Summary
De uso general, se describen métodos muy accesibles para el examen de la migración celular y la invasión in vitro. El primer método es el ensayo de cierre de la herida de células que mide la motilidad celular. El segundo método es la migración y la invasión de ensayo Transwell que evalúa la quimiotaxis y la capacidad invasiva de las células.
Introduction
La motilidad es una característica esencial de las células vivas. La migración celular está implicado en la concepción de la vida, el desarrollo embrionario, la respuesta inmune, y muchos procesos patológicos, tales como la metástasis del cáncer y la inflamación 1-9. Por lo tanto, los métodos para estudiar el comportamiento migratorio de células son las herramientas de investigación de gran utilidad para una amplia gama de disciplinas en las ciencias biomédicas, biología, bioingeniería y otros campos relacionados.
El estudio de la migración celular en la investigación del cáncer es de particular interés como la principal causa de muerte en los pacientes de cáncer está relacionado con la progresión metastásica. Con el fin de cáncer se propague y difundir a través del cuerpo, las células cancerosas deben migrar e invadir a través de la matriz extracelular (ECM), intravasate en circulación de la sangre, adjuntar a un sitio distante, y finalmente extravasación para formar focos distantes 1,10-12. Varios métodos biológicos se pueden emplear para estudiar estos eventos en detalle. El cultivo de células de la herida-cierre de unensayos d la migración y la invasión transwell se utilizan ampliamente en la comunidad científica de 1,10. Estas pruebas pueden proporcionar los datos necesarios que puedan permitir una comprensión de lo bien que un tipo particular de célula de forma espontánea puede migrar o responder a una quimio-atrayente y direccionalmente migrar hacia ella. Varios fenotipos migratorias se han descrito. Las células pueden migrar en forma de una sola célula, como se ve en mesenquimales o movimiento ameboide como o por el movimiento multicelular marcado la migración colectiva de células o streaming de 13. El método de movimiento utilizado en células móviles se puede observar fácilmente usando el ensayo de cierre de la herida cultivo celular.
Entre las numerosas formas de estudiar la migración celular, el ensayo de cierre de la herida celular es uno de los más sencillos. Este método es útil para determinar la capacidad de migración de masas de células enteras. Cuando se toma un paso más allá que puede ser utilizado para observar las características morfológicas de células individuales durante la migración 14. Tras el análisis de la cierre de la herida muchos fenotipos pueden ser revelados. Medición de la distancia de cierre con el tiempo cuando se compara con un control puede revelar cambios específicos de migración o un fenotipo migratorio deteriorado que no se conocía previamente. Por otra parte, la formación de un solo lamellipodium celular, retracción de la cola, y el movimiento direccional pueden dar pistas de lo que puede verse afectada o el incremento en las células de interés 14.
La migración Transwell y ensayos de invasión se pueden usar para analizar la capacidad de las células individuales para responder direccionalmente a varios quimioatrayentes si son quimiocinas, factores de crecimiento, lípidos, nucleótidos o 4,5,8,15,16. También se puede evaluar la capacidad migratoria diferencial debido a la sobre-expresión de un receptor de 1,14. Estos ensayos también se pueden utilizar para identificar y caracterizar los principales reguladores de la migración celular, tales como la familia Rho de pequeñas GTPasas 2. A raíz de estos cortos y de fácil accespruebas bles, el modo de la migración celular y la capacidad de una célula para invadir en una matriz de 3-D también se pueden determinar.
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Protocol
1. Ensayo de cierre de la herida Cultivo Celular
- Separar las células de la placa de cultivo de tejidos usando 0,25% de solución de tripsina-EDTA. Precipitar las células en un tubo cónico de 15 ml por centrifugación, aspirar el sobrenadante, y las células en medio de cultivo re-suspenden. Placa del número apropiado de células en una placa de 6 pocillos para el 100% de confluencia en 24 horas.
Nota: Se pueden necesitar exámenes para determinar el tiempo y el número de células para lograr el 100% de confluencia por el tipo celular y el tamaño de la siendo bien utilizado (por ejemplo, 1 x 10 6 células de melanoma B16F10 se sembraron en un pocillo de una placa de 6 pocillos 24 horas antes de la generación de la herida). Alternativamente, se pueden utilizar de 12 pocillos o placas de 24 pocillos.
Nota: Si está disponible, las células pueden ser sembradas en una cultura-Insert (de ibidi LLC) en una placa de cultivo de tejido tratado de hacer la herida previamente fundido. Una cultura-Insert puede proteger la superficie de la placa de cultivo de tejidos del daño causado por la punta de la pipeta. Si una cultura-Insert se utiliza el paso de omisión1.2. - En un entorno estéril (típicamente una campana de bioseguridad) utiliza una punta de pipeta 200 l para presionar con firmeza contra la parte superior de la placa de cultivo de tejidos y rápidamente crea una herida vertical de abajo a través de la monocapa de células. Una punta de pipeta de tamaño diferente puede ser utilizado para hacer el tamaño de la herida que se desea. No use fuerza excesiva contra la placa de cultivo de tejidos con la punta de la pipeta, ya que puede dañar la superficie. Si la herida es pre-fundido, este paso se puede omitir.
- Aspirar con cuidado los medios de comunicación y los restos celulares. Agregar lentamente suficiente medio de cultivo contra la pared del pozo para cubrir la parte inferior del pozo y evitar separar las células adicionales. Después de la generación y la inspección de la herida se debe tomar una imagen inicial. Coloque la placa de cultivo de tejido en una incubadora a la temperatura adecuada y la concentración de CO 2 (típicamente 37 ° C y 5% de CO 2).
- En varios momentos de la hora, por ejemplo, cada 3 horas, retire la placa de la incuo y lo coloca bajo un microscopio invertido para tomar una imagen instantánea y para verificar el cierre de heridas. Si el tiempo transcurrido microscopía está disponible, tomar una foto cada X número de minutos (por lo general a partir de cada 5 minutos) para cualquier duración de tiempo en una temperatura y CO 2 cámara controlada. Dependiendo del tipo de célula, el tiempo de cierre de la herida puede variar.
- Para analizar los resultados de las imágenes de captura, medir la distancia de un lado de la herida al otro usando una barra de escala. Analizar y cierre claramente presente la herida en el tiempo utilizando un gráfico de dispersión o gráfico de barras, por ejemplo, la Figura 1.
- Para analizar las imágenes con lapso de tiempo, importar las imágenes en el software ImageJ (disponible gratuitamente en http://rsb.info.nih.gov/ij/) para hacer un video. Para ello ImageJ abierto, haga clic en Archivo, Importar y, Secuencia de imágenes. Busque el archivo con imágenes; haga clic en la primera foto en el archivo. Guardar vídeo seleccionando Archivo, Guardar como, y AVI. Las células individuales que migran se pueden observar a characterize movimiento direccional. Además, las características morfológicas, tales como la formación de lamelipodios y posterior retracción del borde pueden ser estudiados como así (Figura 2 y de vídeo adicional).
2. Migración celular y la invasión Transwell Ensayo
- En un entorno estéril (típicamente una campana de bioseguridad) separar las células de la placa de cultivo de tejidos utilizando un tampón no enzimático de disociación de células o 0,25% de solución de tripsina-EDTA, las células de pellets por centrifugación, y aspirar el medio existente dejando las células sedimentadas. Volver a suspender las células en medio de cultivo celular libre de suero que contiene 0,1% de BSA (albúmina de suero bovino).
Nota: Dependiendo de la línea celular que se investiga 0,25% de tripsina-EDTA puede afectar a la migración celular y la invasión debido a la escisión de varios receptores en la superficie de la célula 17.
Nota: El número de células por ml depende del tamaño de las células. Será necesario realizar más pruebas para determinar una densidad de siembra que prociona los mejores resultados. Típicamente 1 x 10 6 células / ml es un buen punto de partida para la mayoría de tipos de células cuando se utiliza el 24 pocillos Transwell insertar. Hay una gama de tamaños de inserto Transwell y el número de células añadidas se debe ajustar para en consecuencia. - Placa de 100 l de solución de células en la parte superior de la membrana de filtro en un inserto de Transwell y se incuba durante 10 minutos a 37 ° C y 5% de CO 2 para permitir que las células se colocan abajo.
Nota: El tamaño de poro particular de la membrana Transwell utilizado depende del tamaño individual de las células en la muestra. Por ejemplo, si las células son demasiado pequeñas que pueden pasar a través de los poros sin la necesidad de facilitar la migración o si son demasiado grande no puede encajar a través de los poros. Hay varias inserciones Transwell con tamaños de poro que varían desde 3 m, 5 m, y 8 m para ensayos de migración celular. Los insertos Transwell están disponibles comercialmente de compañías tales como Corning.
Nota: El transwell mensayo a migración se puede modificar fácilmente para realizar el ensayo de invasión celular. Para ello, agregue la matriz extracelular (ECM) de materiales en la parte superior de la membrana transwell y luego añadir las células en la parte superior de la ECM. Por ejemplo, Matrigel se descongela y se licua en hielo, y luego 30-50 l de Matrigel se añade a un 24-así Transwell insertar y solidificó en una incubadora a 37 ° C durante 15-30 minutos para formar una capa de gel delgada. Solución de células se añade en la parte superior de la capa de Matrigel para simular invasión a través de la matriz extracelular.
Nota: Existen claras diferencias entre la migración celular transwell y los ensayos de invasión celular transwell. El ensayo de migración de células Transwell mide la capacidad quimiotáctica de las células hacia una quimio-atrayente. El ensayo de invasión de células Transwell, sin embargo, mide tanto la quimiotaxis de células y la invasión de células a través de la matriz extracelular, un proceso que se encuentra comúnmente en la metástasis del cáncer o el desarrollo embrionario. - Con una pipeta, muy carefañadir ully 600 l de la quimio-atrayente deseado en la parte inferior de la cámara baja en una placa de 24 pocillos. Añadir la quimio-atrayente sin mover el inserto transwell y evitar la generación de burbujas. Asegúrese de que el líquido-quimio atrayente en el pozo inferior hace contacto con la membrana en el pocillo superior para formar un gradiente quimiotáctico. El tiempo de incubación depende del tipo de célula y la quimio-atrayente utilizado.
Nota: Se pueden necesitar pruebas adicionales para determinar el período de incubación.
Nota: Para las células adherentes, las células migradas se adjunte al otro lado de la membrana 1,8. La cuantificación de células migradas se puede realizar siguiendo los pasos 2.4 a 2.8 (pasos 2.4 a 2.8 no necesita ser realizado en un ambiente estéril). Para las células no adherentes, las células migraron caerán en los medios de comunicación en la cámara baja. El número de células migradas se puede contar mediante el uso de hemocitómetro o citómetro de flujo 5. - Retire el inserto transwell de la placa. Utilice un aplicador con punta de algodón tantas veces como sea necesario para remover cuidadosamente los medios de comunicación y las células restantes que no han migrado desde la parte superior de la membrana sin dañarlo.
- Añadir 600-1.000 l de etanol al 70% en un pocillo de una placa de 24 pocillos. Coloque el inserto Transwell en el etanol al 70% durante 10 minutos para permitir la fijación de células. Eliminar Transwell inserto de la placa de 24 pocillos y utilizar un aplicador con punta de algodón para eliminar el etanol restante desde la parte superior de la membrana. Permita que la membrana transwell se seque (normalmente 10-15 minutos).
- Añadir 600-1.000 l de 0,2% de cristal violeta en un pocillo de una placa de 24 pocillos y la posición de la membrana en él para la tinción. Se incuba a temperatura ambiente durante 5-10 minutos.
- Retire suavemente el cristal violeta en la parte superior de la membrana con una punta de pipeta o punta de algodón aplicador. Con mucho cuidado, para evitar el lavado de células fijadas, sumergir la membrana en agua destilada tantas veces como sea necesario para eliminar el exceso viole cristalt. Permita que la membrana transwell se seque.
- Ver debajo de un microscopio invertido y contar el número de células en diferentes campos de visión para obtener una suma promedio de células que han migrado a través de la membrana hacia la quimio-atrayente y unidos en la parte inferior de la membrana (Figura 3).
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Representative Results
El ensayo de cierre de la herida y el ensayo de migración de células Transwell que aquí se presenta se realizaron con células de melanoma de ratón B16F10 como un sistema modelo. En el ensayo de cierre de la herida, B16F10 células se sembraron en una placa de cultivo tisular de 6 pocillos y se cultivaron hasta 100% de confluencia en 24 horas. Una herida de aproximadamente 700 m de ancho se ha generado utilizando una punta de pipeta y el cierre de la herida (migración celular) fue grabado usando la microscopía de lapso de tiempo. Como alternativa, el cierre de la herida también puede estudiarse tomando instantáneas de imágenes en diferentes puntos de tiempo si el tiempo transcurrido microscopía no está disponible 1. Cuatro imágenes de la serie de lapso de tiempo a 0, 4, 8, y los puntos de tiempo de 12 horas se muestran en la Figura 1. Sobre la base de la anchura de la herida, se calculó la distancia de migración y de la velocidad de la migración celular en 40,42 m / hr (Figura 1B). Las imágenes con lapso de tiempo también fueron montados en un vídeo utilizando el programa ImageJ (ver video complementario). Thproceso de migración celular dinámico e podría ser estudiado. Como se muestra en la Figura 2, la morfología de las células que migran con lamelipodios (borde delantero) y las colas (borde posterior) se observaron claramente.
En el ensayo de migración de células Transwell, se utilizan insertos de 24 pocillos de Corning. B16F10 células de melanoma se resuspendieron a la concentración de 1 x 10 6 células / ml en el tampón de migración que consiste en medio DMEM y 0,1% de BSA sin suero. Los medios condicionados de células de fibroblastos NIH3T3 cultivadas en medio DMEM que contenía suero bovino fetal al 10% se utilizó como la quimio-atrayente. 100 l de células B16F10 se añadió en la parte superior de la membrana Transwell en la cámara superior y 600 l de quimio-atrayente se añadió a la cámara inferior o el mismo volumen de tampón de migración añaden como control negativo. La migración celular se realizó como se describe en el Procedimiento. El número de células migradas se podría cuantificó contando debajo de un microscopio o en lafotografías tomadas (Figura 3B). Como se muestra en la Figura 3, se produjo un aumento de 15 veces en las células que migran hacia la quimio-atrayente en comparación con el tampón de migración control (Figura 3C). El ensayo examina transwell quimiotaxis celular, la migración celular direccional hacia la quimio-atrayente.
Figura 1. B16F10 células de melanoma ensayo de cierre de la herida. (A) durante un 16-hora de cierre de heridas de ensayo imágenes fueron tomadas cada 5 minutos usando un microscopio de lapso de tiempo. Representante imágenes a 0, 4, 8 y 12 h se muestran y se agregan barras de escala (400 micras) para la medición de la anchura de la herida. (B) La distancia de la herida se mide en micras. Un gráfico de dispersión se utiliza para mostrar la anchura de la herida en el tiempo y se calculó la tasa de cierre de la herida. Para gencalificar el valor de r 2, una regresión lineal se aplicó a los datos de anchura de la herida utilizando el software GraphPad Prism (versión 5.0, GraphPad Software, Inc.). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Morfología de la migración de las células B16F10 del time-lapse microscopía de la prueba de cierre de la herida. Durante unas 16 horas de cierre de heridas de ensayo imágenes fueron tomadas cada 5 minutos. Todas las imágenes fueron montadas en un vídeo utilizando el programa ImageJ (5 fotogramas / segundo). Se observó la migración de la célula que implica la polarización celular, extensión lamelipodios, y posterior retracción borde. Se presentaron las imágenes de 34.6 puntos, 36.6, y 38.6 segundos de tiempo del video (de tiempo de vídeo que corresponde al tiempo de lapso de tiempo real de migración (hr: min: seg) 34,6 segundos, 14:20:00; 36,6 segundos, 15:10:00; y 38,6 segundos, 16:00:00, respectivamente). La barra de escala 50 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Transwell ensayo de migración de células de melanoma B16F10. (A) Un diagrama del aparato de inserción Transwell utilizado para medir la migración celular y la invasión. (B) imágenes representativos de B16F10 migración Transwell de células. Tampón de migración celular y medio celular acondicionado de NIH3T3 se añadieron a la cámara inferior como el control negativo y quimio-atrayente, respectivamente. Después de la migración de células y la tinción con cristal violeta como se describe en el Procedimiento, imágenes de las células migradas (teñidas de color púrpura) se tomaron con un MICRoscope con un objetivo de 10x (100x de magnificación total). Los poros de las membranas también se pudo observar como los numerosos pequeños, redondos y oscuros puntos de colores en la imagen. (C) Cuantificación de células que migran hacia el tampón de migración o quimio-atrayente (promedio de 5 campos de imagen a 100 aumentos en total). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Complementario del vídeo. Vídeo time-lapse de un ensayo de cierre de la herida de células de melanoma B16F10. Se tomaron fotos cada 5 minutos durante 16 horas para generar imágenes 193. Todas las imágenes fueron montadas en un vídeo utilizando el programa ImageJ (5 fotogramas / segundo). Vea el archivo complementario "Supplementary_Video_JOVE.avi" zona de descargas.
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Discussion
La migración celular es un aspecto importante para estudiar en la investigación del cáncer y también se puede aplicar a los estudios de curación de desarrollo, inmunológicos y de la herida. El cultivo de células de ensayo de la herida cierre y ensayos de la migración celular y la invasión Transwell revelar información detallada de comportamientos migratorios celulares y se puede utilizar para investigar los mecanismos moleculares de la migración de células 1,2,10,14. Nuestro estudio utilizó estos ensayos de la motilidad celular para determinar las capacidades de velocidad de la migración y la invasión de una línea celular de melanoma B16F10.
El ensayo de cierre de la herida de células examina la capacidad de una línea celular particular a migrar y posteriormente cerrar una herida hecha en una placa confluente de células. Este ensayo es altamente accesible a los grupos con equipamiento básico y en comparación con los métodos existentes es una manera simple para medir la migración celular. Alguna variación en el ensayo de cierre de la herida se puede encontrar en los grupos de tratamiento individuales, pero hay varios pasos que may pueden tomar para ayudar a disminuir ella. Un método potencial para reducir la variación es a la placa cada muestra con el mismo número de células para lograr la confluencia sincrónica y mantener el estado saludable de las células en el inicio de cada experimento. Se pueden necesitar varios ensayos de experimentos de cultivo celular para determinar el número exacto de chapado que se necesita para alcanzar confluencia invariable y el estado saludable de las células entre las muestras independientes. Además, el aumento del tamaño de la muestra también reducir la variación. Para las líneas de células migratorias lentas que requieren más de 24 horas de tiempo de incubación para observar la migración significativa, es conveniente utilizar afidicolina u otro inhibidor de la proliferación para evitar cambios en el número de células que potencialmente podrían afectar el resultado del ensayo.
Después de dominar la capacidad de estudiar la velocidad de migración de las células usando el ensayo de cierre de la herida de células, una evaluación detallada de los comportamientos migratorios individuales celulares también pueden ser completados 14. Por otra parte, a raíz de una que estánd células de ensayo de cierre pueden ser fijos y varias proteínas implicadas con la estructura y la dinámica del citoesqueleto pueden ser vistos y evaluados utilizando inmunocitoquímica 2. Este análisis puede dar lugar a nuevas alteraciones bioquímicas detalladas anteriormente desconocidas. El ensayo de cierre de la herida célula también es altamente susceptible a tiempo real imágenes de células vivas para estudiar la dinámica de la migración mediante el uso de microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo. Por ejemplo, actina-GFP, GFP-tubulina, y proteínas de fusión paxilina-GFP se pueden expresar en células vivas para ver la localización de las proteínas en diferentes puntos de tiempo en la migración celular o adherencia 18,19. Algunas limitaciones del ensayo de cierre de la herida incluyen que, por ejemplo, no es adecuado para las células no adherentes y no mide la quimiotaxis de células. Además, algunas líneas de células tienen una tendencia a separarse de la placa inmediatamente después de la herida se realiza (por ejemplo, células HEK293T). Para aquellas líneas celulares, es mejor utilizar placas de heridas pre-colados o el transwell ensayo de migración analizan a continuación.
La migración de las células transwell y ensayo de invasión proporciona un análisis exhaustivo de la capacidad de las células para detectar una quimio-atrayente particular y migrar a través de una barrera física hacia ella. Esta prueba se puede utilizar aún más para investigar la invasión de células mediante la adición de una capa de matriz extracelular o una capa de células endoteliales en la parte superior de la membrana Transwell para imitar el proceso de invasión y la extravasación 1,10 ECM. Además, después de la invasión a través de Matrigel, la tinción inmunológica de las proteínas del citoesqueleto en combinación con microscopía de fluorescencia puede ser valioso para el estudio morfológico durante la invasión 3-D. Una limitación de utilizar el ensayo de invasión de células transwell es que los datos de lapso de tiempo de la invasión de células es difícil de lograr con microscopía convencional y vivir de imágenes de células de este proceso es complejo.
Para obtener resultados precisos, hay varios pasos críticos durante el TRAnswell migración celular y la invasión ensayos que son de importancia. En primer lugar, puesto que la velocidad de migración de células puede variar ampliamente entre los distintos tipos de células de varios experimentos preliminares se deben realizar para adoptar un marco de tiempo de migración específica que se utilizará en el procedimiento. En segundo lugar, la quimio-atrayente también debe ser aplicable para el tipo de célula de interés. Una amplia gama de quimioatrayentes debe ser examinado en anteriores experimentos antes de medir la migración final y la capacidad de invasión de un tipo de célula particular. Medio acondicionado de fibroblastos se utiliza comúnmente como una fuerte quimio-atrayente para una amplia gama de tipos de células. Si se utiliza un único quimio-atrayente purificada asegurarse de que los receptores de la quimio-atrayente se expresan en el tipo celular de interés. Por último, para el ensayo de invasión de células asegurarse de que el recubrimiento de Matrigel u otra matriz extracelular es homogéneo con el fin de reducir al mínimo la variación experimental. En conclusión, aunque hay algunas limitaciones, la altamenteensayos de migración celular accesibles descritos aquí son útiles para una amplia gama de estudios biológicos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-073 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini | 100106 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco | 25200-056 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-250 | |
| Crystal violet | Sigma | C0775-100G | Dissolved in water at 0.2% |
| Cell disassociation buffer | Gibco | 13151-014 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Model # 3145 | |
| SterilGARD biosafety hood | The Baker Company, Inc. | Model # VBM-600 | |
| EVOS Fl inverted microscope | Thermo Fisher Scientific | Model # AMF-4302-US | |
| Tissue culture plate | Becton Dickinson | 353046 | Catalog number varies depending on the type of culture plate |
| Corning Transwell insert | Fisher | 07-200-150 | Catalog number varies depending on the pore size of the membrane |
References
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