Summary
Comumente usado, são descritos métodos altamente acessíveis para analisar a migração celular e invasão in vitro. O primeiro método é o ensaio de encerramento de feridas de células que mede a mobilidade celular. O segundo método é o ensaio de migração e invasão transwell que avalia o quimiotáctica e capacidade invasiva de células.
Introduction
Motilidade é uma característica essencial de células vivas. A migração celular está envolvido na concepção de vida, o desenvolvimento embrionário, a resposta imunitária, e muitos processos patológicos, tais como a metástase do cancro e inflamação 1-9. Portanto, métodos para estudar o comportamento migratório das células são ferramentas de pesquisa muito útil para uma vasta gama de disciplinas em ciências biomédicas, biologia, bioengenharia, e áreas afins.
O estudo da migração de células na pesquisa do câncer é de particular interesse como a principal causa de morte em pacientes com câncer está relacionado à progressão metastática. Para que o câncer se espalhar e disseminar por todo o corpo, as células cancerosas devem migrar e invadir através da matriz extracelular (ECM), intravasate em circulação no sangue, anexar a um local distante, e, finalmente, extravasar para formar focos distantes 1,10-12. Vários métodos biológicos podem ser utilizados para estudar estes eventos em detalhe. A cultura de células ferida fechado umd a migração e invasão transwell ensaios são amplamente utilizados na comunidade científica 1,10. Estes testes podem fornecer os dados necessários que possam permitir uma compreensão de como um tipo particular de célula podem migrar espontaneamente ou responder a uma quimioterapia atrativo e direcionalmente migrar em direção a ela. Vários fenótipos migradores foram descritos. As células podem migrar de uma forma única célula, como visto em mesenquimais ou movimento amebóide-like ou pelo movimento multicelular rotulado migração coletiva ou célula streaming de 13. O método de movimento usado em células móveis podem ser facilmente observado utilizando o ensaio de encerramento de feridas de cultura de células.
Entre as várias formas de estudar a migração de células, o ensaio de encerramento de feridas de células é um dos mais simples. Este método é útil para determinar a capacidade de migração de massas de células inteiras. Quando mais um passo que pode ser usado para observar as características morfológicas da célula individual durante a migração 14. Após a análise do fechamento da ferida muitos fenótipos pode ser revelado. Medindo a distância fechado ao longo do tempo, quando comparado com um controle pode revelar alterações de migração específica ou um fenótipo migratório prejudicada que era desconhecida anteriormente. Além disso, a formação única lamellipodium celular, cauda retração, e movimento direcional pode dar pistas para o que pode ser prejudicada ou melhorada nas células de interesse 14.
A migração transwell e ensaios de invasão pode ser utilizada para analisar a capacidade das células individuais para responder direcionalmente para vários quimio-atractores se são quimiocinas, factores de crescimento, lípidos, ou nucleótidos 4,5,8,15,16. Pode também avaliar a capacidade migratória diferencial devido à sobre-expressão de um receptor de 1,14. Estes ensaios também pode ser utilizado para identificar e caracterizar os reguladores-chave da migração de células tais como a família Rho de GTPases pequenas 2. Na sequência destes curto e de fácil acetestes veis, o modo de migração celular e a capacidade de uma célula para invadir numa matriz 3-D também pode ser determinada.
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Protocol
1. Cultura Celular Wound Encerramento Assay
- Separar as células a partir da placa de cultura de tecido usando 0,25% de solução de tripsina-EDTA. Células de pellets em um tubo de 15 ml por centrifugação, aspirar o sobrenadante e as células em meios de cultura re-suspensão. Placa o número adequado de células em uma placa de 6 poços para 100% de confluência em 24 horas.
Nota: Os testes podem ser necessários para determinar o tempo e o número de células para atingir 100% de confluência devido ao tipo de célula e a dimensão do bem a ser utilizado (por exemplo, 1 x 10 6 B16F10 células de melanoma são semeadas em um poço de uma 6 poços da placa, 24 horas antes da geração da ferida). Alternativamente, pode ser utilizado de 12 poços ou de 24 poços, placas.
Nota: Se estiver disponível, as células podem ser semeadas em uma cultura de inserção (a partir de LLC Ibidi) em uma placa de cultura de tecidos tratados fazendo a ferida pré-fundido. Uma cultura-inserção pode proteger a superfície da placa de cultura de tecido de danos por a ponta da pipeta. Se uma Cultura-Insert é usado passo omitir1.2. - Em um ambiente estéril (tipicamente um capuz biossegurança) utilizar uma pipeta de ponta de 200 ul para pressionar firmemente contra o topo da placa de cultura de tecidos e fazer rapidamente uma ferida vertical descendente através da monocamada de células. Uma ponta de pipeta de tamanho diferente podem ser usadas para reduzir o tamanho da ferida, que é desejado. Não use força excessiva contra a placa de cultura de tecidos com a ponta da pipeta, pois pode danificar a superfície. Se a ferida é pré-fundido, este passo pode ser omitido.
- Aspirar cuidadosamente a mídia e os restos celulares. Lentamente, adicionar meios de cultura suficiente contra a parede do poço para cobrir o fundo do poço e evitar separar células adicionais. Após a geração e inspeção da ferida uma visão inicial devem ser tomadas. Colocar a placa de cultura de tecidos numa incubadora à temperatura adequada e concentração de CO 2 (tipicamente 37 ° C e 5% CO 2).
- Em vários momentos, por exemplo, a cada 3 horas, retire a placa da incubatou e colocá-lo sob um microscópio invertido para tirar uma foto instantâneo e para verificar o fechamento da ferida. Se microscopia de lapso de tempo está disponível, tirar uma foto a cada X número de minutos (normalmente começando com a cada 5 minutos) para qualquer duração de tempo em uma temperatura e CO 2 câmara controlada. Dependendo do tipo de célula, o tempo de fechamento da ferida pode variar.
- Para analisar os resultados de imagens em fotografias, medir a distância de um lado da ferida para o outro usando uma barra de escala. Analisar e claramente presente o fechamento da ferida ao longo do tempo através de um gráfico de dispersão ou gráfico de barras, por exemplo, Figura 1.
- Para analisar o lapso de tempo imagens, importar as fotos para o software ImageJ (disponível gratuitamente no http://rsb.info.nih.gov/ij/) para fazer um vídeo. Para fazer isso ImageJ aberto, clique em Arquivo, Importar e, em sequência de imagens. Localize o arquivo com as imagens; clique na primeira foto no arquivo. Salve vídeo, escolhendo Arquivo, Salvar como, e AVI. Células migratórias individuais podem ser observadas a characterize movimento direcional. Além disso, as características morfológicas, tais como formação lamellipodia e arrastando retração da borda podem ser estudados, bem como (Figura 2 e de vídeo suplementar).
2. Transwell migração celular e invasão de Ensaio
- Em um ambiente estéril (tipicamente um capuz biossegurança) separar as células da placa de cultura de tecido usando um tampão de dissociação não enzimática de células ou 0,25% de solução de tripsina-EDTA, as células por centrifugação, e aspirar os meios de comunicação existente deixando as células peletizadas. Re-suspender as células em meio de cultura celular livre de soro contendo 0,1% de BSA (albumina sérica bovina).
Nota: Dependendo da linhagem de células a ser investigado 0,25% Tripsina-EDTA pode afectar a migração celular e invasão devido à clivagem de diversos receptores na superfície das células 17.
Nota: o número de células por ml depende do tamanho das células. Podem ser necessários mais testes para descobrir a densidade de semeadura que provides os melhores resultados. Normalmente 1 x 10 6 células / ml é um bom ponto de partida para a maioria dos tipos de células ao usar a 24 poços transwell inserir. Existe uma gama de tamanhos de pastilhas transwell e o número de células adicionadas deve ser ajustado em conformidade para. - Placa de 100 ul de solução de células no topo da membrana de filtro em um transwell insert e incubar durante 10 minutos a 37 ° C e 5% de CO2 para permitir que as células se estabelecer.
Nota: O tamanho específico dos poros da membrana Transwell utilizado é dependente do tamanho individual das células na amostra. Por exemplo, se as células forem muito pequenas que podem passar através dos poros, sem a necessidade de facilitar a migração ou se elas forem muito grandes não podem passar através dos poros. Existem várias inserções Transwell com tamanho de poro que variam de 3 mM, 5 mM, e 8 mm para os ensaios de migração celular. As inserções Transwell estão comercialmente disponíveis a partir de companhias tais como a Corning.
Nota: O transwell migration ensaio pode ser facilmente modificado para realizar o ensaio de invasão celular. Para fazer isso, adicionar matriz extracelular (ECM) materiais na parte superior da membrana transwell e depois adicionar células no topo da ECM. Por exemplo, Matrigel é descongelado em gelo e liquefeito, e, em seguida, 30-50 mL de Matrigel é adicionada a um 24 bem transwell inserir e solidificado numa incubadora a 37 ° C durante 15-30 minutos de modo a formar uma fina camada de gel. Solução de células é adicionado no topo do revestimento de Matrigel para simular invasão através da matriz extracelular.
Nota: Existem diferenças distintas entre a migração de células transwell e os ensaios de invasão celular transwell. O ensaio de migração celular transwell mede a capacidade quimiotática de células em direção a um quimio-atrativo. O ensaio de invasão celular transwell, no entanto, medidas, tanto a quimiotaxia de células ea invasão das células através da matriz extracelular, um processo que é comumente encontrada em metástase do câncer ou o desenvolvimento embrionário. - Com uma pipeta, muito carefully adicionar 600 ul do quimio-atractor desejado na parte inferior da câmara inferior de uma placa de 24 poços. Adicione o quimio-atrativo, sem mover a inserção transwell e evitar a geração de bolhas. Certifique-se de que o líquido quimio-atractor no poço inferior entra em contacto com a membrana na parte superior do poço, para formar um gradiente quimiotáctica. O tempo de incubação está dependente do tipo de célula e do quimio-atractor de ser utilizado.
Nota: podem ser necessários mais testes para determinar o período de incubação.
Nota: Para as células aderentes, as células que migraram vai anexar o outro lado da membrana de 1,8. A quantificação de células que migraram pode ser realizado seguindo os passos 2,4-2,8 (2,4-2,8 passos não necessitam de ser realizadas num ambiente estéril). Para as células não aderentes, as células migraram vai cair na mídia na câmara baixa. O número de células que migraram podem ser contadas usando um hemocitómetro ou citómetro de fluxo 5. - Remova a inserção da placa transwell. Use um aplicador com ponta de algodão quantas vezes for necessário para remover cuidadosamente a mídia e as células restantes que não migraram a partir do topo da membrana sem danificá-lo.
- Adicionar 600-1.000 ul de etanol a 70% dentro de um poço de uma placa de 24 poços. Coloque a inserção transwell em etanol a 70% durante 10 minutos, para permitir a fixação das células. Retirar transwell insert a partir da placa de 24 poços e utilizar um aplicador com ponta de algodão para remover o etanol remanescente a partir da parte superior da membrana. Permitir que a membrana transwell para secar (tipicamente 10-15 minutos).
- Adicionar 600-1.000 ul de 0,2% de violeta de cristal em um poço de uma placa de 24 poços e posicionar a membrana em que para a coloração. Incubar à temperatura ambiente durante 5-10 minutos.
- Suavemente remover o violeta cristal a partir do topo da membrana com uma ponta de pipeta ou aplicador com ponta de algodão. Com muito cuidado, para evitar lavar as células fixas, mergulhe a membrana em água destilada como quantas vezes for necessário para remover o excesso viole cristalt. Permitir que a membrana Transwell para secar.
- Vista sob um microscópio invertido e contar o número de células em diferentes campos de visão, para obter um valor médio de células que migraram através da membrana para a quimio-atractor e ligados no lado inferior da membrana (Figura 3).
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Representative Results
O ensaio de encerramento de feridas e no ensaio de migração de células Transwell aqui apresentados foram realizadas utilizando células de melanoma de ratinho B16F10 como um sistema modelo. No ensaio de encerramento de feridas, B16F10 células foram semeadas numa placa de 6 poços de cultura de tecidos e crescidas até 100% de confluência em 24 horas. Uma ferida de aproximadamente 700 m de largura foi gerada usando uma ponteira eo fechamento da ferida (migração de células) foi gravado usando a microscopia de lapso de tempo. Alternativamente, fechamento da ferida também pode ser estudado, tendo imagens em fotografias em momentos diferentes se microscopia de lapso de tempo não está disponível 1. Quatro imagens da série time-lapse a 0, 4, 8, e pontos de tempo de 12 horas são mostrados na Figura 1. Com base na largura da ferida, foi calculada a distância de migração ea velocidade da migração celular em 40,42 mM / hr (Figura 1B). O lapso de tempo também fotos foram montadas em um vídeo usando o programa ImageJ (veja o vídeo suplementar). The processo de migração celular dinâmica poderia ser estudada. Como mostrado na Figura 2, a morfologia de migração de células com lamellipodia (bordo de ataque) e caudas (bordo de fuga) foram claramente observados.
No ensaio de migração de células Transwell, foram usadas as inserções de 24 poços a partir de Corning. As células de melanoma B16F10 foram re-suspensas a uma concentração de 1 x 10 6 células / ml no tampão de migração que consiste de meio DMEM e BSA a 0,1% sem soro. O meio condicionado a partir de células de fibroblastos NIH3T3 cultivadas em meio DMEM contendo 10% de soro fetal de bovino foi utilizada como a quimio-atractor. 100 ul de células B16F10 foi adicionado em cima da membrana Transwell na câmara superior e 600 ul de quimio-atraente foi adicionada à câmara inferior ou o mesmo volume de tampão de migração adicionado como um controlo negativo. A migração celular foi realizada como descrito no Processo. O número de células que migraram pode ser quantificada por contagem sob um microscópio ou nofotos tiradas (Figura 3B). Como mostrado na Figura 3, houve um aumento de 15 vezes nas células que migram para a quimio-atractor, em comparação com o tampão de migração de controlo (Figura 3C). O ensaio transwell examina quimiotaxia celular, a migração celular direcional para quimio-atrativo.
De células de melanoma B16F10 ensaio Figura 1. Fechamento da ferida. (A) durante uma de 16 horas de fechamento ferida ensaio fotos foram tiradas a cada 5 minutos, utilizando um microscópio de lapso de tempo. Fotos representativas a 0, 4, 8 e 12 horas são mostrados e barras de escala (400 um) são adicionados para a medição de largura ferida. (B) A distância da ferida foi medida em mM. Um gráfico de dispersão foi utilizado para exibir a largura da ferida ao longo do tempo e a taxa de fechamento da ferida foi calculado. Para geneavaliar o valor de r 2, uma regressão linear foi executado sobre os dados de largura ferida utilizando o software GraphPad Prism (versão 5.0, GraphPad Software, Inc.). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Morfologia de migrar B16F10 células da microscopia de lapso de tempo do ensaio fechamento da ferida. Durante uma de 16 horas de fechamento ferida ensaio fotos foram tiradas a cada 5 minutos. Todas as fotos foram montadas em um vídeo usando o programa ImageJ (5 quadros / segundo). Foi observada a migração de células envolvendo polarização celular, extensão lamellipodia, e à direita retração borda. Imagens de 34,6 pontos, 36,6, e 38,6 segundos de tempo do vídeo foram apresentados (horário de vídeo correspondente ao tempo real migração de lapso de tempo (hr: min: seg) 34.6 segundos, 14:20:00; 36,6 segundo, 15:10:00; e de 38,6 segundos, 16:00:00, respectivamente). Barra de escala 50 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Ensaio de migração Figura 3. Transwell de células de melanoma B16F10. (A) Um diagrama do aparelho de inserção transwell usado para medir a migração celular e invasão. (B) de representação de imagens B16F10 transwell migração celular. Tampão de migração celular e de meio condicionado de células NIH3T3 foram adicionados à câmara inferior, como controlo negativo e quimio-atractor, respectivamente. Após a migração celular e coloração com cristal violeta, conforme descrito no procedimento, as imagens das células migraram (manchadas roxo) foram feitas usando um microscope com uma objetiva de 10x (100x total de ampliação). Os poros das membranas também pode ser observado como os inúmeros pontos coloridos pequenos, redondos e escuros na imagem. (C) Quantificação de células que migram para o tampão de migração ou quimio-atrativo (Média de 5 campos de imagem em 100x total). favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Video. Vídeo Time-lapse de um ensaio de fechamento da ferida de células de melanoma B16F10. As fotografias foram tiradas a cada 5 minutos durante 16 horas para gerar imagens 193. Todas as fotos foram montadas em um vídeo usando o programa ImageJ (5 quadros / segundo). Consulte o arquivo suplementar "Supplementary_Video_JOVE.avi" em Downloads.
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Discussion
A migração celular é um aspecto importante para estudar na pesquisa do câncer e também pode ser aplicado a estudos de cura de desenvolvimento, imunológicos e ferida. O ensaio de cultura de células de feridas e de fecho da migração celular e invasão transwell ensaios de revelar a informação detalhada do comportamento migratório das células e pode ser utilizado para investigar os mecanismos moleculares da migração celular 1,2,10,14. Nosso estudo utilizou estes testes de motilidade celular para determinar as capacidades de velocidade de migração e invasão de uma linha de células de melanoma B16F10.
O ensaio de encerramento de feridas de células examina a capacidade de uma linha celular particular a migrar e, subsequentemente, fechar uma ferida feita em uma placa confluente de células. Este ensaio é muito acessível para grupos com equipamento básico e, em comparação com os métodos existentes é uma maneira simples para medir a migração celular. Alguma variação no ensaio de encerramento de feridas podem ser encontrados nos grupos de tratamento individuais, mas existem vários passos que may ser tomadas para ajudar a diminuir isso. Um método potencial para reduzir a variação é para cada prato de amostra com o mesmo número de células para atingir confluência síncrona e manter o estado de células saudáveis no momento do início de cada experiência. Vários ensaios de experimentos de cultura de células pode ser necessária para determinar o número exato chapeamento que é necessário para atingir confluência invariável e status célula saudável entre amostras independentes. Além disso, o aumento do tamanho da amostra também irá reduzir a variação. Para as linhas de células de migração lenta que requerem mais de 24 horas de tempo de incubação para observar a migração significativa, é conveniente usar-se afidicolina, ou outro inibidor da proliferação para evitar alterações do número de células que poderia, potencialmente, afectar o resultado do ensaio.
Depois de dominar a capacidade de estudar velocidade de migração de células utilizando o ensaio de fechamento da ferida celular, uma avaliação detalhada do comportamento migratório das células individuais podem também ser concluída 14. Além disso, na sequência de uma wound células de ensaio de fecho podem ser fixos e várias proteínas envolvidas com a estrutura do citoesqueleto e dinâmica pode ser visualizado e avaliado usando imunocitoquímica 2. Esta análise pode levar a novas alterações bioquímicas detalhadas anteriormente desconhecidas. O ensaio fechamento da ferida célula também é altamente passível de tempo real imagens de células vivas para estudar a dinâmica de migração por meio de microscopia de fluorescência de lapso de tempo. Por exemplo, a actina-GFP, tubulina-GFP, e proteínas de fusão paxilina-GFP podem ser expressas em células vivas para visualizar a localização das proteínas em diferentes pontos no tempo na migração celular ou adesão 18,19. Algumas limitações do ensaio de encerramento de feridas incluem, que, por exemplo, não é adequado para as células não-aderentes e não mede a quimiotaxia celular. Além disso, algumas linhas de células têm uma tendência para separar a placa imediatamente após o ferimento é feito (por exemplo, células HEK293T). Para essas linhas de células, é melhor usar placas ferida pré-fundidas ou o transwell ensaio de migração discutido abaixo.
A migração celular transwell e ensaio de invasão fornece uma análise completa da capacidade das células para sentir um determinado quimio-atrativo e migrar através de uma barreira física em direção a ela. Este teste pode ser ainda utilizado para investigar a invasão celular através da adição de uma camada de matriz extracelular ou uma camada de células endoteliais no topo da membrana Transwell para imitar o processo de invasão de ECM e extravasamento 1,10. Além disso, após a invasão por meio de Matrigel, coloração imunológica de proteínas do citoesqueleto em combinação com a microscopia de fluorescência pode ser valioso para o estudo morfológico durante a invasão 3-D. Uma limitação de utilizar o ensaio de invasão de células Transwell é que os dados de intervalo de tempo de invasão de células é difícil de alcançar com microscopia convencional e imagens de células vivas de este processo é complexo.
Para obtenção de resultados precisos, existem vários passos cruciais durante o transwell migração celular e invasão ensaios que são de importância. Em primeiro lugar, uma vez que a velocidade de migração de células pode variar amplamente entre os diferentes tipos de células de várias experiências preliminares devem ser executadas para adoptar uma estrutura de tempo de migração específica que será utilizada no procedimento. Em segundo lugar, a quimio-atractor também deve ser aplicável para o tipo celular de interesse. Uma ampla gama de quimio-atractores deve ser analisada em experiências anteriores antes de medir a migração final e da capacidade de invasão de um tipo particular de células. Os fibroblastos meio condicionado é vulgarmente utilizado como um forte quimio-atractivo para uma ampla gama de tipos de células. Se uma única purificada quimio-atractor é usado certificar-se que os receptores do quimio-atractor são expressas no tipo celular de interesse. Finalmente, para o ensaio de invasão de células de garantir que o revestimento de Matrigel ou outra matriz extracelular é homogéneo, a fim de minimizar a variação experimental. Em conclusão, apesar de existirem algumas limitações, o altamenteOs ensaios de migração celular acessíveis aqui descritas são úteis para uma ampla gama de estudos biológicos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-073 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini | 100106 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco | 25200-056 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-250 | |
| Crystal violet | Sigma | C0775-100G | Dissolved in water at 0.2% |
| Cell disassociation buffer | Gibco | 13151-014 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Model # 3145 | |
| SterilGARD biosafety hood | The Baker Company, Inc. | Model # VBM-600 | |
| EVOS Fl inverted microscope | Thermo Fisher Scientific | Model # AMF-4302-US | |
| Tissue culture plate | Becton Dickinson | 353046 | Catalog number varies depending on the type of culture plate |
| Corning Transwell insert | Fisher | 07-200-150 | Catalog number varies depending on the pore size of the membrane |
References
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