Summary
常用的，非常方便的方法研究细胞迁移和侵袭的体外描述。第一种方法是测量细胞运动的细胞伤口愈合测定法。第二种方法是，评估的趋化和细胞的侵袭能力Transwell小迁移和侵袭实验。
Introduction
蠕动是活细胞的一个重要特征。细胞迁移是参与生命，胚胎发育，免疫反应，以及许多病理过程，如癌症转移和炎症1-9的概念。因此，方法来研究细胞的迁徙行为是非常有用的研究工具，在生物医学科学，生物学，生物工程及相关领域学科门类齐全的。
在癌症研究中的细胞迁移的研究是特别感兴趣，因为死亡的癌症患者的主要原因是关系到转移进程。为了让癌细胞扩散和传播遍及全身，癌细胞必须迁移和入侵，通过细胞外基质（ECM），intravasate进入血液循环，连接到一个远程站点，最后渗出，形成远处病灶1,10〜12。各种生物的方法可以用来详细研究这些事件。细胞培养伤口闭合的D中的Transwell小迁移和入侵检测被广泛应用于科学界1,10。这些测试可以提供必要的数据，可能会允许对如何以及特定细胞类型可以自发地迁移或响应一个化疗诱和定向朝向其迁移的理解。几个迁徙的表型进行了说明。细胞可以迁移见于间质或变形虫样运动或标记的集体迁移或细胞流13多细胞运动的单细胞形式如。在游动细胞用于运动的方法，可以使用细胞培养物的伤口闭合测定法可以容易地观察到。
在众多的方法来研究细胞迁移，细胞伤口缝合法是最简单的一种。这种方法可用于确定整个细胞团的迁移能力。时采取的一个步骤进一步它可以用于迁移14时，观察各个细胞的形态特征。随着伤口闭合的分析很多表型可能显露出来。比较控件时测量近距离随着时间的推移可能会发现特定迁移量的变化或受损迁徙的表型是前所未知的。此外，单细胞lamellipodium形成，尾部回缩，并定向运动可能会给什么可能会削弱或增强的利息14细胞的线索。
Transwell小迁移和侵袭测定法可用于分析单个细胞的定向到不同的化疗诱响应它们是否是趋化因子，生长因子，脂质，或核苷酸4,5,8,15,16的能力。它也可以评估差分迁移能力因过度表达的受体1,14的。这些测定法还可以用于鉴定和表征细胞迁移的关键调节剂，如Rho家族的小GTP酶2。下面的这些短且容易存取权限sible测试中，细胞迁移的模式和小区的侵入成三维基质的能力也可以被确定。
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Protocol
1，细胞培养伤口闭合含量
- 使用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液中的组织培养板中分离细胞。沉淀的细胞在15毫升锥形管中，离心，吸出上清液，并重新悬浮的细胞在培养基中。铠细胞在6孔板的适当数量为在24小时内100％汇合。
注意：测试可能需要确定时间和细胞数达到100％汇合时，由于细胞的类型和该井所使用的大小（例如，1×10 6 B16F10黑素瘤细胞接种在一个良好的6孔板前24小时至伤口代）。可替换地，可以使用12孔或24孔板中。
注：如果可用，细胞可在处理过的细胞培养板使得伤口预铸被接种到文化 - 插入（从ibidi有限责任公司）。文化 - 插入可以通过枪头保护组织培养板的表面不受损坏。如果一个企业文化 - 插入时忽略步骤1.2。 - 在无菌的环境（通常是生物安全罩）用200μl的移液管尖，以牢固地压在组织培养板的顶部，并通过细胞单层迅速地使一个垂直向下的伤口。不同尺寸的移液管尖端可以用来使所期望的伤口大小。不要过度使用武力的组织培养板吸头，因为它会损坏表面。如果伤口预铸，该步骤可以省略。
- 小心吸媒体和细胞碎片。慢慢地对孔壁，以覆盖所述孔的底部，并避免额外的分离的细胞补充足够的培养基。以下伤口的产生和检测的初始图象，应采取。将组织培养板在培养箱中设定在适当的温度和CO 2浓度（通常为37℃和5％CO 2）。
- 在几个时间点， 例如每3小时从incubat除去板或者，并将其放置在倒置显微镜下拍摄快照的图片，并检查伤口闭合。如果时间推移显微镜可用，拍照分钟的每隔X数量（通常以每5分钟为单位）持续时间在温度和CO 2控制腔。取决于细胞类型，伤口闭合的时间可能会发生变化。
- 要分析的快照图片的结果，测量在伤口的一侧到另一使用比例尺的距离。用散点图或条形图， 例如 图1分析，并明确目前伤口闭合随着时间的推移。
- 为了分析时间推移的图片，导入图片到ImageJ的软件（可自由查看的http://rsb.info.nih.gov/ij/）进行视频。要做到这一点打开ImageJ的，点击文件，导入，和图像序列。找到图片文件;单击该文件中的第一张照片。保存视频选择文件，另存为，和AVI。单个细胞的迁移可观察到恰拉cterize定向运动。此外，形态特征，如伪足形成和后缘回缩可以研究以及（ 图2和辅助视频）。
2，Transwell小细胞迁移和入侵检测
- 在无菌的环境（通常是生物安全罩）使用离心非酶细胞解离缓冲液，或0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液中，沉淀的细胞分离的组织培养板中的细胞，并吸出的现有媒体留下沉淀的细胞。重悬的细胞在含有0.1％BSA（牛血清白蛋白）的无血清的细胞培养基。
注意：根据该细胞系被调查的0.25％胰蛋白酶-EDTA会影响细胞迁移和侵袭由于各种受体在细胞表面17的切割。
注意：每毫升的细胞数依赖于细胞的大小。进一步的测试，可能需要发现亲的接种密度志愿组织的最佳效果。通常为1×10 6个细胞/毫升是一个很好的起点，大多数细胞类型，当使用24孔Transwell插入。有一系列的transwell插入物的大小并增加细胞的数量应调整为相应。 - 板100μl的细胞溶液在一个Transwell小插入过滤膜的顶部，并孵育10分钟，在37℃和5％CO 2，以使细胞沉淀下来。
注意：使用的transwell小室的膜的特定细孔径是依赖于细胞的样品中的各个尺寸。例如，如果该细胞是太小它们可以穿过的孔，而不需要促进迁移，或者如果它们太大，他们可能没有通过毛孔适合。有几个的transwell插入物与孔径大小的范围从3微米，5微米，8微米的用于细胞迁移测定。 Transwell小刀片是可商购自例如康宁公司。
注：Transwell小米igration分析可以很容易地修改，以执行细胞侵袭实验。要做到这一点，添加细胞外基质（ECM）材料上的Transwell小膜的顶部，然后对ECM的顶部添加细胞。例如，基质胶解冻和液化在冰上，然后30-50微升基质胶加入到24孔Transwell小插入和固化在37℃的培养箱中培养15-30分钟，以形成一个薄的凝胶层。细胞溶液在基质胶涂层的顶部加入，通过细胞外基质，以模拟的入侵。
注意：有Transwell小细胞迁移和Transwell小细胞侵袭实验之间有明显的差异。 Transwell小细胞迁移实验测定细胞走向化疗引诱的趋化能力。 Transwell小细胞侵袭测定法，但是，通过细胞外基质的同时测量细胞趋化性和侵袭的细胞，即通常在癌症转移或胚胎发育的发现过程。 - 使用移液管，非常caref来自ully添加600微升所希望的化疗引诱到下部腔室在一个24孔板的底部。添加化学引诱而无需移动Transwell小插件，避免产生气泡。确保在底部的井的化疗引诱液，使接触带的膜在上部以及形成趋化梯度。温育时间是依赖于细胞类型和化学引诱被使用。
注：进一步的测试可能需要确定潜伏期。
注意：对于贴壁细胞，迁移的细胞将附着在膜1,8的另一侧。迁移的细胞进行定量可以执行以下步骤2.4到2.8（步骤2.4-2.8不需要在无菌环境中进行的）来执行。对于非粘附细胞，迁移的细胞将下降到介质中的下腔室。迁移细胞的数目可以通过使用血细胞计数器或算流式细胞仪5。 - 从板块中删除Transwell小插件。使用棉签多次需要小心地取出，但没有从膜的顶部而不损坏它迁移媒体和剩余的细胞。
- 加600-1,000微升70％乙醇到24孔板的孔中。将transwell小插件放入70％乙醇中10分钟，以使细胞固定。从24孔板取出Transwell小插入和使用棉签从膜的顶部取出剩余的乙醇。允许的transwell小膜干燥（通常10-15分钟）。
- 加600-1,000微升0.2％的结晶紫为24孔板的孔和膜定位成它用于染色。在室温下孵育5-10分钟。
- 轻轻地从膜的顶部用移液管尖端或棉棒取出结晶紫。非常小心，以避免洗去固定的细胞，可以根据需要沾膜进入蒸馏水多次以除去过量的晶体VIOLE万吨。允许的transwell小膜干燥。
- 视图下方倒置显微镜和计数细胞在不同视场的数目，以得到通过膜迁移朝向化学引诱并附着在膜的下侧（ 图3）细胞的平均总和。
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Representative Results
这里提出的伤口闭合试验和Transwell小细胞迁移测定法使用小鼠B16F10黑素瘤细胞作为模型系统进行。在伤口愈合测定法，B16F10细胞接种在6孔组织培养板中并生长至24小时内100％汇合。使用使用时间推移显微镜记录枪头和伤口闭合（细胞迁移）生成约700μm宽的伤。可替换地，伤口闭合，也可以通过采取快照图片在不同时间点，如果时间推移显微镜不可用1研究。四张照片的时间推移系列在0，4,8，和12小时的时间点都显示在图1的基础上的伤口的宽度，我们计算了细胞迁移的迁移距离和速度在40.42微米/小时（ 图1B）。时间推移的照片也被组装成使用ImageJ的程序（见补充视频）的视频。钍Ë动态细胞迁移过程中可以研究。 如图2，用伪足（前沿）和尾部（后缘）迁移细胞的形态清楚地观察到。
在Transwell小室的细胞迁移测定中，24孔插入从康宁被使用。 B16F10黑素瘤细胞重新悬浮在1×10 6个细胞/在迁移缓冲液组成的DMEM培养基和0.1％BSA的无血清毫升的浓度。从在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中生长的NIH3T3成纤维细胞条件培养基被用作化学引诱。 100μl的B16F10细胞的溶液中加入上在上部腔室和600μl的化学引诱的transwell小室膜的顶部加入到下部腔室或迁移缓冲液相同的体积加入作为阴性对照。如在描述过程进行细胞迁移。迁移细胞的数目可以通过计数在显微镜下或在被量化合影留念（ 图3B）。如图3，有一个15倍的增加在细胞中相比于对照迁移缓冲液（ 图3C）朝向化学引诱迁移。 Transwell小法检查细胞的趋化，对化学引诱定向细胞迁移。
图1。B16F10黑色素瘤细胞伤口愈合实验（A）在一个16小时的伤口缝合法照片是用延时显微镜拍摄每5分钟。于0时，代表图片4,8，和12小时都显示和比例尺（400微米）都增加了伤口宽度测量（B）伤口的距离进行测定，单位为μm。散点图来显示伤口随时间的宽度和伤口闭合的速率计算。基因率的R 2值，线性回归是运行在用GraphPad Prism软件（5.0版为GraphPad软件公司）伤口宽度数据。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2。从伤口闭合检测的时间推移显微镜，在一个16小时营业的伤口缝合法图片迁移B16F10细胞的形态进行了每5分钟。所有的照片都是组装成使用ImageJ的程序（5帧/秒）的视频。涉及细胞极化，伪足延伸，后缘回缩细胞迁移进行了观察。从34.6，36.6，和38.6秒的时间的视频的图像点被提出（对应于实际时间推移迁移时间的视频时间（小时：分钟：秒）34.6秒，14:20:00; 36.6秒，十五时10分零零秒; 38.6秒，16点00分零零秒，分别）。比例尺为50μm。 请点击此处查看该图的放大版本。
B16F10黑色素瘤细胞（A）图3。Transwell小室迁移实验，用于测量细胞迁移和侵袭Transwell小插入装置的示意图（B）B16F10细胞的transwell迁移的代表性图片。细胞迁移缓冲液和NIH3T3细胞的条件培养基中加入到下室作为阴性对照和化学引诱剂，分别。如在程序中描述细胞的迁移和染色用结晶紫后，迁移细胞（紫染色）的图片使用MICR拍摄OSCOPE用10倍的目标（总放大倍数100倍）。膜的毛孔也可以观察到图中的无数小，圆形，深色圆点。细胞移植对迁移缓冲区或化疗引诱（在100倍总放大倍数5图片字段的平均值）。（三）定量请点击此处查看此图的放大版本。
一个B16F10黑色素瘤细胞伤口愈合试验的补充视频。时间推移视频。照片拍摄，每5分钟进行16小时以产生193的图片。所有的照片都是组装成使用ImageJ的程序（5帧/秒）的视频。请参阅下载下的“Supplementary_Video_JOVE.avi”的补充文件。
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Discussion
细胞迁移是在癌症研究，研究的一个重要方面，它也可以应用到发育，免疫和伤口愈合研究。细胞培养伤口闭合试验和Transwell小细胞迁移和侵袭测定法揭示了细胞迁移性的行为的详细信息，并且可以用于研究细胞迁移1,2,10,14的分子机制。我们的研究中使用这些细胞运动性测定法来确定B16F10黑色素瘤细胞系的迁移速度和侵袭能力。
细胞伤口愈合试验检查一个特定细胞系的迁移，并随后关闭在细胞融合盘发伤口的能力。该测定是用基本设备和相比于现有的方法组高度可访问的是测量细胞迁移的简单方法。在伤口缝合法的一些变化可能会在各治疗组中查到，但是有几个步骤，马Ÿ采取有助于减轻它。减少变化的一个潜在的方法是在板的每个样品与细胞相同数量的，以实现同步汇合，并在每个实验开始维持健康的细胞状态。可能需要的细胞培养实验多次试验，以确定需要实现独立样本之间不变的汇合和健康细胞状态的确切电镀号码。此外，增加样本量也将减少变异。对于需要超过24小时的温育时间，观察显著迁移较慢迁移的细胞系，它可以方便地使用阿非迪霉素或其他增殖抑制剂，以防止细胞数目的变化，可能会影响测定的结果。
掌握利用细胞伤口愈合试验，单细胞的迁徙行为的一个详细的评估，以研究细胞迁移速度的能力后，也可完成14。此外，继无极第二闭合测定细胞可以是固定的，并涉及与细胞骨架结构和动力学的各种蛋白质可被视为与使用免疫细胞化学实验2进行评价。这种分析可能会导致进一步的详细的生化改变以前未知的。细胞伤口愈合试验也非常适合于实时活细胞成像使用时间推移荧光显微镜来研究迁移动态。例如，肌动蛋白-GFP，微管蛋白-GFP和桩蛋白-GFP融合蛋白可表达于活细胞中的细胞迁移或粘附18,19不同的时间点可以看到蛋白的定位。伤口闭合测定的一些限制包括，例如，它不适合于非贴壁细胞，并且不测量细胞的趋化。另外，一些细胞系中有一种倾向，从板分离后，立即在伤口是由（ 例如 HEK293T细胞）。对于这些细胞系，它是更好地使用预铸伤口板或TRANSWELL下面迁移实验讨论。
Transwell小细胞迁移和侵袭实验提供的细胞来检测特定的化学引诱并迁移通过向它的物理屏障的能力彻底的分析。此测试可进一步用于通过将层细胞外基质或内皮细胞上的transwell膜的顶部上的层，以模仿细胞外基质的侵袭和外渗1,10的过程来研究细胞的侵袭。此外，侵透基底膜下，细胞骨架蛋白与荧光显微镜结合免疫染色可能的3-D入侵期间对形态学研究价值。使用Transwell小细胞侵袭测定法的一个局限是细胞侵袭的该时移的数据是很难达到与传统的显微镜和活这一过程的细胞成像是复杂的。
为了获得准确的结果，有台铁在几个关键步骤nswell细胞迁移和入侵检测是十分重要的。首先，由于细胞的迁移速度可能变化很大不同细胞类型之间的几个初步实验必须执行通过将在该过程中使用的特定的迁移时间帧。其次，化疗诱也必须适用于感兴趣的细胞类型。广泛的化疗引诱应检查测量的最终迁移和特定细胞类型的侵袭能力之前，前面的实验。成纤维细胞条件培养基是常用的一种强烈的化疗诱为广泛类型的细胞。如果一个单一纯化学引诱是用来确保化疗引诱的受体表达在感兴趣的细胞类型。最后，对细胞侵袭实验确定基质胶或其他细胞外基质的涂层是均匀的，以减少实验误差。总之，虽然有一定的局限性，在高度这里描述的可访问的细胞迁移测定法可用于广泛的生物学的研究是有用的。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-073 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini | 100106 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco | 25200-056 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-250 | |
| Crystal violet | Sigma | C0775-100G | Dissolved in water at 0.2% |
| Cell disassociation buffer | Gibco | 13151-014 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Model # 3145 | |
| SterilGARD biosafety hood | The Baker Company, Inc. | Model # VBM-600 | |
| EVOS Fl inverted microscope | Thermo Fisher Scientific | Model # AMF-4302-US | |
| Tissue culture plate | Becton Dickinson | 353046 | Catalog number varies depending on the type of culture plate |
| Corning Transwell insert | Fisher | 07-200-150 | Catalog number varies depending on the pore size of the membrane |
References
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