Summary
Vanligen används, är mycket tillgängliga metoder för att undersöka cellmigration och invasion in vitro beskriven. Den första metoden är den cell sårtillslutning analys som mäter cellrörlighet. Den andra metoden är den transwell migration och invasionsanalys som bedömer den kemotaktiska och invasiv förmåga hos celler.
Introduction
Motilitet är ett väsentligt inslag i levande celler. Cell migration är involverad i utformningen av livet, embryonal utveckling, immunsvar, och många patologiska processer såsom cancer metastasering och inflammation 1-9. Därför, metoder för att studera cell flyttande beteende är mycket användbara forskningsverktyg för ett brett spektrum av discipliner inom biomedicinsk vetenskap, biologi, bioteknik och närliggande områden.
Studien av cellmigration i cancerforskningen är av särskilt intresse eftersom den främsta dödsorsaken hos cancerpatienter är relaterad till metastasutvecklingen. För för cancer att sprida sig och sprida i hela kroppen, måste cancerceller migrera och invadera genom extracellulär matrix (ECM), intravasate i blodcirkulationen, bifoga till en avlägsen plats, och slutligen extravasera att bilda avlägsen härdar 1,10-12. Olika biologiska metoder kan användas för att studera dessa händelser i detalj. Cellodlings sår stängning end den transwell migration och invasion analyser används allmänt i den vetenskapliga gemenskapen 1,10. Dessa tester kan ge nödvändig information som kan möjliggöra en förståelse för hur väl en viss celltyp spontant kan migrera eller svara på en kemo-attraherande och riktnings migrera mot den. Flera flyttande fenotyper har beskrivits. Celler kan migrera i en enda cell form, såsom ses i mesenkymala eller amöboid liknande rörelser eller genom multicellulär rörelse märkt kollektiv migration eller cellsändning 13. Metoden för rörelse används i rörliga celler lätt kan observeras med användning av cellodlings sårtillslutning assay.
Bland de många sätt att studera cellmigration, är cellen sårtillslutning analys en av de enklaste. Denna metod är användbar för att bestämma migrations förmågan hos hela cellmassor. När det tas ett steg längre det kan användas för att observera enskilda cellens morfologiska egenskaper under migration 14. Efter analysen av tillslutning av sår många fenotyper kan avslöjas. Att mäta den slutna sträcka över tid om man jämför med en kontroll kan avslöja specifika förändringar migration eller en försämrad flyttande fenotyp som var okända tidigare. Dessutom kan enstaka cell lamellipodium bildning, svans indragning, och riktad rörelse ger ledtrådar för vad som kan försämras eller förbättras i cellerna av intresse 14.
Den transwell migration och invasion analyser kan användas för att analysera förmågan hos enskilda celler till directionally svara på olika kemo-attraherande medel oavsett om de är kemokiner, tillväxtfaktorer, lipider, eller nukleotider 4,5,8,15,16. Det kan också bedöma differential flyttande förmåga på grund av överuttryck av en receptor 1,14. Dessa analyser kan också användas för att identifiera och karakterisera de viktiga regulatorer av cellmigration, såsom Rho-familjen av små GTPaser 2. Efter dessa kort och lätt få tillgångligt tester, sättet cell migration och förmågan hos en cell att invadera in i en 3D-matris kan också bestämmas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellodling sårtillslutning Assay
- Drag av celler från vävnadsodlingsplatta med användning av 0,25% trypsin-EDTA-lösning. Pelletera cellerna i ett 15 ml koniskt rör genom centrifugering, aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i odlingsmedia. Plåt lämpligt antal celler i en 6-brunnsplatta för 100% sammanflytning i 24 timmar.
Obs: Tester kan behövas för att bestämma tid och antalet celler för att uppnå 100% sammanflödet på grund av celltypen och storleken på den väl används (till exempel, 1 x 10 6 B16F10 melanomceller seedade i en brunn i en 6-brunnar 24 timmar före den lindade generationen). Alternativt kan 12-brunnars eller 24-brunnars plattor användas.
OBS: Om tillgängligt, kan cellerna seedas in i en kultur-Insert (från ibidi LLC) på en behandlad vävnadsodlingsplatta gör såret förväg gjuten. En kultur-Infoga kan skydda ytan av vävnadsodlingsplatta från skada av pipettspetsen. Om en kultur-Insert används hoppa över steg1,2. - I en steril miljö (typiskt en biosäkerhet huva) använder en 200 mikroliter pipettspets för att pressa ordentligt mot den övre delen av vävnadsodlingsplatta och snabbt göra en vertikal sår ned genom cellmonoskiktet. En annan storlek pipettspetsen kan användas för att göra sårets storlek som önskas. Använd inte överdrivet våld mot vävnadsodlingsplatta med pipettspetsen eftersom det kan skada ytan. Om såret är pre-gjuten, kan detta steg utelämnas.
- Försiktigt aspirera media och cellrester. Tillsätt långsamt tillräckligt odlingsmedia mot brunnsväggen för att täcka botten av brunnen och undvika att lösgöra ytterligare celler. Efter generering och kontroll av såret en första bild ska tas. Placera vävnadsodlingsplatta i en inkubator inställd på lämplig temperatur och CO 2 koncentration (typiskt 37 ° C och 5% CO2).
- Vid flera tidpunkter, t.ex. var 3 timmar, ta bort plattan från incubateller och placera den under ett inverterat mikroskop för att ta en ögonblicksbild och att kontrollera för tillslutning av sår. Om time-lapse mikroskopi är tillgänglig, ta ett foto varje X antal minuter (vanligtvis börjar med var 5 minuter) för någon tid varaktighet i en temperatur-och CO2 kontrollerad kammare. Beroende på celltypen kan sårläkningstiderna variera.
- För att analysera resultaten av ögonblicksbilder, mäta avstånd på ena sidan av såret till den andra med hjälp av en skala bar. Analysera och tydligt närvarande sårförslutning över tid med hjälp av ett punktdiagram eller stapeldiagram, t.ex. Figur 1.
- För att analysera de tidsseriebilder, importerar bilderna i ImageJ programvara (fritt tillgänglig på http://rsb.info.nih.gov/ij/) för att göra en video. För att göra detta öppet ImageJ, klicka på Arkiv, Importera, och bildsekvens. Hitta filen med bilderna; Klicka på den första bilden i filen. Spara video genom att välja Arkiv, Spara som, och AVI. Enstaka vandrande celler kan observeras till characterize riktad rörelse. Vidare kan morfologiska egenskaper såsom lamellipodia bildning och bakkant indragning studeras också (figur 2 och kompletterande video).
2. Transwell Cell Migration och Invasion analys
- I en steril miljö (typiskt en biosäkerhet huva) lösgöra cellerna från vävnadsodlingsplatta med användning av en icke-enzymatisk cell dissociation buffert eller 0,25% trypsin-EDTA-lösning, Pelletera celler genom centrifugering, och aspirera befintliga media lämnar pelleterade cellerna. Återsuspendera cellerna i serumfritt cellodlingsmedium innehållande 0,1% BSA (bovint serumalbumin).
Anm: Beroende på cellinjen som undersöks 0,25% trypsin-EDTA kan påverka cellmigration och invasion på grund av klyvning av olika receptorer på cellytan 17.
Anmärkning: Det antal celler per ml beror på storleken av cellerna. Ytterligare tester kan behövas för att hitta en seedning densitet som prohandahåller de bästa resultaten. Normalt 1 x 10 6 celler / ml är en bra utgångspunkt för de flesta celltyper vid användning av 24-väl Transwell infoga. Det finns ett utbud av Transwell skärstorlekar och antalet celler tillsatta bör anpassas för detta. - Plate 100 pl av cellösningen på toppen av filtermembranet i en transwell insert och inkubera under 10 minuter vid 37 ° C och 5% CO2 för att tillåta cellerna att sedimentera.
Anmärkning: Den särskilda porstorleken hos transwell membran som används är beroende av den enskilda storleken på cellerna i provet. Till exempel, om de celler som är för små att de kan passera genom porerna utan att det behövs för att underlätta migrering eller om de är för stora kan de inte passa genom porerna. Det finns flera Transwell skär med porstorlek som sträcker sig från 3 pm, 5 pm, och 8 um för cellmigrationsanalyser. Transwell skär är kommersiellt tillgängliga från företag som Corning.
Obs: transwell migration Analysen kan lätt modifieras för att utföra cellinvasionsanalys. För att göra detta, till extracellulär matrix (ECM) material på toppen av den transwell membranet och sedan lägga celler på toppen av ECM. Till exempel är Matrigel tinades och kondenserad på is, och sedan 30 till 50 | il av Matrigel sättes till en 24-brunnars Transwell sätta in och stelnat i en 37 ° C inkubator i 15-30 minuter för att bilda ett tunt gelskikt. Cell lösning sätts ovanpå den Matrigel-beläggningen för att simulera invasion genom den extracellulära matrisen.
OBS: Det finns tydliga skillnader mellan migrationstranswell cellen och de transwell cellinvasionsanalyser. Migrationsanalys Den transwell cell mäter kemotaxi förmåga celler mot en kemo-attraherande. Den transwell cellinvasionsanalys emellertid åtgärder både cell kemotaxi och invasion av celler genom extracellulära matrisen, en process som ofta finns i cancermetastaser eller embryots utveckling. - Med pipett mycket carefully lägga 600 pl av det önskade kemo-attraherande i botten av den lägre kammaren i en 24-brunnsplatta. Lägg den kemo-attraherande utan att flytta transwell insatsen och undvika att skapa bubblor. Se till kemo-attraherande vätska i botten väl gör kontakt med membranet i den övre väl för bildning av en kemotaktisk gradient. Inkubationstiden beror på celltypen och den kemo-attraherande används.
Obs: Ytterligare tester kan behövas för att bestämma inkubationstid.
Notera: För vidhäftande celler, kommer de migrerade cellerna fästa till den andra sidan av membranet 1,8. Kvantifieringen av migrerade celler kan utföras genom att följa stegen 2,4-2,8 (steg från 2,4 till 2,8 behöver inte utföras i en steril miljö). För icke-vidhäftande celler, kommer de migrerade cellerna släppa in media i den nedre kammaren. Antalet migrerade celler kan räknas genom att använda hemocytometer eller flödescytometer 5. - Avlägsna transwell insert från plattan. Använd en bomullspinne så många gånger som behövs för att noggrant ta bort materialet och återstående celler som inte har migrerat från den övre delen av membranet utan att skada den.
- Lägg 600-1,000 il av 70%-ig etanol i en brunn av en 24-brunnsplatta. Placera transwell insert in i 70% etanol under 10 minuter för att tillåta cellfixering. Avlägsna transwell insert från 24-brunnsplatta och använder en bomullspinne för att avlägsna återstående etanol från den övre delen av membranet. Låt transwell membranet torka (typiskt 10 till 15 minuter).
- Lägg 600-1,000 il av 0,2% kristallviolett i en brunn av en 24-brunnsplatta och placera membranet in i den för färgning. Inkubera vid rumstemperatur under 5-10 minuter.
- Ta försiktigt bort kristallviolett från toppen av membranet med en pipettspets eller bomullspinne. Mycket försiktigt, för att undvika att tvätta bort fasta celler, doppa membranet i destillerat vatten så många gånger som behövs för att ta bort överskott kristall violet. Låt transwell membranet torka.
- Se under ett inverterat mikroskop och räkna antalet celler i olika synfält för att få en medelsumma av celler som har migrerat genom membranet mot den kemo-attraherande och fästa på undersidan av membranet (Figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Såret stängning analysen och analys av transwell cell migration presenteras här utfördes med hjälp av musen B16F10 melanomceller som modellsystem. Under tillslutning av sår-analysen gjordes B16F10-celler såddes i en 6-brunnars vävnadsodlingsplatta och odlades till 100% sammanflytning i 24 timmar. Ett sår på ca 700 nm bred genererades med hjälp av en pipett spets och såret stängning (cellmigration) spelades in med time-lapse mikroskopi. Alternativt kan sårtillslutning också studeras genom att ta ögonblicksbilder vid olika tidpunkter om tidsförlopp mikroskopi inte är tillgänglig 1. Fyra bilder från tidsförlopp serie vid 0, 4, 8, och 12-timmars tidpunkter visas i figur 1. Baserat på bredden av såret, vi beräknade migrations avståndet och hastigheten på cellmigration vid 40.42 pm / timme (Figur 1B). De tidsintervaller bilderna också ihop till en video med ImageJ programmet (se kompletterande video). The dynamisk cellmigrationsprocessen kunde studeras. Som visas i figur 2, var morfologi migrera celler med lamellipodia (framkant) och svansar (avslutande kant) tydligt observeras.
I cellmigrationsassay den transwell ades 24-brunnars skär från Corning användas. B16F10 melanomceller var åter avbrytas på koncentration av 1 x 10 6 celler / ml i migrationsbuffert bestående av DMEM medium och 0,1% BSA utan serum. Konditionerat medium från NIH3T3-fibroblastceller odlade i DMEM-medium innehållande 10% fetalt bovint serum användes som kemo-attraktant. 100 | il av B16F10-celler tillsattes på toppen av den transwell membranet i den övre kammaren och 600 | il av kemo-attraherande medel sattes till den undre kammaren eller samma volym av migrationsbuffert tillsatt som en negativ kontroll. Cellmigration utfördes såsom beskrivits i förfarandet. Antalet migrerade celler kunde kvantifieras genom räkning under ett mikroskop eller ibilder tagna (Figur 3B). Såsom visas i fig 3, det var en 15-faldig ökning av de celler som migrerar mot den kemo-attraherande medel i jämförelse med migreringen buffertkontrollen (figur 3C). Den transwell-analysen undersöker cell kemotaxi, riktnings cell migration mot kemo-attraherande.
Figur 1. B16F10 melanomcell sårstängning analys. (A) under en 16-timmars sårtillslutning analys bilderna togs var 5 minuter med hjälp av en time-lapse mikroskop. Representativa bilder på 0, 4, 8 och 12 timmar visas och skal barer (400 mikrometer) läggs till sår breddmått. (B) Avståndet i såret mättes i um. Ett punktdiagram har använts för att visa bredden av såret över tiden och hastigheten för sårtillslutning beräknades. Att genengradera värdet på r 2, var en linjär regression körs på såret breddsdata med hjälp av GraphPad Prism mjukvara (version 5.0, GraphPad Software, Inc.). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Morfologi att migrera B16F10 celler från tidsförlopp mikroskopi av såret stängning analysen. Under en 16-timmars sårtillslutning analys bilderna togs var 5 minuter. Alla bilder samlades in i en video med ImageJ programmet (5 bilder / sekund). Cellmigration involverar cell polarisation, lamellipodia förlängningen, och bakkanten retraktion observerades. Bilder från 34.6, 36.6, och 38.6-andra tidpunkter i videon presenterades (video tid som motsvarar den faktiska tidsförlopp migrationstiden (tim: min: sek) 34,6 sekunder, 14:20:00; 36,6 sekunder, 15:10:00; och 38,6 sekunder, 16:00:00, respektive). Skala bar 50 pm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Migration analys av B16F10 melanomceller Transwell. (A) Ett diagram av transwell insatsen apparat som används för att mäta cellmigration och invasion. (B) Representativa bilder av B16F10 celltranswell migration. Cellmigration buffert och NIH3T3 rade cellmedium sattes till den undre kammaren som den negativa kontrollen och kemo-attraherande medel, respektive. Efter cell migration och färgning med kristallviolett som beskrivs i arbetsordningen, har bilder av de migrerade cellerna (lila färgade) tagna med en MICRoscope med en 10x mål (total förstoring 100x). Porerna i membranen kan också observeras som de många små, runda och mörka prickar i bilden. (C) Kvantifiering av celler migrerar mot buffert migration eller kemo-attraherande (Genomsnitt av 5 bildfält vid 100x total förstoring). Please klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande Video Time-lapse video av en B16F10 melanom cell sårtillslutning analys.. Bilder togs var 5 minuter till 16 timmar för att generera 193 bilder. Alla bilder samlades in i en video med ImageJ programmet (5 bilder / sekund). Se "Supplementary_Video_JOVE.avi" kompletterande fil under Downloads.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cell migration är en viktig aspekt att undersöka inom cancerforskningen och det kan också tillämpas på utvecklings, immunologiska och sårläkningsstudier. I cellodling sårtillslutning analys och migrationstranswell cellen och invasionsanalyser avslöjar detaljerad information om cellmigrations beteenden och kan användas för att undersöka de molekylära mekanismerna av cell migration 1,2,10,14. Vår studie använde dessa cellmotilitet analyser för att fastställa migration hastighet och invasion funktionerna i en B16F10 melanomcellinje.
Cellen sårtillslutning analys undersöker förmågan hos en speciell cellinje att migrera och därefter stänga ett sår gjordes i ett konfluent platta med celler. Denna analys är mycket tillgänglig för grupper med basutrustning och i jämförelse med befintliga metoder är ett enkelt sätt att mäta cellmigration. Viss variation i sårtillslutning assay kan påträffas i individuella behandlingsgrupperna, men det finns flera steg som may vidtas för att bidra till att minska den. En potentiell metod för att minska variationen är till tallrik varje prov med samma antal celler för att uppnå synkron sammanflödet och bibehålla frisk cell status vid initieringen av varje experiment. Flera studier av cellkulturexperiment kan behövas för att fastställa det exakta plätering nummer som behövs för att uppnå oföränderlig sammanflödet och frisk cell status bland oberoende urval. Dessutom ökar provstorleken kommer också att minska variationen. För långsamt vandrande cellinjer som kräver mer än 24 timmars inkubationstid att observera betydande migration, är det bekvämt att använda afidikolin eller annan spridning inhibitor för att förhindra cellnummer förändringar som skulle kunna påverka resultatet av analysen.
Efter att behärska förmågan att studera cellmigration hastighet med hjälp av celltillslutning av sår-analys, en detaljerad utvärdering av encelliga flyttande beteenden kan också fyllas 14. Dessutom, efter en wound stängning analys celler kan fastställas och olika proteiner som är involverade med cytoskelettala struktur och dynamik kan ses och utvärderas med hjälp av immuncytokemi 2. Denna analys kan leda till ytterligare detaljerade biokemiska förändringar tidigare okända. Cell sårtillslutning analysen är också mycket mottaglig för realtid levande cell imaging att studera migrationsdynamiken med tidsförlopp fluorescensmikroskopi. Exempelvis kan aktin-GFP, tubulin-GFP, och paxillin-GFP-fusionsproteiner uttrycks i levande celler för att visa lokaliseringen av proteinerna vid olika tidpunkter i cellmigration eller adhesion 18,19. Vissa begränsningar av sårtillslutning analysen innefattar att, till exempel, är den inte lämplig för icke-adherenta celler och mäter inte cellkemotaxi. Dessutom är vissa cellinjer har en tendens att lossna från plattan omedelbart efter såret görs (t.ex. HEK293T celler). För de cellinjer, är det bättre att använda pre-gjutna lindade plattor eller transwell migration assay diskuteras nedan.
Migrationen transwell cell och invasion analys ger grundlig analys av cellernas förmåga att känna av en viss kemo-attraherande och vandrar genom en fysisk barriär mot det. Detta test kan vidare användas för att undersöka cellinvasion genom att lägga till ett skikt av extracellulär matris eller ett skikt av endotelceller på toppen av den transwell membranet för att efterlikna den process av ECM invasion och extravasering 1,10. Dessutom, efter invasionen genom Matrigel, kan immunologisk färgning av cytoskelettproteiner i kombination med fluorescensmikroskopi vara värdefullt för morfologisk studie under 3-D-invasionen. En begränsning med hjälp av transwell cellinvasionsanalys är att time-lapse data för cellinvasion är svårt att uppnå med konventionell mikroskopi och levande cell imaging av denna process är komplex.
För att få tillförlitliga resultat, det finns flera viktiga steg under transwell cell migration och invasion analyser som är av betydelse. Först, eftersom cellmigrationshastigheten kan variera mycket mellan olika celltyper flera preliminära försök måste utföras för att anta en särskild migrations tidsram som kommer att användas i förfarandet. För det andra måste den kemo-attraherande även tillämpas på celltypen av intresse. Ett brett utbud av kemo-lock bör undersökas i föregående experiment innan du mäter den slutliga migration och invasion förmåga av en viss celltyp. Fibroblaster-konditionerat medium används vanligen som ett starkt kemo-attraherande för ett brett spektrum av celltyper. Om ett enda renat kemo-attraherande används se till att receptorerna för kemo-attraherande uttrycks i celltypen av intresse. Slutligen för cellinvasionsanalys se till beläggningen av Matrigel eller någon annan extracellulär matris är homogen för att minimera experimentell variation. Sammanfattningsvis, även om det finns vissa begränsningar, den starktanpassad cellmigrationsanalyser som beskrivs här är användbara för ett brett spektrum av biologiska studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-073 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini | 100106 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco | 25200-056 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-250 | |
| Crystal violet | Sigma | C0775-100G | Dissolved in water at 0.2% |
| Cell disassociation buffer | Gibco | 13151-014 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Model # 3145 | |
| SterilGARD biosafety hood | The Baker Company, Inc. | Model # VBM-600 | |
| EVOS Fl inverted microscope | Thermo Fisher Scientific | Model # AMF-4302-US | |
| Tissue culture plate | Becton Dickinson | 353046 | Catalog number varies depending on the type of culture plate |
| Corning Transwell insert | Fisher | 07-200-150 | Catalog number varies depending on the pore size of the membrane |
References
- Castellone, R. D., Leffler, N. R., Dong, L., Yang, L. V. Inhibition of tumor cell migration and metastasis by the proton-sensing GPR4 receptor. Cancer Lett. 312 (2), 197-208 (2011).
- Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Rev. 28, (2009).
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Peter, C., et al. Migration to apoptotic "find-me" signals is mediated via the phagocyte receptor G2A. J. Biol. Chem. 283 (9), 5296-5305 (2008).
- Radu, C. G., Yang, L. V., Riedinger, M., Au, M., Witte, O. N. T cell chemotaxis to lysophosphatidylcholine through the G2A receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (1), 245-250 (2004).
- Buul, J. D., Hordijk, P. L. Signaling in leukocyte transendothelial migration. Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. (5), 824-833 (2004).
- Yang, L. V., Heng, H. H., Wan, J., Southwood, C. M., Gow, A., Li, L. Alternative promoters and polyadenylation regulate tissue-specific expression of Hemogen isoforms during hematopoiesis and spermatogenesis. 228 (4), 606-616 (2003).
- Yang, L. V., Radu, C. G., Wang, L., Riedinger, M., Witte, O. N. Gi-independent macrophage chemotaxis to lysophosphatidylcholine via the immunoregulatory GPCR G2A. Blood. 105 (3), 1127-1134 (2005).
- Yoshida, M., Yoshida, K. Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+. Mol. Hum. Reprod. 17 (8), 457-465 (2011).
- Albini, A. Tumor and endothelial cell invasion of basement membranes. The matrigel chemoinvasion assay as a tool for dissecting molecular mechanisms. Pathol. Oncol. Res. 4 (3), 230-241 (1998).
- Fidler, I. J. Critical determinants of metastasis. Semin. Cancer Biol. 12 (2), 89-96 (2002).
- Steeg, P. S. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nat. Med. 12 (8), 895-904 (2006).
- Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. Chemotaxis in cancer. Nat. Rev. Cancer. 11 (8), 573-587 (2011).
- Zhang, Y., et al. Comparative study of 3D morphology and functions on genetically engineered mouse melanoma cells. Integr. Biol. (Camb. 4 (11), 1428-1436 (2012).
- Junger, W. G. Purinergic regulation of neutrophil chemotaxis. Cell. Mol. Life Sci. 65 (16), 2528-2540 (2008).
- Lazennec, G., Richmond, A. Chemokines and chemokine receptors: new insights into cancer-related inflammation. Trends Mol. Med. 16 (3), 133-144 (2010).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17, (2010).
- Cortesio, C. L., Boateng, L. R., Piazza, T. M., Bennin, D. A., Huttenlocher, A. Calpain-mediated proteolysis of paxillin negatively regulates focal adhesion dynamics and cell migration. J. Biol. Chem. 286 (12), 9998-10006 (2011).
- Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. Actin microtubules and focal adhesion dynamics during cell migration. Int. J. Biochem. Cell Biol. 35 (1), 39-50 (2003).
