Summary
تستخدم عادة، يتم وصف طرق للوصول للغاية لدراسة الهجرة الخلية والغزو في المختبر. الأسلوب الأول هو الجرح خلية إغلاق الفحص الذي يقيس حركية الخلية. الأسلوب الثاني هو transwell الهجرة والغزو الفحص أن يقيم الكيميائي والقدرة الغازية من الخلايا.
Introduction
حركية هو سمة أساسية من سمات الخلايا الحية. وتشارك الهجرة خلية في مفهوم الحياة، والتطور الجنيني، الاستجابة المناعية، والعديد من العمليات المرضية مثل السرطان والتهاب ثانوي لورم خبيث 1-9. وبالتالي، وأساليب لدراسة الخلية السلوك المهاجرة هي أدوات البحث مفيد جدا لمجموعة واسعة من التخصصات في العلوم الطبية الحيوية، وعلم الأحياء، والهندسة الحيوية، والمجالات ذات الصلة.
دراسة الهجرة الخلية في أبحاث السرطان هو من مصلحة خاصة فيما يرتبط السبب الرئيسي للوفاة في مرضى السرطان لتطور النقيلي. من أجل السرطانية تنتشر وتنشر في جميع أنحاء الجسم، يجب أن تهاجر الخلايا السرطانية وغزو من خلال المصفوفة خارج الخلية (ECM)، intravasate في الدورة الدموية، ونعلق على موقع بعيد، وأخيرا يتسرب إلى تشكيل بؤر بعيدة 1،10-12. لذا يمكن استخدام الأساليب البيولوجية المختلفة لدراسة هذه الأحداث بالتفصيل. ثقافة الخلية جرح إغلاق لوتستخدم على نطاق واسع د هجرة transwell والمقايسات الغزو في الأوساط العلمية 1،10. هذه الاختبارات يمكن أن توفر البيانات اللازمة التي قد تسمح لفهم مدى نوع خلية معينة يمكن ترحيل من تلقاء أنفسهم أو الرد على الكيماوي جاذبة وتهاجر إتجاهي نحو ذلك. وقد وصفت العديد من الظواهر المهاجرة. قد تهاجر الخلايا في شكل خلية واحدة من هذا القبيل كما رأينا في الوسيطة أو حركة تشبه حركة أميبية أو متعددة الخلايا وصفت الهجرة الجماعية أو خلية تدفق 13. طريقة الحركة المستخدمة في خلايا متحركة يمكن ملاحظتها بسهولة باستخدام زراعة الخلايا إغلاق الجرح الفحص.
من بين العديد من الطرق لدراسة الهجرة الخلية، الجرح خلية إغلاق الفحص هو واحد من أبسط. وهذه الطريقة مفيدة لتحديد القدرة هجرة الجماهير خلية كاملة. عندما اتخذت خطوة أخرى يمكن استخدامها لمراقبة الخصائص المورفولوجية خلية الفرد أثناء الترحيل 14. بعد تحليل إغلاق الجرح قد كشفت العديد من الظواهر. قياس المسافة المغلقة مع مرور الوقت عند مقارنة إلى عنصر تحكم قد تكشف عن تغييرات محددة الهجرة أو النمط الظاهري المهاجرة ضعاف التي لم تكن معروفة سابقا. علاوة على ذلك، تشكيل واحد قدم صفاحية خلية، وذيل سحب، وحركة الاتجاه قد تعطي مؤشرات لما قد تنخفض قيمتها أو محسنة في خلايا الفائدة 14.
هجرة transwell والمقايسات الغزو يمكن أن تستخدم لتحليل قدرة الخلايا واحد للرد إتجاهي لمختلف الكيماوي جاذبة سواء كانوا كيموكينات، عوامل النمو، والدهون، أو النيوكليوتيدات 4،5،8،15،16. كما أنه قد تقييم قدرة المهاجرة الفرق بسبب الإفراط في التعبير عن مستقبلات 1،14. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه المقايسات لتحديد وتوصيف المنظمين الرئيسيين للهجرة الخلية مثل الأسرة رو من GTPases الصغيرة 2. بعد هذه قصيرة وبسهولة القويمكن أيضا تحديد اختبارات إيصال خدمات الإيداع، ووضع الهجرة الخلية، وقدرة الخلية لغزو في مصفوفة 3-D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إغلاق الفحص مدينة الثقافة الجرح
- فصل الخلايا من نسيج لوحة الثقافة باستخدام 0.25٪ التربسين-EDTA حل. بيليه الخلايا في أنبوب 15 مل المخروطية بواسطة الطرد المركزي، ونضح طاف، واعادة تعليق الخلايا في وسائل الإعلام والثقافة. لوحة العدد المناسب من الخلايا في لوحة 6 جيدا للالتقاء 100٪ في غضون 24 ساعة.
ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى اختبارات لتحديد الوقت وعدد من الخلايا لتحقيق 100٪ التقاء بسبب نوع من الخلايا وحجم البئر وتستخدم (على سبيل المثال، هي المصنفة 1 × 10 6 خلايا سرطان الجلد B16F10 في بئر ل لوحة 6 جيدا قبل 24 ساعة من الجيل الجرح). بدلا من ذلك، يمكن استخدام 12 أو 24 جيدا جيدا لوحات.
ملاحظة: إذا كان متوفرا، يمكن خلايا المصنف إلى إدراج الثقافة (من ibidi LLC) على التعامل مع الأنسجة لوحة الثقافة جعل الجرح قبل مسبوكة. A الثقافة إدراج يمكن حماية السطح من لوحة زراعة الأنسجة من التلف من قبل طرف ماصة. إذا تم استخدام الثقافة إدراج خطوة تجاهل1.2. - في بيئة معقمة (عادة غطاء السلامة الأحيائية) استخدام غيض ماصة 200 ميكرولتر للضغط بحزم ضد الجزء العلوي من لوحة زراعة الأنسجة وجعل بسرعة جرح رأسي إلى أسفل من خلال أحادي الطبقة الخلية. A مختلفة غيض ماصة الحجم يمكن استخدامها لجعل حجم الجرح الذي هو المطلوب. لا تستخدم القوة المفرطة ضد لوحة زراعة الأنسجة مع طرف ماصة لأنه قد يتلف السطح. إذا كان الجرح محمل مسبقا، قد يتم حذف هذه الخطوة.
- نضح بعناية وسائل الإعلام والحطام الخلية. إضافة ببطء بما فيه الكفاية سائل الإعلام والثقافة ضد الجدار جيدا لتغطية قاع البئر وتجنب فصل خلايا إضافية. بعد جيل والتفتيش على الجرح ينبغي أن تؤخذ صورة الأولي. وضع لوحة زراعة الأنسجة في حاضنة وضعت في درجة حرارة مناسبة وأول أكسيد الكربون 2 تركيز (عادة 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2).
- في عدة نقاط الوقت، مثل كل 3 ساعات، وإزالة لوحة من incubatأو وضعه تحت مجهر مقلوب لالتقاط صورة لقطة وللتحقق من إغلاق الجرح. إذا كان الوقت الفاصل بين المجهري هو متاح، التقاط صورة كل عدد X من دقيقة (تبدأ عادة مع كل 5 دقائق) لأي مدة زمنية في درجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون 2 غرفة التحكم. اعتمادا على نوع من الخلايا، قد تختلف الجرح وقت الإغلاق.
- لتحليل نتائج الصور لقطة، وقياس المسافة من جانب واحد من الجرح إلى أخرى باستخدام شريط مقياس. تحليل والحاضر بوضوح إغلاق الجرح مع مرور الوقت باستخدام مؤامرة مبعثر أو شريط الرسم البياني، مثل الشكل 1.
- لتحليل الصور الوقت الفاصل بين، استيراد الصور في البرنامج يماغيج (متاحة بحرية في http://rsb.info.nih.gov/ij/) لجعل الفيديو. للقيام بذلك يماغيج مفتوحة، انقر فوق ملف، استيراد، وتسلسل الصور. العثور على الملف مع الصور؛ انقر على الصورة الأولى في الملف. حفظ الفيديو عن طريق تحديد ملف، حفظ، وافي. ويمكن ملاحظة الخلايا المهاجرة واحد لشاراcterize حركة الاتجاه. وعلاوة على ذلك، والخصائص المورفولوجية مثل تشكيل أقدام صفاحية وراء حافة التراجع قد تدرس كذلك (الشكل 2 والفيديو التكميلية).
2. Transwell الهجرة الخليوي والغزو الفحص
- في بيئة معقمة (عادة غطاء السلامة الأحيائية) فصل الخلايا من نسيج لوحة الثقافة باستخدام غير الأنزيمية العازلة تفارق الخلية أو 0.25٪ التربسين-EDTA حل، وخلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي، ونضح وسائل الإعلام القائمة وترك الخلايا مكعبات. اعادة تعليق الخلايا في مصل سائل الإعلام والثقافة الحرة الخلية تحتوي على 0.1٪ BSA (ألبومين المصل البقري).
ملاحظة: اعتمادا على خط الخلية التي يجري التحقيق 0.25٪ التربسين EDTA-قد تؤثر الهجرة الخلية والغزو بسبب الانقسام من المستقبلات المختلفة على سطح الخلية 17.
ملاحظة: عدد الخلايا لكل مل يعتمد على حجم الخلايا. قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من الاختبارات للعثور على كثافة البذر التي محترفينفيديس على أفضل النتائج. عادة 1 × 10 6 خلية / مل هو نقطة انطلاق جيدة لمعظم أنواع الخلايا عند استخدام جيدا 24 transwell إدراج. هناك مجموعة واسعة من الأحجام transwell إدراج وينبغي تعديل عدد الخلايا المضافة لوفقا لذلك. - لوحة 100 ميكرولتر من محلول الخلية على الجزء العلوي من الغشاء المرشح في إدراج transwell واحتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 للسماح للخلايا ليستقر.
ملاحظة: حجم المسام معينة من الغشاء transwell المستخدمة تعتمد على حجم الفردية من الخلايا في العينة. على سبيل المثال، إذا كانت الخلايا صغيرة جدا فإنها قد تمر من خلال المسام دون الحاجة إلى تسهيل الهجرة أو إذا كانت كبيرة جدا فإنها قد لا تناسب من خلال المسام. وهناك العديد من إدراج transwell مع أحجام المسام التي تتراوح من 3 ميكرون، 5 ميكرون، و 8 ميكرومتر لفحوصات الهجرة الخلية. تتوفر تجاريا على إدراج transwell من شركات مثل كورنينج.
ملاحظة: transwell مigration مقايسة يمكن تعديلها بسهولة لإجراء فحص غزو الخلية. للقيام بذلك، قم بإضافة المصفوفة خارج الخلية (ECM) مواد على رأس الغشاء transwell ثم قم بإضافة خلايا على رأس ECM. على سبيل المثال، يتم إذابة Matrigel ومسالة على الجليد، ومن ثم يتم إضافة 30-50 ميكرولتر من Matrigel إلى جيدا 24 transwell إدراج وعزز في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة لتشكيل طبقة رقيقة هلام. يضاف حل الخلية على رأس طلاء Matrigel لمحاكاة الغزو من خلال المصفوفة خارج الخلية.
ملاحظة: هناك اختلافات واضحة بين الهجرة الخلية transwell والمقايسات غزو الخلايا transwell. يقيس الفحص الهجرة الخلية transwell القدرة الكيميائي للخلايا نحو الكيماوي جاذبة. مقايسة غزو الخلايا transwell، ومع ذلك، يقيس كلا الكيميائي خلية وغزو الخلايا من خلال المصفوفة خارج الخلية، وهي العملية التي توجد عادة في الانبثاث السرطان أو التطور الجنيني. - باستخدام ماصة، caref جدامع ully إضافة 600 ميكرولتر من المطلوب الكيماوي جاذبة في الجزء السفلي من مجلس النواب في 24 لوحة جيدا. إضافة الكيماوي جاذبة دون تحريك إدراج transwell وتجنب توليد فقاعات. تأكد من أن السائل الكيماوي جاذبة في البئر أسفل يجعل الاتصال مع الغشاء في البئر العليا لتشكيل التدرج الكيميائي. فترة حضانة تعتمد على نوع من الخلايا والكيماوي جاذبة المستخدمة.
ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من الاختبارات لتحديد فترة الحضانة.
ملاحظة: للحصول على الخلايا الملتصقة، فإن الخلايا هاجر نعلق على الجانب الآخر من الغشاء 1،8. الكمي من الخلايا هاجر لا يمكن أن يؤديها التالية الخطوات 2،4-2،8 (الخطوات 2،4-2،8 لا تحتاج إلى أن يؤديها في بيئة معقمة). لخلايا غير ملتصقة، فإن الخلايا هاجر تسقط في وسائل الاعلام في مجلس النواب. يمكن الاعتماد على عدد من الخلايا باستخدام عدادة الكريات هاجروا أو تدفق عداد الكريات 5. - إزالة إدراج transwell من لوحة. استخدام قضيب من القطن ذات الرؤوس عدة مرات حسب الحاجة لإزالة بعناية وسائل الإعلام والخلايا المتبقية التي لم هاجروا من الجزء العلوي من الغشاء دون الإضرار بها.
- إضافة 600-1،000 ميكرولتر من الايثانول 70٪ في بئر من 24 لوحة جيدا. وضع إدراج transwell في الإيثانول 70٪ لمدة 10 دقيقة للسماح التثبيت الخلية. إزالة transwell إدراج من 24 لوحة جيدا واستخدام قضيب من القطن ذات الرؤوس لإزالة الإيثانول المتبقية من الجزء العلوي من الغشاء. يسمح الغشاء transwell لتجف (عادة 10-15 دقيقة).
- إضافة 600-1،000 ميكرولتر من 0.2٪ الكريستال البنفسجي في بئر من 24 لوحة جيدا ووضع الغشاء في ذلك لتلطيخ. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقائق.
- بلطف إزالة البنفسجي الكريستال من أعلى الغشاء مع طرف ماصة أو القطن يميل قضيب. بعناية فائقة، لتجنب غسل قبالة خلايا ثابتة، وتراجع الغشاء إلى الماء المقطر عدة مرات حسب الحاجة لإزالة الزائدة الكريستال violeر. يسمح الغشاء transwell لتجف.
- عرض تحت مجهر مقلوب وحساب عدد الخلايا في مختلف المجالات من أجل الحصول على متوسط مجموع الخلايا التي هاجروا عبر الغشاء تجاه الكيماوي جاذبة وتعلق على الجانب السفلي من الغشاء (الشكل 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أجريت إغلاق فحص الجرح وفحص الهجرة الخلية transwell المقدمة هنا باستخدام خلايا فأر B16F10 سرطان الجلد كنظام نموذج. في مقايسة إغلاق الجرح، وكانت المصنفة B16F10 الخلايا في 6 جيدا نسيج لوحة الثقافة ونمت إلى 100٪ التقاء في غضون 24 ساعة. ولدت وجرح ما يقرب من 700 ميكرون واسع باستخدام طرف ماصة وإغلاق الجرح (الهجرة الخلية) تم تسجيلها باستخدام المجهر مرور الزمن. بدلا من ذلك، يمكن أيضا إغلاق الجرح دراستها من قبل التقاط الصور لقطة في نقاط زمنية مختلفة إذا كان الوقت الفاصل بين المجهري غير متوفرة 1. يتم عرض أربع صور من المسلسل في الوقت الفاصل بين 0، 4، 8، ونقاط زمنية لمدة 12 ساعة في الشكل 1. وبناء على عرض من الجرح، حسبنا المسافة الهجرة وسرعة الهجرة الخلية في 40.42 ميكرون / ساعة (الشكل 1B). تم تجميع الصور الوقت الفاصل بين أيضا في الفيديو باستخدام برنامج يماغيج (انظر الفيديو التكميلية). اليمكن دراستها ه عملية الهجرة الخلية الحيوية. كما هو مبين في الشكل 2، ومورفولوجيا الخلايا المهاجرة مع أقدام صفاحية (الرائدة) وذيول (حافة زائدة) لوحظت بشكل واضح.
في مقايسة transwell الهجرة الخلية، استخدمت إدراج 24 جيدا من كورنينج. B16F10 خلايا سرطان الجلد وإعادة علقت في تركيز 1 × 10 6 خلية / مل في المخزن المؤقت الهجرة تتألف من DMEM المتوسطة و 0.1٪ BSA دون المصل. واستخدمت وسائل الإعلام مكيفة من الخلايا الليفية NIH3T3 نمت في DMEM المتوسط تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني باسم الكيماوي جاذبة. تمت إضافة 100 ميكرولتر من الخلايا B16F10 على رأس الغشاء transwell في مجلس الشيوخ و 600 ميكرولتر من الكيماوي جاذبة وأضيف إلى انخفاض الغرفة أو نفس حجم المخزن المؤقت الهجرة أضاف كعنصر تحكم السلبية. تم إجراء الهجرة الخلية كما هو موضح في الإجراء. يمكن أن يكون كميا عدد الخلايا هاجروا عن طريق عد تحت المجهر أو فيالصور التي التقطت (الشكل 3B). كما هو مبين في الشكل (3)، كانت هناك زيادة 15 أضعاف في الخلايا المهاجرة نحو الكيماوي جاذبة بالمقارنة مع الرقابة المخزن المؤقت الهجرة (الشكل 3C). ويدرس الفحص الكيميائي transwell الخلية، والهجرة الخلية الاتجاه نحو الكيماوي جاذبة.
الشكل 1. B16F10 خلية سرطان الجلد إغلاق الجرح الفحص. (A) خلال 16 ساعة إغلاق الجرح فحص الصور أخذت كل 5 دقائق باستخدام المجهر مرور الزمن. وتظهر الصور ممثل في 0، 4، 8، و 12 ساعة ويتم إضافة أشرطة النطاق (400 ميكرون) لقياس عرض الجرح. (B) وقد تم قياس مسافة الجرح في ميكرون. تم استخدام مؤامرة مبعثر لعرض عرض الجرح مع مرور الوقت وحساب معدل إغلاق الجرح. لجينمعدل ص 2 القيمة، تم تشغيل الانحدار الخطي على بيانات العرض الجرح باستخدام برنامج GraphPad بريزم (الإصدار 5.0، GraphPad البرمجيات، وشركة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. اتخذت مورفولوجية المهاجرة B16F10 الخلايا من الوقت الفاصل بين المجهري للمقايسة إغلاق الجرح. خلال 16 ساعة إغلاق الجرح الصور الفحص كل 5 دقائق. تم تجميع جميع الصور في الفيديو باستخدام برنامج يماغيج (5 إطارات / ثانية). ولوحظ الهجرة الخلية التي تنطوي على الاستقطاب الخلية، والإرشاد أقدام صفاحية، وزائدة حافة التراجع. وعرضت صور من 34.6، 36.6 نقطة، والوقت 38.6 ثانية من الفيديو (الفيديو في الوقت المقابلة لمرور الزمن وقت الهجرة الفعلية (ساعة: دقيقة: ثانية) 34.6 ثانية، 14:20:00؛ 36.6 ثانية، 15:10:00؛ و38.6 ثانية، 16:00:00، على التوالي). شريط النطاق 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. Transwell فحص هجرة B16F10 خلايا سرطان الجلد (أ) رسم تخطيطي لجهاز إدراج transwell المستخدمة لقياس الهجرة الخلية والغزو. (B) صور ممثل B16F10 transwell الخلية الهجرة. أضيفت عازلة الهجرة الخلية والخلية NIH3T3 مكيفة المتوسطة لمجلس النواب باعتباره السيطرة السلبية والكيماوي جاذبة، على التوالي. بعد الهجرة الخلية وتلطيخ مع الكريستال البنفسجي كما هو موضح في الإجراءات، اتخذت صورا للخلايا هاجر (الملون الأرجواني) باستخدام ميكرoscope مع الهدف 10X (مجموع التكبير 100X). ويمكن أيضا ملاحظتها مسام الأغشية بوصفها صغيرة، مستديرة والظلام العديد من النقاط الملونة في الصورة. (C) الكمي من الخلايا المهاجرة نحو المخزن المؤقت الهجرة أو الكيماوي جاذبة (متوسط 5 حقول صور في مجموعه 100X التكبير). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
تكميلية فيديو. الفيديو الوقت الفاصل بين خلية سرطان الجلد B16F10 الجرح فحص الإغلاق. تم التقاط الصور كل 5 دقائق لمدة 16 ساعة لتوليد 193 الصور. تم تجميع جميع الصور في الفيديو باستخدام برنامج يماغيج (5 إطارات / ثانية). راجع "Supplementary_Video_JOVE.avi" ملف التكميلية تحت التحميل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الهجرة الخلية هو أحد الجوانب الهامة للدراسة في أبحاث السرطان، ويمكن أيضا أن تطبق على النمو، والجرح الدراسات المناعية الشفاء. ثقافة الخلية الجرح إغلاق الفحص والكشف عن الهجرة الخلية transwell والغزو المقايسات معلومات مفصلة من السلوكيات الخلايا المهاجرة، ويمكن استخدامها للتحقيق في الآليات الجزيئية للهجرة الخلية 1،2،10،14. استخدمت دراستنا هذه المقايسات حركية الخلية لتحديد سرعة الهجرة والغزو قدرات خط خلية سرطان الجلد B16F10.
يدرس إغلاق فحص الجرح خلية قدرة خط خلية معينة للهجرة، وبعد ذلك يغلق الجرح المحرز في لوحة متموجة من الخلايا. هذا الاختبار هو للوصول للغاية للمجموعات مع المعدات الأساسية وبالمقارنة مع الأساليب القائمة هو طريقة بسيطة لقياس الهجرة الخلية. بعض الاختلاف في مقايسة إغلاق الجرح قد تكون موجودة في مجموعات العلاج الفردية ولكن هناك العديد من الخطوات التي أماهذ اتخاذها ليساعد في تخفيف ذلك. أسلوب واحد المحتملة للحد من الاختلاف هو لوحة لكل عينة مع نفس العدد من الخلايا لتحقيق التقاء متزامن والحفاظ على حالة الخلايا السليمة في بدء كل تجربة. قد تكون هناك حاجة إلى عدة محاكمات تجارب زراعة الخلايا لتحديد عدد الطلاء بالضبط ما هو مطلوب لتحقيق التقاء الثوابت وحالة الخلايا السليمة بين عينات المستقلة. علاوة على ذلك، زيادة حجم العينة سوف يقلل أيضا من الاختلاف. لبطء خطوط الخلايا المهاجرة التي تتطلب أكثر من 24 ساعة فترة حضانة لمراقبة هجرة كبيرة، وأنها مريحة لاستخدام aphidicolin أو غيرها المانع لمنع انتشار التغييرات عدد الخلايا التي يمكن أن تؤثر على نتائج الفحص.
بعد اتقان القدرة على دراسة سرعة الهجرة الخلية باستخدام مقايسة إغلاق الجرح الخليوي، وتقييم مفصل للخلية السلوكيات المهاجرة واحد ويمكن أيضا إنجاز 14. وعلاوة على ذلك، وبعد WOUالثانية الخلايا مقايسة إغلاق قد تكون ثابتة ومختلف البروتينات المشاركة مع هيكل هيكل الخلية وديناميكية يمكن الاطلاع وتقييمها باستخدام كيمياء سيتولوجية مناعية 2. قد يؤدي هذا التحليل إلى مزيد من التعديلات مفصلة البيوكيميائية لم تكن معروفة سابقا. إغلاق الجرح فحص الخلية هي أيضا قابلة للغاية في الوقت الحقيقي التصوير الخلية الحية لدراسة ديناميات الهجرة باستخدام الوقت الفاصل بين المجهري مضان. على سبيل المثال، الأكتين-GFP، تويولين-GFP، وpaxillin-GFP البروتينات الانصهار قد أعرب في الخلايا الحية لعرض توطين البروتينات في نقاط زمنية مختلفة في الهجرة الخلية أو التصاق 18،19. وتشمل بعض القيود للمقايسة إغلاق الجرح الذي، على سبيل المثال، فإنه ليست مناسبة للخلايا غير ملتصقة ولا قياس الكيميائي الخلية. بالإضافة إلى ذلك، بعض خطوط الخلايا لديهم ميل لفصل من لوحة على الفور بعد إجراء الجرح (مثل الخلايا HEK293T). بالنسبة لأولئك خطوط الخلايا، فمن الأفضل استخدام لوحات الجرح محمل مسبقا أو transwالذراع فحص الهجرة مناقشتها أدناه.
هجرة الخلايا transwell والغزو الفحص يوفر تحليل دقيق للقدرة الخلايا على الإحساس معين الكيماوي جاذبة والهجرة من خلال حاجز مادي تجاهها. هذا الاختبار يمكن استخدام مزيد من التحقيق في غزو الخلايا عن طريق إضافة طبقة من المصفوفة خارج الخلية أو طبقة من الخلايا البطانية على رأس الغشاء transwell لتقليد عملية الغزو ECM والتسرب 1،10. بالإضافة إلى ذلك، في أعقاب الغزو من خلال Matrigel، وتلطيخ المناعية من البروتينات في تركيبة هيكل الخلية مع مضان المجهري قد تكون ذات قيمة لدراسة المورفولوجية خلال غزو 3-D. وجود قيود على استخدام مقايسة غزو الخلايا transwell هو أن البيانات في الوقت الفاصل بين غزو الخلايا من الصعب تحقيق مع المجهري التقليدية ويعيش التصوير خلية من هذه العملية معقدة.
للحصول على نتائج دقيقة، وهناك العديد من الخطوات الحاسمة خلال هيئة تنظيم الاتصالاتnswell الهجرة الخلية والغزو المقايسات التي هي ذات أهمية. أولا، لأن سرعة الهجرة الخلية قد تختلف اختلافا كبيرا بين أنواع مختلفة من الخلايا يجب إجراء العديد من التجارب الأولية على اعتماد إطار زمني محدد الهجرة التي سيتم استخدامها في الإجراء. الثانية، يجب أيضا أن تكون الكيماوي جاذبة تنطبق على نوع من الخلايا في المصالح. وينبغي دراسة مجموعة واسعة من الكيماوي جاذبة في التجارب السابقة قبل قياس الهجرة النهائية والقدرة غزو من نوع خلية معينة. ويشيع استخدام الخلايا الليفية المتوسطة مكيفة باعتبارها الكيماوي جاذبة قوية لمجموعة واسعة من أنواع الخلايا. إذا تم استخدام واحد المنقى الكيماوي جاذبة تأكد من أن يتم التعبير عن مستقبلات للالكيماوي جاذبة في نوع من الخلايا في المصالح. أخيرا، للمقايسة غزو الخلايا تأكد من طلاء Matrigel أو غيرها من المصفوفة خارج الخلية متجانسة من أجل تقليل التباين التجريبية. في الختام، وإن كانت هناك بعض القيود، وغايةالوصول المقايسات الهجرة الخلية الموصوفة هنا هي مفيدة لمجموعة واسعة من الدراسات البيولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-073 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini | 100106 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco | 25200-056 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-250 | |
| Crystal violet | Sigma | C0775-100G | Dissolved in water at 0.2% |
| Cell disassociation buffer | Gibco | 13151-014 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Model # 3145 | |
| SterilGARD biosafety hood | The Baker Company, Inc. | Model # VBM-600 | |
| EVOS Fl inverted microscope | Thermo Fisher Scientific | Model # AMF-4302-US | |
| Tissue culture plate | Becton Dickinson | 353046 | Catalog number varies depending on the type of culture plate |
| Corning Transwell insert | Fisher | 07-200-150 | Catalog number varies depending on the pore size of the membrane |
References
- Castellone, R. D., Leffler, N. R., Dong, L., Yang, L. V. Inhibition of tumor cell migration and metastasis by the proton-sensing GPR4 receptor. Cancer Lett. 312 (2), 197-208 (2011).
- Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Rev. 28, (2009).
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Peter, C., et al. Migration to apoptotic "find-me" signals is mediated via the phagocyte receptor G2A. J. Biol. Chem. 283 (9), 5296-5305 (2008).
- Radu, C. G., Yang, L. V., Riedinger, M., Au, M., Witte, O. N. T cell chemotaxis to lysophosphatidylcholine through the G2A receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (1), 245-250 (2004).
- Buul, J. D., Hordijk, P. L. Signaling in leukocyte transendothelial migration. Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. (5), 824-833 (2004).
- Yang, L. V., Heng, H. H., Wan, J., Southwood, C. M., Gow, A., Li, L. Alternative promoters and polyadenylation regulate tissue-specific expression of Hemogen isoforms during hematopoiesis and spermatogenesis. 228 (4), 606-616 (2003).
- Yang, L. V., Radu, C. G., Wang, L., Riedinger, M., Witte, O. N. Gi-independent macrophage chemotaxis to lysophosphatidylcholine via the immunoregulatory GPCR G2A. Blood. 105 (3), 1127-1134 (2005).
- Yoshida, M., Yoshida, K. Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+. Mol. Hum. Reprod. 17 (8), 457-465 (2011).
- Albini, A. Tumor and endothelial cell invasion of basement membranes. The matrigel chemoinvasion assay as a tool for dissecting molecular mechanisms. Pathol. Oncol. Res. 4 (3), 230-241 (1998).
- Fidler, I. J. Critical determinants of metastasis. Semin. Cancer Biol. 12 (2), 89-96 (2002).
- Steeg, P. S. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nat. Med. 12 (8), 895-904 (2006).
- Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. Chemotaxis in cancer. Nat. Rev. Cancer. 11 (8), 573-587 (2011).
- Zhang, Y., et al. Comparative study of 3D morphology and functions on genetically engineered mouse melanoma cells. Integr. Biol. (Camb. 4 (11), 1428-1436 (2012).
- Junger, W. G. Purinergic regulation of neutrophil chemotaxis. Cell. Mol. Life Sci. 65 (16), 2528-2540 (2008).
- Lazennec, G., Richmond, A. Chemokines and chemokine receptors: new insights into cancer-related inflammation. Trends Mol. Med. 16 (3), 133-144 (2010).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17, (2010).
- Cortesio, C. L., Boateng, L. R., Piazza, T. M., Bennin, D. A., Huttenlocher, A. Calpain-mediated proteolysis of paxillin negatively regulates focal adhesion dynamics and cell migration. J. Biol. Chem. 286 (12), 9998-10006 (2011).
- Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. Actin microtubules and focal adhesion dynamics during cell migration. Int. J. Biochem. Cell Biol. 35 (1), 39-50 (2003).
