Summary
בשימוש נפוץ, שיטות נגישות ביותר לבחינת נדידת תאים ופלישה במבחנה מתוארות. השיטה הראשונה היא assay סגירת פצע תא המודד את תנועתיות תא. השיטה השנייה היא assay ההגירה והפלישה transwell שמעריך את chemotactic וקיבולת פולשני של תאים.
Introduction
תנועתיות היא תכונה חיונית של תאי חיים. נדידת תאים מעורבת בתפיסה של חיים, התפתחות עוברית, תגובה חיסונית, ורבים תהליכים פתולוגיים כגון גרורות סרטן ודלקת 1-9. לכן, שיטות ללמוד התנהגות נדידה סלולרי הן כלי מחקר שימושיים מאוד עבור מגוון רחב של תחומים במדעים ביו ושדות, ביולוגיה, הנדסה גנטיות, קשורים.
המחקר של נדידת תאים בחקר הסרטן הוא עניין מיוחד כגורם העיקרי למוות בחולי סרטן קשור להתקדמות גרורתי. על מנת שהסרטן להתפשט ולהפיץ בכל הגוף, תאים סרטניים חייבים לנדוד ולפלוש דרך מטריצה תאית (ECM), intravasate למחזור דם, לצרף לאתר מרוחק, ובסופו extravasate כדי ליצור מוקדים רחוקים 1,10-12. שיטות ביולוגיות שונות עשויות להיות מועסקות על מנת ללמוד את האירועים הללו בפירוט. פצע סגר תרבית התאיםמבחני ד הגירת transwell והפלישה נמצאים בשימוש נרחב בקהילה המדעית 1,10. בדיקות אלה יכולות לספק את הנתונים הדרושים שעשויות לאפשר הבנה של אופן שגם סוג תא מסוים באופן ספונטני יכול להעביר או להגיב להכימותרפיה attractant וdirectionally להגר אליה. כמה פנוטיפים נודדים כבר תיארו. תאים עשויים לנדוד בצורת תא בודדת כגון ראתה בmesenchymal או תנועה כמו אמבואידית-או על ידי תנועה רב תאית שכותרת הגירה קולקטיבית או תא הזרמה 13. השיטה של תנועה המשמשת בתאי ניעתי ניתן לראות בקלות באמצעות assay סגירת פצע תרבית תאים.
בין הדרכים הרבות ללמוד נדידת תאים, assay סגירת פצע התא הוא אחד הפשוט ביותר. שיטה זו שימושית כדי לקבוע את יכולת הנדידה של המוני תא כולו. כאשר נלקחו צעד נוסף ניתן להשתמש בו כדי לצפות במאפיינים המורפולוגיים של התאים בודדים במהלך הנדידה 14. בעקבות הניתוח של סגירת פצע פנוטיפים רבים עשויים להתגלות. מדידת המרחק הסגור לאורך זמן בהשוואה לשליטה עשויה לחשוף שינויי הגירה ספציפיים או הפנוטיפ נודד לקוי שהיה ידוע קודם לכן. יתר על כן, היווצרות אחת lamellipodium התא, הכחשה זנב, ותנועה כיוונית עשויות לתת רמזים למה שעלול להיפגע או משופר בתאים של עניין 14.
הגירת transwell ומבחני פלישה ניתן להשתמש כדי לנתח את היכולת של תאים בודדים להגיב directionally להכימותרפיה משיכה שונות בין אם הם כמוקינים, גורמי גדילה, שומנים, או נוקלאוטידים 4,5,8,15,16. היא עשויה גם להעריך את יכולת נדידת ההפרש נובעת מביטוי היתר של קולטן 1,14. גם מבחני אלה יכולים לשמש כדי לזהות ולאפיין את הרגולטורים המרכזיים של נדידת תאים כמו משפחת Rho של GTPases הקטן 2. בעקבות קצר אלה בקלות ובaccesבדיקות sible, במצב של נדידת תאים ואת היכולת של תא לפלוש לתוך מטריצת 3-D יכולים גם להיות נחושות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Assay סגירת פצע תרבית תאים
- ניתוק תאים מצלחת תרבית הרקמה באמצעות 0.25% פתרון טריפסין-EDTA. גלולה תאים בצינור חרוטי 15 מיליליטר על ידי צנטריפוגה, לשאוב supernatant, מחדש תאים להשעות תקשורת והתרבות. פלייט המספר המתאים של תאים בצלחת 6 היטב למפגש 100% ב24 שעות.
הערה: ייתכן שתהיינה צורך בדיקות כדי לקבוע את הזמן ואת מספר התאים כדי להשיג מפגש 100% בשל סוג התא ואת גודל בשימוש גם (לדוגמא, 1 x 10 6 B16F10 תאים מלנומה הם זורעים בטוב של צלחת 6 היטב 24 שעות לפני דור הפצע). לחלופין, ניתן להשתמש ב12 גם צלחות או 24 גם.
הערה: אם זמין, יכולים להיות שנזרעו תאים לתוך תרבות-Insert (מLLC ibidi) על צלחת רקמת תרבות מטופלים עושה את הפצע מראש להק. תרבות-Insert יכול להגן על פני השטח של צלחת תרבית רקמה מנזק על ידי קצה פיפטה. אם תרבות-Insert משמש צעד השמט1.2. - בסביבת סטרילית (בדרך כלל מכסה המנוע בטיחות ביולוגי) להשתמש קצה פיפטה 200 μl ללחוץ בחוזקה נגד העליון של הצלחת בתרבית רקמה ובמהירות להפוך את פצע אנכי למטה דרך monolayer התא. קצה פיפטה בגדלים שונה ניתן להשתמש כדי להפוך את גודל הפצע שהוא רצוי. אל תשתמש בכוח מופרז נגד צלחת תרבית הרקמה עם קצה פיפטה כפי שהוא עלול לגרום נזק לפני השטח. אם הפצע הוא להק מראש, ניתן להשמיט את הצעד הזה.
- בזהירות לשאוב תקשורת ופסולת תא. לאט לאט להוסיף מספיק תקשורת ותרבות על הקיר גם כדי לכסות את תחתית היטב ולהימנע מניתוק תאים נוספים. בעקבות הדור והבדיקה של הפצע צריכה לקחת תמונה ראשונית. מניחים את צלחת תרבית רקמה בחממה שנקבעה בטמפרטורה המתאימה וCO הריכוז 2 (בדרך כלל 37 ° C ו 5% CO 2).
- במספר נקודות זמן, למשל כל 3 שעות, להסיר את הצלחת מincubatאו ולמקם אותו תחת מיקרוסקופ הפוכה כדי לצלם תמונה תמונת מצב ולבדוק לסגירת פצעים. אם מיקרוסקופיה הזמן לשגות זמינה, לקחת תמונה כל מספר X של דקות (בדרך כלל מתחיל עם כל 5 דקות) לכל משך זמן בטמפרטורה ו2 תא מבוקר CO. בהתאם לסוג התא, זמן סגירת פצע עשוי להשתנות.
- כדי לנתח את התוצאות של תמונות תמונה, למדוד את המרחק בצד אחד של הפצע האחר באמצעות סרגל קנה מידה. לנתח וסגירת פצע באופן ברור בהווה לאורך זמן באמצעות עלילת פיזור או גרף עמודות, למשל איור 1.
- כדי לנתח את תמונות הזמן לשגות, לייבא את התמונות לתוך תוכנת ImageJ (זמינה באופן חופשי בhttp://rsb.info.nih.gov/ij/) לעשות וידאו. כדי לעשות ImageJ הפתוח, לחץ על קובץ, יבוא, ותמונה ברצף. מצא את הקובץ עם תמונות; לחץ על התמונה הראשונה בקובץ. לשמור וידאו על ידי בחירת קובץ, שמירה בשם וAVI. תאים נודדים בודדים אפשר לראות לCharacterize תנועה כיוונית. יתר על כן, מאפיינים מורפולוגיים כגון היווצרות lamellipodia והכחשת קצה נגררת ניתן ללמוד גם כן (איור 2 ווידאו נוסף).
2. נדידת תאי Transwell ופלישת Assay
- בסביבת סטרילית (בדרך כלל מכסה המנוע בטיחות ביולוגי) לנתק את התאים מן צלחת תרבית רקמה באמצעות חיץ אינו אנזימטית התנערות תא או 0.25% פתרון טריפסין-EDTA, תאי גלולה ידי צנטריפוגה, ולשאוב את התקשורת הקיימת עוזבת את תאי pelleted. Re-להשעות תאים בתרבית תאי תקשורת חופשית בסרום המכילה BSA 0.1% (אלבומין בסרום שור).
הערה: בהתאם לשורת התאים נחקר 0.25% טריפסין-EDTA עלול להשפיע על נדידת תאים ופלישה בשל המחשוף של קולטנים שונים על פני תא 17.
שים לב: מספר התאים למ"ל תלוי בגודל של התאים. ייתכן שתהיינה צורך בבדיקות נוספות כדי למצוא את צפיפות זריעה שהפרהVides את התוצאות הטובות ביותר. בדרך כלל 1 x 10 6 תאים / מיליליטר הוא נקודת התחלה טובה עבור רוב סוגי תאים בעת השימוש ב24 גם transwell להוסיף. יש מגוון של גדלי transwell הכנס ואת מספר התאים הוסיפו צריכה להיות מותאם לבהתאם. - של פתרון תא פלייט 100 μl על גבי קרום המסנן בכנס transwell והדגירה של 10 דקות 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 כדי לאפשר לתאים להתיישב.
הערה: הגודל הנקבובית המסוים של קרום transwell משמש תלוי בגודל הבודד של התאים במדגם. לדוגמא, אם התאים הם קטנים מדי שהם יכולים לעבור דרך הנקבוביות ללא הצורך כדי להקל על הגירה או אם הם גדולים מדי הם עשויים שלא להתאים דרך הנקבוביות. ישנם כמה מוסיף transwell עם גודל נקבובית שנעים בין 3 מיקרומטר, 5 מיקרומטר, ו8 מיקרומטר עבור מבחני נדידת תאים. מוסיף transwell זמינים מסחרי מחברות כמו קורנינג.
שים לב: מ 'transwellassay igration ניתן לשנות בקלות לבצע את assay פלישת תא. כדי לעשות זאת, להוסיף חומרים (ECM) מטריצה תאית על גבי קרום transwell ולאחר מכן להוסיף את התאים על גבי ECM. לדוגמא, Matrigel מופשר ומעובה על קרח, ולאחר מכן 30-50 μl של Matrigel מתווסף 24 גם transwell להוסיף והתגבש בחממה 37 מעלות צלזיוס למשך 15-30 דקות כדי ליצור שכבת ג'ל דקה. פתרון תא מתווסף על גבי ציפוי Matrigel כדי לדמות פלישה באמצעות מטריקס.
שים לב: יש הבדלים ברורים בין נדידת תאי transwell ומבחני פלישת תא transwell. Assay נדידת תאי transwell מודד את יכולת chemotactic של תאים כלפי הכימותרפיה attractant. Assay פלישת תא transwell, לעומת זאת, מודד שני chemotaxis תא ואת הפלישה של תאים באמצעות מטריצה תאית, תהליך שהוא נמצא בדרך כלל בהתפשטות גרורה סרטנית או התפתחות עוברית. - בעזרת פיפטה, מאוד carefully להוסיף 600 μl של הכימותרפיה attractant הרצויה לתוך החלק התחתון של התא התחתון בצלחת 24 גם. הוסף את הכימותרפיה attractant מבלי להזיז את הכנס transwell ולמנוע יצירת בועות. ודא את נוזל הכימותרפיה attractant בבאר התחתונה במגע עם הקרום בבאר העליונה כדי ליצור שיפוע chemotactic. זמן דגירה תלוי בסוג התא והכימותרפיה attractant בשימוש.
הערה: ייתכן שתהיינה צורך בדיקות נוספות על מנת לקבוע את תקופת הדגירה.
הערה: תאים חסיד, התאים נדדו יצרפו לצד השני של הקרום 1,8 האחר. כימות של תאים נדדו יכולה להתבצע בעקבות צעדי 2.4-2.8 (שלבים 2.4-2.8 לא צריכה להתבצע בסביבת סטרילית). לתאים שאינם חסיד, התאים נדדו יירד לתקשורת בתא התחתון. מספר התאים נדדו ניתן לספור באמצעות hemocytometer או זרימת cytometer 5. - הסר את תוסף transwell מהצלחת. השתמש המוליך כותנה שקצה כמספר פעמים הדרוש כדי להסיר בזהירות את התקשורת ותאים הנותרים שלא היגר מהחלק העליון של הקרום ללא פגיעה בו.
- הוספת 600-1,000 μl של 70% אתנול לתוך באר של צלחת 24 גם. במקום להכניס transwell לתוך אתנול 70% ל10 דקות כדי לאפשר קיבוע תא. הסר transwell להכניס מצלחת 24 היטב ולהשתמש במוליך כותנה שקצה כדי להסיר אתנול שנותר מהחלק העליון של הקרום. לאפשר קרום transwell לייבוש (בדרך כלל 10-15 דקות).
- הוספת 600-1,000 μl של .0.2% סגולים גביש לתוך באר של צלחת 24 גם ולמקם את הקרום לתוכו מכתימה. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5-10 דקות.
- להסיר בעדינות סגולה גביש מהחלק העליון של הקרום עם קצה פיפטה או המוליך כותנה שקצהו. בזהירות רבה, כדי למנוע כביסה את התאים קבועים, טובל את הקרום למים מזוקקים כמספר פעמים הדרוש כדי להסיר את גלאים גביש העודפיםלא. לאפשר קרום transwell לייבוש.
- צפו מתחת מיקרוסקופ הפוכה ולספור את מספר התאים בשדות מבט שונים כדי לקבל סכום ממוצע של תאים שהגרו דרך הממברנה לכיוון הכימותרפיה attractant ומחוברים בחלקו התחתון של הקרום (איור 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Assay פצע הסגר וassay נדידת תאי transwell מוצג כאן בוצעו באמצעות תאים מלנומה B16F10 העכבר כמודל למערכת. ב assay סגירת פצע, B16F10 תאי זרע בצלחת תרבית רקמת 6 היטב ומבוגר כדי מפגש 100% ב24 שעות. פצע של רחב כ 700 מיקרומטר נוצר באמצעות פיפטה קצה וסגירת הפצע (נדידת תאים) נרשם באמצעות מיקרוסקופיה הזמן לשגות. לחלופין, סגירת פצע יכולה להיות גם למדה על ידי לקיחת תמונות תמונת מצב בנקודות זמן שונה, אם מיקרוסקופיה זמן לשגות אינה זמינה 1. ארבעה תמונות מסדרת הזמן לשגות ב 0, 4, 8, ונקודות זמן 12 שעות מוצגות באיור 1. בהתבסס על הרוחב של הפצע, חישבנו את מרחק הגירה ואת המהירות של נדידת התאים ב40.42 מיקרומטר / שעה (איור 1). תמונות הזמן לשגות גם נאספו לתוך וידאו באמצעות תכנית ImageJ (ראה וידאו נוסף). היכול להיות למד תהליך נדידת תאים דינמי דואר. כפי שניתן לראות בתרשים 2, המורפולוגיה של תאים נודדים עם lamellipodia (קצה מוביל) וזנבות (קצה נגרר) היו ברורים שנצפתה.
ב assay נדידת תאי transwell, מוסיף 24 גם מקורנינג היו בשימוש. B16F10 תאים מלנומה היו מחדש תלויים בריכוז של 1 x 10 6 תאים / מיליליטר במאגר ההגירה בהיקף של מדיום DMEM וBSA 0.1% ללא סרום. מדיה אוויר מתאי פיברובלסטים NIH3T3 גדלו במדיום DMEM המכיל 10% בסרום שור עוברי שימשה כהכימותרפיה attractant. של B16F10 תאים 100 μl נוספה על גבי קרום transwell בחדר העליון ו600 μl של הכימותרפיה attractant התווספה לתא התחתון או באותו הנפח של חיץ הגירה הוסיף כביקורת שלילית. נדידת תאים בוצעה כפי שתוארה בנוהל. מספר התאים נדדו ניתן לכמת על ידי ספירה מתחת למיקרוסקופ או בתמונות שצולמו (איור 3 ב). כפי שניתן לראות באיור 3, חלה עלייה של פי 15 בתאים נודדים לכיוון הכימותרפיה attractant בהשוואה למאגר הגירת השליטה (איור 3 ג). Assay transwell בוחן chemotaxis הסלולרי, נדידת תאים כיוונית כלפי הכימותרפיה attractant.
איור 1. Assay B16F10 תאים מלנומה סגירת פצע. (א) בתמונות assay סגירת פצע 16 שעות נלקחו כל 5 דקות באמצעות מיקרוסקופ הזמן לשגות. תמונות נציג ב 0, 4, 8, ושעות 12 מוצגות וברים בקנה מידה (400 מיקרומטר) מתווספים למדידת רוחב פצע. (ב ') במרחק של הפצע נמדד במיקרומטר. עלילת פיזור שימשה כדי להציג את רוחב הפצע לאורך זמן ובקצב סגירת פצע היה מחושב. לגןלדרג את ערך 2 r, רגרסיה ליניארית נדרסה על נתוני רוחב פצע באמצעות תוכנת GraphPad פריזמה (גרסה 5.0, GraphPad התוכנה, Inc). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. מורפולוגיה של תאים נודדים B16F10 ממיקרוסקופיה הזמן לשגות של assay סגירת פצע. בתמונות assay סגירת פצע 16 שעות נלקחו כל 5 דקות. כל התמונות נאספו לתוך וידאו באמצעות תכנית ImageJ (5 מסגרות / השנייה). נדידת תאים מעורבת קיטוב תא, הארכת lamellipodia, והכחשה נגררו לקצה נצפתה. תמונות מ34.6, נקודות של הווידאו 36.6, וזמן 38.6 השני הוצגו (זמן וידאו מתאים לזמן הגירת הזמן לשגות בפועל (שעה:) 34.6 שניות שניות, 14:20:00;: דקות 36.6 שניות, 15:10:00; ו38.6 שניות, 16:00:00, בהתאמה). בר סולם 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. Assay Transwell הגירה של תאים מלנומה B16F10. () תרשים של מנגנון הוספת transwell משמש למדידת נדידת תאים ופלישה. (ב ') תמונות מייצגות של הגירת transwell תא B16F10. חיץ נדידת תאים ומדיום סלולרי התנה NIH3T3 נוספו לתא התחתון כביקורת השלילית והכימותרפיה attractant, בהתאמה. לאחר נדידת תאים וצביעה עם סגול גביש כמתואר בנוהל, תמונות של התאים הגרו (המוכתם סגול) נלקחו באמצעות MICRoscope עם אובייקטיבי 10x (סה"כ 100x הגדלה). נקבוביות של ממברנות גם יכול להיבחן כנקודות צבעוניות רבות, קטנה ועגולות וכהות בתמונה. כימות (C) של תאים הנודדים לכיוון חיץ ההגירה או הכימותרפיה attractant (הממוצע של 5 שדות תמונה ב100x הגדלת סך הכל). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
וידאו. וידאו זמן לשגות משלים של assay סגירת פצע תאים מלנומה B16F10. תמונות צולמו כל 5 דקות במשך 16 שעות כדי לייצר 193 תמונות. כל התמונות נאספו לתוך וידאו באמצעות תכנית ImageJ (5 מסגרות / השנייה). ראה את הקובץ המשלים "Supplementary_Video_JOVE.avi" תחת הורדות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
נדידת תאים היא היבט חשוב ללמוד בחקר סרטן וזה יכול להיות מיושם גם ללימודי ריפוי התפתחותיים, חיסוניים ופצע. תרבית התאים בסופו של assay סגר ומבחני נדידת תאי transwell והפלישה לחשוף מידע מפורט של התנהגויות נדידת תאים ויכולים לשמש כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של תא הגירה 1,2,10,14. המחקר שלנו השתמש במבחני תנועתיות תא אלה כדי לקבוע את מהירות הגירה ופלישת היכולות של שורת תאים מלנומה B16F10.
Assay סגירת פצע התא בוחן את יכולתם של שורת תאים מסוימת להגר ולאחר מכן לסגור את פצע שנעשה בצלחת ומחוברות של תאים. assay זה הוא נגיש מאוד לקבוצות עם ציוד בסיסי ובהשוואה לשיטות קיימות הוא דרך פשוטה למדוד את נדידת תאים. וריאציה מסוימת בassay סגירת פצע ניתן למצוא בקבוצות טיפול פרטניות, אבל יש כמה צעדים שmaלהילקח y כדי לעזור להפחית את זה. שיטה אפשרית אחד כדי להפחית וריאציה היא לצלחת מדגם זה עם אותו המספר של תאים כדי להשיג מפגש סינכרוני ולשמור על מעמד תא בריא בתחילתו של כל ניסוי. ייתכן שיהיו צורך מספר ניסויים של ניסויי תרבית תאים כדי לקבוע את המספר המדויק של ציפוי מה שצריך כדי להשיג את נקודת המפגש קבועה ומעמד תא בריא בקרב מדגמים בלתי תלויים. יתר על כן, להגדיל את גודל המדגם יהיה גם להפחית את הווריאציה. לשורות תאים נודדות איטיות שדורשות מעל 24 זמן דגירה שעה להתבונן הגירה משמעותית, זה הוא נוח לשימוש aphidicolin או מעכב התפשטות אחר כדי למנוע שינויי מספר התא שעלול להשפיע על התוצאה של assay.
כאשר ישלוט ביכולת ללמוד מהירות נדידת תאים באמצעות assay סגירת פצע תא, הערכה מפורטת של התנהגויות נודדות תא בודדים יכולה גם להסתיים 14. יתר על כן, בעקבות wound תאי assay סגירה עשויים להיות קבועים, וניתן יהיו לצפות חלבונים שונים מעורבים עם מבנה ודינמיקת cytoskeletal והוערכו באמצעות immunocytochemistry 2. ניתוח זה עלול להוביל לשינויים ביוכימיים מפורטים נוספים ידועים קודם לכן. Assay סגירת פצע התא הוא גם נוח מאוד להדמית תא חי בזמן אמת ללמוד דינמיקת הגירה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הזמן לשגות. לדוגמא, אקטין-GFP, טובולין-GFP, וחלבונים היתוך paxillin-GFP יכולים להיות מבוטאים בתאים חיים כדי לראות את הלוקליזציה של החלבונים בנקודות זמן שונים בנדידת תאים או הידבקות 18,19. מגבלות מסוימות של assay סגירת הפצע כוללות ש, למשל, זה לא מתאים לתאים שאינם חסיד ואינו מודד chemotaxis תא. בנוסף, יש לי כמה שורות תאי נטייה להתנתק מהצלחת מייד לאחר הפצע מורכב (למשל תאי HEK293T). לשורות תאים אלו, עדיף להשתמש בצלחות פצע casted מראש או transwell assay ההגירה נדון בהמשך.
נדידת תאי transwell וassay הפלישה מספק ניתוח מעמיק של היכולת של תאים לחוש הכימותרפיה attractant מסוימת ולהעביר דרך מחסום פיזי כלפיה. בדיקה זו יכולה לשמש בהמשך לחקירת פלישת תא על ידי הוספת שכבה של מטריצה תאית או שכבת תאי האנדותל על גבי קרום transwell לחקות את התהליך של פלישת ECM וextravasation 1,10. בנוסף, בעקבות הפלישה דרך Matrigel, מכתים חיסוני של חלבוני cytoskeletal בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי עשוי להיות בעל ערך למחקר מורפולוגיים במהלך פלישת 3-D. הגבלה של שימוש assay פלישת תא transwell היא שנתוני הזמן לשגות של פלישת תא הוא קשה להשגה עם מיקרוסקופיה הקונבנציונלית ולחיות הדמיה תא של תהליך זה היא מורכבת.
כדי לקבל תוצאות מדויקות, יש כמה שלבים קריטיים במהלך traמבחני נדידת תאים ופלישת nswell שהם בעלי חשיבות. ראשית, מאז מהירות נדידת תאים עשויה להשתנות במידה רבה בין סוגי תאים שונים כמה ניסויים ראשוניים חייבים להתבצע לאמץ מסגרת זמן מסוימת הגירה שתשמש בהליך. שנית, הכימותרפיה attractant חייבת גם להיות רלוונטית לסוג התא של עניין. מגוון רחב של הכימותרפיה משיכה יש לבחון בניסויים שקדמו לפני מדידת ההגירה הסופית ויכולת פלישה לסוג תא מסוים. מדיום מזגן fibroblasts הוא נפוץ כמו הכימותרפיה attractant חזקה עבור מגוון רחב של סוגי תאים. אם נעשה שימוש בכימותרפיה attractant מטוהרת יחידה לוודא כי רצפטורים של הכימותרפיה attractant באים לידי ביטוי בסוג התא של עניין. לבסוף, עבור assay פלישת התא לוודא הציפוי של Matrigel או מטריצה תאית אחרת הוא הומוגנית על מנת למזער וריאציה ניסיונית. לסיכום, אם כי יש כמה מגבלות, מאודמבחני נדידת תאים נגישים המתוארים כאן הם שימושיים עבור מגוון רחב של מחקרים ביולוגיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-073 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini | 100106 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco | 25200-056 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-250 | |
| Crystal violet | Sigma | C0775-100G | Dissolved in water at 0.2% |
| Cell disassociation buffer | Gibco | 13151-014 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Model # 3145 | |
| SterilGARD biosafety hood | The Baker Company, Inc. | Model # VBM-600 | |
| EVOS Fl inverted microscope | Thermo Fisher Scientific | Model # AMF-4302-US | |
| Tissue culture plate | Becton Dickinson | 353046 | Catalog number varies depending on the type of culture plate |
| Corning Transwell insert | Fisher | 07-200-150 | Catalog number varies depending on the pore size of the membrane |
References
- Castellone, R. D., Leffler, N. R., Dong, L., Yang, L. V. Inhibition of tumor cell migration and metastasis by the proton-sensing GPR4 receptor. Cancer Lett. 312 (2), 197-208 (2011).
- Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Rev. 28, (2009).
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Peter, C., et al. Migration to apoptotic "find-me" signals is mediated via the phagocyte receptor G2A. J. Biol. Chem. 283 (9), 5296-5305 (2008).
- Radu, C. G., Yang, L. V., Riedinger, M., Au, M., Witte, O. N. T cell chemotaxis to lysophosphatidylcholine through the G2A receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (1), 245-250 (2004).
- Buul, J. D., Hordijk, P. L. Signaling in leukocyte transendothelial migration. Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. (5), 824-833 (2004).
- Yang, L. V., Heng, H. H., Wan, J., Southwood, C. M., Gow, A., Li, L. Alternative promoters and polyadenylation regulate tissue-specific expression of Hemogen isoforms during hematopoiesis and spermatogenesis. 228 (4), 606-616 (2003).
- Yang, L. V., Radu, C. G., Wang, L., Riedinger, M., Witte, O. N. Gi-independent macrophage chemotaxis to lysophosphatidylcholine via the immunoregulatory GPCR G2A. Blood. 105 (3), 1127-1134 (2005).
- Yoshida, M., Yoshida, K. Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+. Mol. Hum. Reprod. 17 (8), 457-465 (2011).
- Albini, A. Tumor and endothelial cell invasion of basement membranes. The matrigel chemoinvasion assay as a tool for dissecting molecular mechanisms. Pathol. Oncol. Res. 4 (3), 230-241 (1998).
- Fidler, I. J. Critical determinants of metastasis. Semin. Cancer Biol. 12 (2), 89-96 (2002).
- Steeg, P. S. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nat. Med. 12 (8), 895-904 (2006).
- Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. Chemotaxis in cancer. Nat. Rev. Cancer. 11 (8), 573-587 (2011).
- Zhang, Y., et al. Comparative study of 3D morphology and functions on genetically engineered mouse melanoma cells. Integr. Biol. (Camb. 4 (11), 1428-1436 (2012).
- Junger, W. G. Purinergic regulation of neutrophil chemotaxis. Cell. Mol. Life Sci. 65 (16), 2528-2540 (2008).
- Lazennec, G., Richmond, A. Chemokines and chemokine receptors: new insights into cancer-related inflammation. Trends Mol. Med. 16 (3), 133-144 (2010).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17, (2010).
- Cortesio, C. L., Boateng, L. R., Piazza, T. M., Bennin, D. A., Huttenlocher, A. Calpain-mediated proteolysis of paxillin negatively regulates focal adhesion dynamics and cell migration. J. Biol. Chem. 286 (12), 9998-10006 (2011).
- Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. Actin microtubules and focal adhesion dynamics during cell migration. Int. J. Biochem. Cell Biol. 35 (1), 39-50 (2003).
