Vaak gebruikt, zijn zeer toegankelijk methoden voor de behandeling van cel migratie en invasie in vitro beschreven. De eerste methode is de cel wondsluiting assay die celmotiliteit meet. De tweede methode is de transwell migratie en invasie assay die de chemotactische en invasieve vermogen van cellen beoordeelt.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In vitro cel-migratie en invasie assays
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Migratieverschijnselen zijn een belangrijk kenmerk van levende cellen en essentieel voor normale ontwikkeling, immuunrespons en ziekteprocessen zoals kankermetastase en ontsteking. Methoden om celmigratie te onderzoeken zijn zeer nuttig en belangrijk voor een breed scala aan biomedisch onderzoek zoals kankerbiologie, immunologie, vasculaire biologie, celbiologie en ontwikkelingsbiologie. Hier gebruiken we tumorcelmigratie en -invasie als voorbeeld en beschrijven twee verwante assays om de meest gebruikte, gemakkelijk toegankelijke methoden te illustreren om deze processen te meten. De eerste methode is de wondsluitingstest in celcultuur waarbij een kras wordt gemaakt op een confluent celmonolayer. De snelheid van wondsluiting en celmigratie kan worden gekwantificeerd door met een regelmatige inversiemicroscoop op verschillende tijdsintervallen momentopnamen te maken. Gedetailleerder celmigratiegedrag kan worden gedocumenteerd met behulp van het time-lapse microscopiesysteem. De tweede methode die in dit artikel wordt beschreven, is de transwell celmigratie- en invasie-assay die het vermogen van celbeweeglijkheid en invasiviteit richting een chemo-attractant gradiënt meet. Het is ons doel om deze methoden op een zeer toegankelijke manier te beschrijven, zodat de procedures met succes kunnen worden uitgevoerd in onderzoekslaboratoria, zelfs alleen met een basisopstelling voor celbiologie.
Inleiding
Beweeglijkheid is een essentieel kenmerk van levende cellen. Celmigratie wordt betrokken bij het ontwerp van het leven, embryonale ontwikkeling, immuunrespons en vele pathologische processen zoals kanker metastase en ontsteking 1-9. Daarom methoden naar cel trekkende gedrag te bestuderen zijn zeer nuttig research tools voor een breed scala van disciplines in de biomedische wetenschappen, biologie, biotechnologie en aanverwante gebieden.
De studie van celmigratie in kankeronderzoek is van bijzonder belang als de belangrijkste doodsoorzaak bij kankerpatiënten is gerelateerd aan metastatische progressie. Om voor kanker door het ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Cell Culture Wound Closure Assay
- Los cellen uit de weefselkweek plaat met behulp van 0,25% trypsine-EDTA-oplossing. Pellet cellen in een 15 ml conische buis door centrifugeren, het supernatans aspireren, en opnieuw te schorten cellen in cultuur media. Plate het juiste aantal cellen in een 6-wells plaat 100% confluentie in 24 uur.
Opmerking: Tests nodig zijn om de tijd en aantal cellen 100% samenvloeiing bereiken door het celtype en de omvang van de put wordt gebruikt bepalen (bijvoorbeeld 1 x 10 6 B16F10 melanoma cellen worden gezaaid in een putje van een 6-well platen 24 uur voor de wond generatie). Alternatief kan 12 putjes of 24 put....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De wondsluiting assay en de transwell celmigratie test hier gepresenteerd werden uitgevoerd met muizen B16F10 melanoma cellen als modelsysteem. In de wondsluiting test werden B16F10 cellen uitgezaaid in 6-well weefselkweek plaat en gekweekt tot 100% confluentie in 24 uur. Een wond van ongeveer 700 micrometer breed werd gegenereerd met behulp van een pipet en de sluiting van de wond (cel migratie) werd opgenomen met de time-lapse microscopie. Als alternatief kan wondsluiting ook bestudeerd worden door het nemen van momen.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Celmigratie is een belangrijk aspect voor een studie in kankeronderzoek en het kan ook worden toegepast voor ontwikkeling, immunologische en wondgenezing studies. De celkweek wondsluiting assay en de transwell celmigratie en invasie assays tonen details cel migrerende gedrag en kan worden gebruikt om de moleculaire mechanismen van celmigratie 1,2,10,14 onderzoeken. Onze studie gebruikte deze cel beweeglijkheid assays om de migratie snelheid en invasie mogelijkheden van een B16F10 melanoomcellijn bepalen.
.......Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
De auteurs danken Mike Myles, Sam Saunders en C.W. Elton van de ECU Multimedia & Technology Services voor hun hulp bij de videoproductie. We erkennen de subsidieondersteuning van North Carolina Biotechnology Center, Golfers against Cancer, Brody Brothers Endowment Fund, American Heart Association en ECU/Vidant Cancer Research and Education Fund (L.V.Y. en M.J.R.).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-073 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini | 100106 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco | 25200-056 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-250 | |
| Crystal violet | Sigma | C0775-100G | Opgelost in water bij 0,2% |
| Cell disassociation buffer | Gibco | 13151-014 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Model # 3145 | |
| SterilGARD biosafety hood | The Baker Company, Inc. | Model # VBM-600 | |
| EVOS Fl inverted microscope | Thermo Fisher Scientific | Model # AMF-4302-US | |
| Tissue culture plate | Becton Dickinson | 353046 | Catalognummer varieert afhankelijk van het type kweekplaat |
| Corning Transwell insert | Fisher | 07-200-150 | Catalognummer varieert afhankelijk van de poriegrootte van de membraan |
Referenties
- Castellone, R. D., Leffler, N. R., Dong, L., Yang, L. V. Inhibition of tumor cell migration and metastasis by the proton-sensing GPR4 receptor. Cancer Lett. 312 (2), 197-208 (2011).
- Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Rev. 28, (2009).
- Lau....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
