-12 dan PVECs fenotipik karakterizasyonu faz kontrast mikroskopisi ile (Şekil 2) ile gösterilir. Hücre bölünmesi (Şekil 2A) 1. gün gösteri morfolojisi karakteristik çanak bağlı hücreler. 5-8 gün arasında, taş taş PVECs geçiş endotel hücreleri ve (Şekil 2B ve 2C) ile in vivo duruma daha yakındır için tipik şekilli morfolojiye mili için. 12. günde kültür tarafından PVEC tam izdiham (Şekil 2B) elde edilir. PVECs koloni (Şekil 2E-G) genişletmek için kolayca pasajlandı edilebilir. Endotel hücre kültürleri saflığı endotel hücre işaretleyicileri ile kuruldu - Isolectin B4, CD-31/PECAM-1, Von Willebrand Faktörü (vWF) ve VE-cadherin ve alt kültür (Şekil 2H-K) sonra yüzde yüz olduğu belirlenmiştir.
PVECs Yüksek büyütme görüntüleri CD1 embriyo yanı sıra hazırlanan Kravat2-GFP embriyolar 4 (olan endotel hücreleri GFP ifade) (Şekil 3) gösterilmektedir. Ortak parke ve mil şeklindeki morfoloji (Şekiller 3A-C) ek olarak, ince süreçlerle çokgen morfolojileri da gözlenmiştir isolectin B4-etiketlenmiş ve Tie2-GFP + (Şekil 3D ve 3E) PVECs ettik. (Matrigel yokluğunda) eden kolajen kaplı kültür kaplarına bazılarında, PVECs in vivo periventriküler damar ağı (Şekil 3F) özelliğini de benzer kafes desen oluşturulur. Bu PVECs yüksek anjiyogenik potansiyelini yansıtır. Bir anjiyogenez deney PVECs (2 x 10 4 hücre) Matrigel matris ile kaplanmış kültür tabaklarına ilave edildiği gerçekleştirilmiştir. PVECs 18 saat (Şekil 3G) içinde sağlam tüp oluşumunu gösterdi. Bu sonuçlar, bu sistem, bir in vitro endotel hücre modeli olarak kullanılabilir güçlü bir kanıt sağlar. Izole PVECsCD1 embriyolardan hızlı bir şekilde canlı hücre sitoplazması içine yoğun kararlı floresan sağlamak ve göç, motilite, morfoloji, hücre fonksiyon deneyleri olarak da dahil olmak üzere canlı PVECs uzun süreli çalışmaları için kullanılabilir Qdot nanokristallerin (Şekil 3H) ile etiketlenebilir in vivo deneyler de olduğu gibi. PVECs Hücre Işık Plazma Membran RFP, canlı hücre görüntüleme deneylerde hücre morfolojisi net görüntülenmesi için üreticinin talimatlarına göre BacMam 2.0 (Şekil 3I) gibi hücre izleyiciler ile transfekte edilebilir.
Biz ECCM değil, aynı zamanda sıçan beyin endotel hücre büyüme ortamı (RBECGM) ve DMEM F12 ortamı içinde sadece PVECs kültürlenmiştir. Faz kontrast (Şekiller 4A, 4C ve 4E) ve her ikisi de isolectin B4 (Şekil 4A ve 4B), RBECGM (Şekil 4C ECCM kültürlenmiş PVECs içinde (Şekiller 4B, 4D, ve 4F) görüntü etiketlenmiş ve
Şekil 1. PVEC izolasyon şematik. Izolasyonu ve p için kullanılan protokolembriyonik telencephalon gelen PVECs içinde urification bir şema halinde özetlenmiştir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. PVECs fenotipik karakterizasyonu. (AG) kaplamadan sonra farklı zaman noktalarında PVEC kültür Faz kontrast görüntüleri. 1. gün (A) PVEC kültürü. Hücreler bağlı ve bölünmesi morfolojileri sonuçlar elde edilmiştir. (B) PVEC 5. gününde kültür ve şekil morfolojisi mili için parkelerde günübirlik 8 geçişiyle ilgili (C). (D) PVEC kültür 12. günde izdiham kavuşmuştur. 1. gün altkültür sonra (E) PVECs, (F) gün 5 (G (H), Von Willebrand Faktörü (I) 'in, CD31/PECAM (J) ve VE-cadherin (K): endotelial hücre markörleri kullanılarak PVECs bölgesinin (HJ) ile immün. Ölçek barlar: A, 100 mikron (BJ geçerlidir), K, 50 mikron. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. Ve PVECs morfolojileri. (AE) Yüksek büyütme görüntüleri isolectin B4-etiketli ve Tie2-GFP + ince uzun uzantıları (D, E) ile parke taşı ve iğ şeklinde morfoloji (AC) yanı sıra çokgen morfoloji gösteren PVECs ettik. (<strong> F) PVECs bile Matrigel yokluğunda kültür tabağına anjiyojenik yüksek bir potansiyele sahiptir. (G) PVECs Matrigel bir anjiyojenez deneyde sağlam tüp oluşumunu göstermektedir. Qdot nanokristallerin ile etiketlenmiş (H) PVECs. Hücre Işık Plazma Membran RFP, BacMam 2.0 ile transfekte (I) PVECs. Ölçek barlar: A, 50 mikron, B, 15 mikron (CE geçerlidir), F, 100 mikron (G, H geçerlidir), I, 50 mikron. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 4. Farklı kültür ortamı gösteri varyantı morfolojisi yetiştirilen PVECs. (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PVEC ait daha fazla fizyolojik olarak uygun nörovasküler etkileşimleri ilgili çalışma other doku kaynaklarından erişkin beyin endotel hücreleri ve EC 'den ve aynı zamanda tedavi edici potansiyele sahiptir. PVEC hazırlanması için, ölü hücrelerin CD31 mikro, için spesifik olmayan bağlamak olabilir çünkü iyi bir canlılığı elde etmek için hızlı çalışması için diseksiyon ile kritik bir başlangıçtır. Tek hücre süspansiyonu önce manyetik etiketleme aşamasından elde değilse, hücre kümeleri, sütunu yapışmasına neden olacaktır Ek olarak, bu sorun giderme neden olur. Bu yöntemin bir avantajı, manyetik boncuklardan hücreleri ayırmak için tripsin ile inkübasyon için gerek, EC preparasyonlar 4,7 other manyetik boncuk esaslı ayırma yöntemlerinde kullanılan bir zaman alan ve genellikle zor bir adımdır olmasıdır. Buna ek olarak, bu teknik, izolasyon embriyonik beyin dokusunun büyük miktarlarda gerektirmez. PVEC ait sürekli yakl tek zamanlanmış gebe fare kullanımı ile hazırlanabiliroximately 12 gün, alt-kültürlenmiş ve in vitro geniş bir yelpazede ve in vivo deneylerde kullanılır.
Izolasyonundan sonra PVECs saflığı,% 90, ancak alt-kültür sonrası PVECs saflığı% 100'dür. Endotel hücrelerinin yanı sıra, PECAM-1 monosit / makrofajlar yüzeyinde bulunur. Postnatal veya yetişkin beyin 8 ile karşılaştırıldığında mikroglia CNS'nin makrofaj popülasyonu ancak embriyonik fare beyninde oldukça düşüktür. Monositler / mikroglia,% 10 fetal buzağı serumu ve büyümesi spesifik büyüme faktörleri ile takviye edilmiş bir ortam gerekir, onlar ECCM in sonunda ölecek ve PVECs bölgesinin alt kültür sonra sürmez. % 100 saf PVECs hemen izolasyonu (örneğin, gen ekspresyonunu test etmek için) sonra gereken zaman, (FACS) sıralama yöntemi floresan aktive hücre kullanılabilir. PVECs sonra Tie2GFP embriyolardan izole edilmiş (ki burada sadece endotel hücreleri GFP eksprese eden) ve sıkı bir çift FACS analizi ile sıralanır. Sıralanmış endotelinin saflığıl hücreleri GFP ve CD31/PECAM-1 6 çift pozitif olduğu hücrelerin toplanması ile sağlanmaktadır.
Kültürleri de yakından perisitlerden gibi hücre türlerini kirletici için izolasyonun ilk haftasında görülmektedir. Perisit hücreler düzensiz şekilli şekilli iğ veya koloniler olarak büyümek çok köşeli, temas hücreleri oluşur endotel hücrelerin aksine konfluent tek tabaka oluşturacak asla yana, onlar varsa tanımak kolaydır. Perisit kirlilik tespit edilirse, tripsin (% 0.05) daha düşük bir konsantrasyonu, (2-3 dakika) PVECs bir alt-kültür için kullanılan bir hızlı trypsinization prosedürü takip etmektedir. Perisitler uzun bir trypsinization zaman (7-10 dk) gerektiren ve bağlı kalacaktır. Buna ek olarak, tripsinize perisitlerin kaplama verimi (varsa) çok kötüdür. Bu adımlar perisit kirlenmeyi ortadan kaldırmak ve alt kültürleri PVECs saf olduğundan emin olun.
ECCM orta hidrokortizon içeren düşük serum orta,heparin ve% 2 fetal büyükbaş hayvan serumu ve Epidermal Büyüme Faktörü (EGF) ve endotel hücre büyüme takviyesi (ECGS) ile takviye edilmektedir. ECCM yetiştirilen PVECs sürekli iğ şekilli morfolojiye gösterdi. Sıçan beyni ECGM,% 10 fetal sığır serumu, büyüme faktörleri VEGF ve içerir. Bu medya yetiştirilen PVECs çok uzun morfolojileri var ve confluency ulaşmak için daha uzun sürer. DMEM-F12 ortam,% 10 fetal sığır serumu, Glutamax ve endotel hücre büyüme takviyesi ile takviye edilmiş ve başka bir ortama daha fazla çoğalması indükler. Bu medya yetiştirilen PVECs 4 gün içinde çok hızlı büyüme ve elde confluency gösterdi rağmen, morfolojileriyle düz veya sadece çokgen vardı. Biz fenotip ve fonksiyon kaybı olmadan en fazla üç geçişleri için ECCM içinde PVECs büyüdü. Bu nedenle, ECCM biz PVEC kültürü için tercih ortamıdır.
Bu protokol tarafından nöronal öncülleri ile kültüre PVECs fa nöron ve nöronal göç yaratması olasıdırr-daha yetişkin beyin ya da diğer kaynaklardan gelen endotel hücreleri daha kapsam ve felç, travmatik beyin hasarı veya nörodejenerasyon nörolojik fonksiyon kurtarma yardım için değerli olabilir. Erişkin beyinde nakledilen nöronal öncüleri genellikle durak ve yeni nöronlar gerektiren bölgelere göç başarısız bildirilmiştir. Bu sorun, radyal glial kılavuzlar 9 gibi nöronal göç kolaylaştırmak yüzeylerde olmaması hesaplanmaz. Damar giderek nöronal göç 6,10,11 için substrat olarak takdir ediliyor. PVECs nakli sitelerinde bu durmuş nöronal öncüleri için bir çözüm sunabilir. Hasarlı beyin bölgeleri içine PVECs ve nöronların Coimplantation endotel hücreleri nöronların güdümlü göç kolaylaştırmak ve fonksiyonel iyileşme elde etmenize yardımcı olabilir. Göç nöronlar ile endotel hücrelerinin yakın derneği de büyüme faktörleri ve morphogens doğrudan ve seçici içine sunmak için onlara benzersiz uygun hale getirirnöronlar göç.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Şizofreni Araştırmaları Ulusal İttifak ve Depresyon (NARSAD) Genç Araştırmacı Ödülü ve Ulusal Sağlık Enstitüleri AV R01NS073635 hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNase I | Sigma | D-4527 | |
| Collagen, Type 1 solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| DPBS | Quality Biologicals | 114057-131 | |
| EDTA | Fisher Scientific | M4055 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| MS column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| CD31 microbeads | Miltenyi Biotech | 130-097-418 | |
| MACS separator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Bioscience | 352350 | |
| Antibiotic and antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| 35 mm Culture dish | BD Bioscience | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352097 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352098 | |
| ECCM kit | BD Bioscience | 355054 | Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF, and Soybean Trypsin Inhibitor |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Bioscience | 354006 | |
| RBECGM | Cell Applications | R819-500 | |
| DMEM F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 305050-061 | |
| Tissue culture grade water | Life Technologies | 15230162 | |
| 0.25% Trypsin | Life Technologies | 15050 | |
| Soybean trypsin inhibitor | BD Bioscience | 5425 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Life Technologies | Q25021 | |
| CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0 | Life Technologies | C10608 | |
| Biotinylated Isolectin B4 antibody | Sigma | L2140 | |
| Anti-Von Willebrand factor | Sigma | F3520 | |
| Anti-CD31/PECAM-1 | BD Pharmingen | 550274 | |
| VECTASHIELD Hardset Mounting Media with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Ketamine | Butler Schein Animal Health Supply | 44028 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 1009 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Inverted microscope | Olympus CK-40 | CK-40 | |
| Fluorescent microscope | Olympus FSX-100 | FSX-100 | |
| Fine forceps | Roboz Surgical Instrument | 7 inox | |
| Fine microtip scissors | Roboz Surgical Instrument | RS5611 |
References
- Shen, Q., S, G., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
- Milner, R. A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system. BMC Neurosci. 8, 3 (2007).
- Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo. 19, 1469-1485 (2008).
- Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).
- Vasudevan, A., Bhide, P. G. Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale. Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).
- Won, C. K., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).
- Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).
- Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One. 6, (2011).
- Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain. 2, 461-466 (1999).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
