Summary
Yaygın olarak kullanılan, in vitro olarak hücre göçü ve işgali incelenmesi için oldukça erişilebilir yöntemler tarif edilmiştir. Birinci yöntem, hücre motilitesini büyüklüğüne hücre yara kapatma deneyidir. İkinci yöntem kemotaktik ve hücrelerin invaziv kapasitesini değerlendirir transwell göç ve istila testtir.
Introduction
Motilite canlı hücre bir temel özelliğidir. Hücre göçü ömrü, embriyonik gelişmesi, bağışıklık tepkisi ve kanser metastaz ve enflamasyon 1-9 gibi birçok patolojik süreçlerin kavramında yer almaktadır. Bu nedenle, hücre göç davranışlarını incelemek için yöntemler biyomedikal bilimler, biyoloji, biyomühendislik ve ilgili alanlarda disiplinler geniş bir yelpazede için çok yararlı bir araştırma araçlardır.
Kanser hastalarında başlıca ölüm nedenidir metastatik ilerlemesi ile ilgili olarak kanser araştırmalarında hücre göçünün çalışma özel önem taşımaktadır. Vücuda yayılmış ve yaymak için kanser için, kanser hücreleri göç olmalı ve intravasate kan dolaşımı içine, hücre dışı matriks (ECM) ile işgal, uzak bir siteye eklemek, ve nihayet uzak odaklar 1,10-12 oluşturmak için damar dışına. Çeşitli biyolojik yöntemler ayrıntılı olarak bu olayları incelemek için kullanılabilir. Hücre kültürü yara kapanması bird transwell göç ve istila deneyleri geniş bilimsel topluluğun 1,10 kullanılır. Bu testler belirli bir hücre tipi kendiliğinden göç ya da kemo-cezbedici cevap ve yönlendirilerek ona doğru nasıl göç iyi bir anlayış için izin verebilir gerekli verileri sağlayabilir. Çeşitli göç fenotipleri tarif edilmiştir. Hücreler, mezenşimal veya amoeboid benzeri hareket bölgesi veya 13 geçiş akış toplu ya da çok-etiketli hücre hareketi ile görüldüğü gibi, tek bir hücre şeklinde aktarılabilir. Hareketli hücrelerinde kullanılan hareket ait yöntem hali hazırda hücre kültürü yara kapatma tahlili kullanılarak gözlemlenebilir.
Hücre göçü çalışma için çok çeşitli yollar arasında, hücre yara kapatma deneyi basit biridir. Bu yöntem, tüm hücre kütlelerinin göç yeteneğini belirlemek için yararlıdır. Bir adım daha ileri alındığı zaman göç 14 sırasında bireysel hücrenin morfolojik özellikleri gözlemlemek için kullanılabilir. Yara kapanmasının analizi takiben birçok fenotipleri ortaya olabilir. Bir kontrol karşılaştırırken zamanla kapalı mesafeyi ölçen spesifik migrasyon değişiklik ya da önceden bilinmeyen bir engelli göçmen fenotip ortaya çıkarabilir. Ayrıca, tek bir hücre lamellipodium oluşumu, kuyruk geri çekme ve yönlü hareket ilgi 14 hücrelerinde bozulmuş veya gelişmiş olabilir ne için ipuçları verebilir.
Transwell göç ve istila deneyleri yönde bu kemokinler, büyüme faktörleri, yağlar, ya da nükleotid 4,5,8,15,16 olup çeşitli kemo-cezbedici yanıt tek hücrelerinin yeteneği analiz etmek için kullanılabilmektedir. Ayrıca nedeniyle reseptörünün 1,14 aşırı ifade diferansiyel göçmen yeterliliğini değerlendirmek olabilir. Bu deneyler, aynı zamanda, küçük bir GTPases 2'nin Rho aile olarak hücre göçü anahtar regülatörleri belirlemek ve karakterize etmek için kullanılabilir. Acces kolayca bu kısa ve ardındanmak testleri, hücre göçünün modu ve bir 3-D matrisine işgal etmek için bir hücrenin yeteneği de belirlenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Hücre Kültürü Deneyi yara kapatma
- Tripsin-EDTA solüsyonu% 0.25 ile doku kültürü hücreleri plakadan ayırın. Santrifüj ile bir 15 ml konik tüp içinde Pelet hücreleri, süpernatant aspire ve kültür ortamı hücreleri yeniden askıya. 24 saat içinde% 100 birleştiği için bir 6-çukurlu plaka içindeki hücrelerin uygun plaka.
Not: Testler (örneğin, 1 x 10 6 B16F10 melanom hücrelerinin bir kuyuda tohumlanır nedeniyle hücre tipi ile de kullanılan ölçülerine% 100 izdiham elde etmek için zaman ve hücrelerin sayısını belirlemek için gerekli olabilir 6-çukurlu plaka önce yara kuşağa 24 saat). Seçenek olarak ise, 12-iyi veya 24 oyuklu plakalar kullanılabilir.
Not: Varsa, hücreler yara ön-döküm yapan bir tedavi doku kültürü plaka üzerinde bir Kültür-Insert (Ibidi LLC) içine numaralı seribaşı olabilir. A Kültür-takın pipet tarafından zararlardan doku kültürü plaka yüzeyini koruyabilirsiniz. Bir Kültür-Ekle omit adım kullanılırsa1.2. - Steril bir ortamda (genellikle bir biyogüvenlik kaput) doku kültürü plakasının üst karşı sıkıca basın 200 ul pipet kullanın ve hızla hücre tek tabaka aşağı dikey bir yara olun. Farklı büyüklükte pipet istendiği yara boyut yapmak için kullanılabilmektedir. Bu yüzeye zarar verebilir gibi pipet ile doku kültürü plakası karşı aşırı güç kullanmayın. Yara ön döküm ise bu adım, ihmal edilebilir.
- Dikkatli medya ve hücre artıkları aspire. Yavaş yavaş kuyunun alt kapağı ve ilave ayırma hücreleri önlemek için de duvara kadar bir kültür ortamı eklenir. Yaranın üretimi ve kontrol eden bir ilk görüntü alınmalıdır. Uygun sıcaklık ve CO2 konsantrasyonunda ayarlanmış bir kuluçka makinesi içinde doku kültürü plakayı (tipik olarak 37 ° C ve% 5 CO2).
- Bir kaç zaman noktasında, her 3 saatte bir, örneğin incubat ikinci plakayı kaldırınya da bir anlık resim çekmek için ve yara kapanması kontrol etmek için ters bir mikroskop altında yerleştirin. Zaman atlamalı mikroskopi varsa, her zaman bir sıcaklık süresi ve CO 2 kontrol odası için Fotoğrafa (genellikle her 5 dakika ile başlayarak) dakika her X numarası almak. Hücre tipine bağlı olarak, yara kapanma süresi değişebilir.
- Anlık resimlerin sonuçlarını analiz etmek, bir ölçek çubuğunu kullanarak diğer yaranın bir tarafındaki mesafeyi ölçün. Bir dağılım grafiği veya çubuk grafiği, örneğin Şekil 1 kullanarak analiz eder ve zamanla açık bir şekilde mevcut yara kapama.
- Time-lapse fotoğrafları analiz etmek, bir video yapmak (http://rsb.info.nih.gov/ij/ serbestçe kullanılabilir) ImageJ yazılımı içine resim almak. Bu açık ImageJ yapmak için, İçe Aktar'ı tıklatın ve Görüntü Sırası. Resimlerle dosyasını bulun; dosyasındaki ilk fotoğrafı tıklayın. , Dosya seçerek video kaydetmek gibi kaydedin, ve AVI. Tek göç hücreleri chara kadar görülebiliryönlü hareket cterize. Ayrıca, bu tür lamellipodia oluşumu ve arka kenar olarak geri çekilmesi morfolojik özellikleri (Şekil 2 ve ek video) de incelenebilir.
2.. Transwell Hücre Göç ve Invasion Testi
- Steril bir ortamda (tipik olarak bir biyo-güvenlik kapağı), bir enzimatik olmayan hücre ayrışma tamponunu ya da% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi, topak santrifüj ile hücreler kullanılarak doku kültürü hücreleri plakadan ayırmak ve mevcut medya pelet hücreleri bırakarak aspire. % 0.1 BSA (sığır serum albümini) içeren serumsuz hücre kültür ortamı içinde yeniden askıya hücreleri.
Not: Tripsin-EDTA nedeniyle hücre yüzeyi 17 üzerinde çeşitli reseptörlerinin bölünme hücre göçü ve invazyonu etkileyebilir% 0.25 araştırılmaktadır hücre hattı ile ilgili olarak.
Not: ml başına hücre sayısı hücrelerin büyüklüğüne bağlıdır. Ileri testler pro tohumlama yoğunluğu bulmak için gerekli olabiliriyi sonuçları vardır: Command. 24 oyuklu eklemek Transwell kullanırken tipik olarak 1 x 10 6 hücre / ml 'çoğu hücre tipi için iyi bir başlangıç noktasıdır. Bir Transwell insert boyutları aralığı ve katma hücre sayısı için buna uygun olarak ayarlanmalıdır bulunmaktadır. - Levha 100, transwell prospektüste filtre zarı üzerine hücre çözeltisinin ul ve 37 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe ve% 5 CO2, hücreler yerleşmek için izin vermek.
Not: Kullanılan transwell Zarın gözenek boyutu, belirli bir numunedeki hücrelerin kendi boyutuna bağlıdır. Hücreler, çok küçük, örneğin, bunlar göç kolaylaştırmak için gerek kalmadan gözeneklerden geçebilir ya da çok büyük olduğunda bunlar gözeneklerden uymayabilir. Birkaç transwell 3 ila mikron arasında gözenek boyutları ile uçlar, 5 um, ve hücre göçü deneyleri için 8 mikron vardır. Transwell uçlar örneğin Corning gibi firmalardan ticari olarak temin edilebilir.
Not: transwell migration deneyi kolaylıkla hücre istilası tahlili gerçekleştirmek için modifiye edilebilir. Bunu yapmak transwell membran üstüne dışı matris (ECM) malzemeleri ekleyin ve sonra ECM üstüne hücre eklemek için. Örneğin, Matrigel çözülmüş ve buz üzerinde sıvılaştırılmış ve Matrigel 30-50 ul eklemek transwell 24 oyuğa ilave edilir ve bir ince jel tabakası oluşturmak için 15-30 dakika için bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde katılaştırılır. Hücre çözeltisi hücre-dışı matris boyunca işgal taklit etmek için Matrigel kaplamanın üzerine ilave edilir.
Not: transwell hücre göçü ve transwell hücre işgali tahliller arasında belirgin farklılıklar vardır. Hücre göçü, transwell tahlil, bir kemo-cezbedici doğru hücrelerin kemotaktik yeteneğini ölçer. Transwell hücre istilası deneyi Ancak, hücre dışı matris boyunca genel olarak kanser metastazı veya embriyonik gelişim bulunan bir işlem hücre kemotaksisi ve hücre işgalini iki ölçer. - Bir pipet kullanarak, çok carefully, 24 oyuklu bir plaka içerisinde, alt haznesinin alt kısmına istenen kemo-cezbedici 600 ul ekleyin. Transwell yuvasını taşımadan kemo-cezbedici ekleyin ve kabarcıkları oluşmasını önlemek. Alt kuyudaki kemo-çekici sıvı kemotaktik bir gradyan meydana getirmek üzere, üst oyuğundaki membran ile temas emin olun. İnkübasyon süresi, hücre tipine ve kullanılan kemo-cezbedici bağlıdır.
Not: Diğer testler kuluçka dönemi belirlemek için gerekli olabilir.
Not: yapışık hücreler için, göç eden hücreler zar 1,8 diğer tarafına eklenecektir. Göç eden hücrelerin miktar adımları 2.4 (2,4-2,8 steril bir ortamda yapılması gerekmez adım) 2.8 için aşağıdakilerden yapılabilir. Yapışkan olmayan hücreler için, göç eden hücreler alt bölmede ise ortamı içine düşecektir. Göç eden hücre sayısı hemasitometre kullanılarak sayıldı ve 5 akış sitometresi edilebilir. - Plakadan transwell yuvasını çıkarın. Gerektiği gibi dikkatli bir şekilde zarar vermeden, zarın üstünden geçirilir olan medya ve kalan hücrelerin çıkarılması için birçok kez bir pamuk uçlu bir aplikatör kullanın.
- Bir 24-yuvalı plaka içinde bir kuyuya% 70 etanol 600-1,000 ul ekleyin. Hücre sabitleşmesi için 10 dakika boyunca% 70 etanol içinde transwell koyunuz. 24-iyi plaka transwell parçayı çıkarın ve zarın üstünden kalan etanolü çıkarmak için bir pamuk uçlu bir uygulama aleti kullanmak. Transwell membran (genelde 10-15 dakika) kurumasını bekleyin.
- Bir 24-yuvalı plaka içinde bir kuyuya% 0.2 kristal violet 600-1,000 ul eklenir ve boyama için zar içine yerleştirin. 5-10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- Yavaşça bir pipet ucu ya da pamuklu çubuk ile zarın üstünden kristal mor çıkarın. Gerektiğinde çok dikkatli bir şekilde, sabit bir hücrelerini yıkama önlemek için fazla kristal Viole kaldırmak için pek çok kez damıtılmış su içine daldırma zart. Transwell membran kurumasını bekleyin.
- Görüntüle, ters döndürülmüş bir mikroskop altında ve kemo-cezbedici doğru zardan geçirilir ve zarın alt (Şekil 3) üzerine takılı olan hücrelerin ortalama bir miktar elde etmek için farklı görüş alanları hücrelerin sayısı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunulan deney yara kapatma ve Transwell hücre göçü deneyi, bir model sistem olarak fare B16F10 melanom hücreleri kullanılarak yapıldı. Yara kapatma tahlilde, B16F10 hücrelerinin bir 6-yuvalı doku kültürü plakasında tohumlandı ve 24 saat içinde% 100 konflüansa büyütülür. Yaklaşık 700 mikron genişliğinde bir yara time-lapse mikroskopi kullanılarak kaydedilen bir pipet ve yara kapanmasını (hücre göçü) kullanılarak oluşturulmuştur. Alternatif olarak, yara kapama da time-lapse mikroskopi 1 mevcut değilse farklı zaman noktalarında anlık fotoğraf alarak ele alınabilir. Dört 0 ° C'de hızlandırılmış dizi resim, 4, 8, ve 12 saat zaman noktalarında, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Yara genişliğine dayanarak, 40,42 um de hücre göçü göç mesafe ve hızı hesaplanır / saat (Şekil 1B). Time-lapse resimleri de İmageJ program (ek video) kullanarak bir video içine monte edilmiştir. The dinamik hücre göçü süreci okudu olabilir. Şekil 2'de gösterildiği gibi, lamellipodia (ön taraf) ve kuyruk (arka taraf) ile hücrelerin göç morfolojisi açık bir şekilde gözlendi.
Transwell hücre göçü deneyinde, Corning 24-çukurlu uçlar kullanılmıştır. B16F10 melanom hücrelerinin serumsuz DMEM ortamı ve% 0.1 BSA içeren tampon içinde göç 1 x 10 6 hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda yeniden süspansiyon haline getirilmiştir. % 10 fetal sığır serumu ihtiva eden DMEM ortamı içinde yetiştirilen NIH3T3 fibroblast hücrelerinden elde edilen koşullu ortam, kemo-çekici bir madde olarak kullanılmıştır. B16F10 hücrelerinin 100 ul alt bölme veya geçiş tamponu, aynı hacimde ilave edildi üst odası ve kemo-cezbedici 600 ul transwell membran üzerine ilave bir negatif kontrol olarak ilave edilmiştir. Prosedür tarif edildiği gibi hücre göç gerçekleştirildi. Göç eden hücre sayısı, bir mikroskop altında ya da sayılarak değerlendirilmektedir edilebilirGörüntüler (Şekil 3B) değerlendirilir. Şekil 3'te gösterildiği gibi, kontrol göç tamponu (Şekil 3C) ile karşılaştırıldığında, kemo-cezbedici doğru göç hücrelerinde bir 15-kat daha yüksek olmuştur. Transwell tahlil hücre kemotaksisini, kemo-cezbedici doğru yönlü hücre göçünü inceler.
Şekil 1.. B16F10 melanoma hücre yara kapama deneyi. (A) 16 saat yara kapama tahlil resimlerin sırasında time-lapse mikroskop kullanılarak her 5 dakikada alındı. Örnek 0 ° resim, 4, 8 ve 12 saat gösterilir ve Ölçek çubukları (400 um) bir yara genişlik ölçümleri için ilave edilir. (B), yaranın uzaktan um olarak ölçülmüştür. Bir dağılım plot zamanla yaranın genişliği ve yara kapanma oranı hesaplandı göstermek için kullanılmıştır. Geniner 2 değer oranı, bir lineer regresyon GraphPad yazılımı (sürüm 5.0, GraphPad Software, Inc) kullanılarak yara genişliği veriler üzerinde çalıştırıldı. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. 16 saat yara kapama tahlil resimlerin sırasında yara kapama testinin time-lapse mikroskobu. Gelen B16F10 hücreleri göç Morfoloji her 5 dakikada alındı. Tüm resimler İmageJ program (5 kare / saniye) kullanarak bir video içine monte edilmiştir. Hücre kutuplaşma, lamellipodia uzatma ve arka kenar geri çekilmesini içeren hücre göçü gözlenmiştir. Video 34.6, 36.6, ve 38.6 saniyelik zaman noktalarından Resimleri (video zamanı gerçek zaman atlamalı göç süresine tekabül (sunuldusaat: dk: sn) 34.6 saniye, 14:20:00; 36.6 saniye, 15:10:00; sırasıyla 38.6 saniye, 16:00:00). Ölçek çubuğu 50 mikron. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
B16F10 melanom hücrelerinin Şekil 3,. Transwell göç deneyi. (A) hücre göçü ve işgali ölçmek için kullanılan transwell uç cihazının bir diyagram. (B) B16F10 hücre transwell göçü Örnek resimler. Hücre göçü tampon ve NIH3T3 hücre koşullu ortam, sırasıyla, negatif kontrol ve kemo-cezbedici olarak, alt bölmeye eklendi. Prosedür anlatıldığı gibi kristal viyole ile hücre göçü ve boyama sonra, göç hücreleri (mor lekeli) resimlerinin bir micr kullanılarak çekildi10x objektif (toplam büyütme 100x) ile Oscope. Membranların gözenekleri de resimde çok sayıda küçük, yuvarlak ve koyu renkli noktalar olarak görülebiliyor.. Göç tampon ya da kemo-cezbedici (100x Toplam büyütme az 5 resim alanlarının Ortalama) doğru göç hücreleri (C) Kantitasyonu Lütfen Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Bir B16F10 melanoma hücre yara kapama testinin Ek video. Time-lapse video. Resimlerde 193 resim oluşturmak için 16 saat boyunca her 5 dakikada bir alındı. Tüm resimler İmageJ program (5 kare / saniye) kullanarak bir video içine monte edilmiştir. Yüklemeler altında "Supplementary_Video_JOVE.avi" ek dosyasına bakın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücre göçü kanser araştırmalarında incelemek için önemli bir yönüdür ve aynı zamanda, gelişim ve yara iyileşmesi immünolojik çalışmalar uygulanabilir. Hücre kültürü kapatma deneyi yara ve transwell hücre göçü ve işgali deneyleri hücre göç davranışları ayrıntılı bilgilerin açığa çıkarılması ve hücre göçü 1,2,10,14 moleküler mekanizmaları araştırmak için kullanılabilir. Çalışmamız B16F10 melanom hücre çizgisinin hareket hızı ve invazyon yeteneklerini belirlemek için aşağıdaki hücre hareketi deneyleri kullanılır.
Hücre yara kapatma tahlili, hücre bir birleşik levha olarak yapılmış bir yara geçiş ve ardından kapatmak için, belirli bir hücre hattının kapasitesini incelemektedir. Bu deney, temel donanımları ile ve mevcut yöntemlere göre gruplara yerden erişilebilir bir hücre göçü de ölçülmesi için basit bir yoludur. Yara kapatma tahlilinde bazı değişiklik tek tek tedavi grupları bulunabilir, ancak birkaç adımda olduğu may bunu azaltılmasına yardımcı olmak için alınmalıdır. Değişimini azaltmak için bir yöntem, potansiyel bir senkron izdiham elde etmek ve her bir deneyin başlangıcında sağlıklı hücre durumunu korumak için hücrelerin aynı sayıda örnek her plaka etmektir. Hücre kültürü deneylerinde çeşitli denemeler bağımsız örnekler arasında değişmez izdiham ve sağlıklı hücre statü elde etmek için gerekli olan tam kaplama sayısını belirlemek için gerekli olabilir. Ayrıca, örneklem boyutunun artırılması da varyasyonu azaltacaktır. Önemli göç gözlemlemek için 24 saatten fazla inkübasyon zaman gerektiren yavaş göç hücre hatları için, potansiyel testinin sonucunu etkileyebilecek hücre sayısı değişiklikleri önlemek için afidikolin veya diğer çoğalma inhibitörü kullanmak daha uygun olur.
Hücre yara kapama deneyi, tek hücre göç davranışları ayrıntılı bir değerlendirmesini kullanarak hücre göçü hız çalışma yeteneği mastering sonra da 14 tamamlanabilir. Ayrıca, izlenerek wound kapatma tahlil hücreler tespit edilebilir ve iskelet yapısı ve dinamikleri ile ilgili çeşitli proteinler görülebilir ve İmmunositokimyayı 2 kullanılarak değerlendirildi. Bu analiz, önceden bilinmeyen daha detaylı biyokimyasal değişikliklere yol açabilir. Hücre yara kapama deneyi de time-lapse floresan mikroskobu kullanarak göç dinamiklerini incelemek için gerçek zamanlı canlı hücre görüntüleme için son derece müsait. Örneğin, aktin-GFP, tubulin-GFP ve paxillin-GFP füzyon proteinleri, hücre göçü ve yapışması 18,19 farklı zaman noktalarında proteinlerin lokalizasyonu görüntülemek için canlı hücrelerde ifade edilebilir. Yara kapatma tahlilinde bazı sınırlamaları Örneğin, bu yapışkan olmayan hücreler için uygun değildir ve hücre kemotaksisini ölçmez, bu içerir. Buna ek olarak, bazı hücre çizgileri yara (örneğin HEK293T hücreleri) yapılır hemen sonra levhadan ayırmak için bir eğilim vardır. Bu hücre hatları için, ön-döküm yara plakaları veya transw kullanmak daha iyidirell göç deneyi, aşağıda tarif.
Transwell hücre göçü ve yayılması deneyi, özel bir kemo-cezbedici algılar ve buna karşı fiziksel bir engel üzerinden geçirmek için hücrelerin yeteneği ayrıntılı bir analizini sağlar. Bu test ayrıca ECM invazyonu ve ekstravazasyonu 1,10 sürecini taklit etmek için hücre dışı matrisin bir tabaka ya da transwell membran üzerinde endotelyal hücrelerin bir katman eklenerek hücre istilasını araştırmak için kullanılabilir. Buna ek olarak, Matrigel ile istila sonra, floresan mikroskobu ile kombinasyon halinde hücre iskeleti proteinlerin immünolojik boyama, 3-B istilası sırasında morfolojik çalışma için değerli olabilir. Transwell hücre işgali testi kullanılarak bir sınırlama hücre işgali o zaman atlamalı veri konvansiyonel mikroskobu ile ulaşmak ve bu sürecin hücre görüntüleme karmaşık yaşamak zordur.
Doğru sonuçlar elde etmek için, pek çok kritik adımlar tra sırasında vardırönem taşımaktadır nswell hücre göçü ve invazyon deneyleri. Hücre göçü, hız bu yana geniş çapta değişebilir İlk olarak, farklı hücre tipleri arasında birkaç ön deney prosedürü kullanılacak belirli bir geçiş zaman aralığı kabul gerçekleştirilmelidir. İkinci olarak, kemo-çekici de ilginç hücre türü için geçerli olmalıdır. Kemo-cezbedici geniş bir yelpazede son geçişi ve belirli hücre tipi istilası yeteneğini ölçmek önce deneyler önceki olarak incelenmelidir. Fibroblastlar-koşullandınlmış madde içinde genellikle hücre tiplerinin geniş bir aralığı için güçlü bir kemo-çekici bir madde olarak kullanılır. Tek bir saflaştırılmış kemo-çekici kullanılırsa kemo-çekici madde reseptörleri ilgi hücre tipi olarak ifade edilmiştir emin olun. Son olarak, hücre yayılması deneyinin Matrigel ya da diğer hücre dışı matrisin kaplama deneysel varyasyonu en aza indirmek amacıyla homojen olduğundan emin olun. Sonuç olarak, bazı sınırlamalar vardır, ancak, oldukçaBurada açıklanan erişilebilir Hücre göçü, deneyler, biyolojik çalışmalar geniş bir aralığı için yararlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-073 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini | 100106 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco | 25200-056 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-250 | |
| Crystal violet | Sigma | C0775-100G | Dissolved in water at 0.2% |
| Cell disassociation buffer | Gibco | 13151-014 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Model # 3145 | |
| SterilGARD biosafety hood | The Baker Company, Inc. | Model # VBM-600 | |
| EVOS Fl inverted microscope | Thermo Fisher Scientific | Model # AMF-4302-US | |
| Tissue culture plate | Becton Dickinson | 353046 | Catalog number varies depending on the type of culture plate |
| Corning Transwell insert | Fisher | 07-200-150 | Catalog number varies depending on the pore size of the membrane |
References
- Castellone, R. D., Leffler, N. R., Dong, L., Yang, L. V. Inhibition of tumor cell migration and metastasis by the proton-sensing GPR4 receptor. Cancer Lett. 312 (2), 197-208 (2011).
- Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Rev. 28, (2009).
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Peter, C., et al. Migration to apoptotic "find-me" signals is mediated via the phagocyte receptor G2A. J. Biol. Chem. 283 (9), 5296-5305 (2008).
- Radu, C. G., Yang, L. V., Riedinger, M., Au, M., Witte, O. N. T cell chemotaxis to lysophosphatidylcholine through the G2A receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (1), 245-250 (2004).
- Buul, J. D., Hordijk, P. L. Signaling in leukocyte transendothelial migration. Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. (5), 824-833 (2004).
- Yang, L. V., Heng, H. H., Wan, J., Southwood, C. M., Gow, A., Li, L. Alternative promoters and polyadenylation regulate tissue-specific expression of Hemogen isoforms during hematopoiesis and spermatogenesis. 228 (4), 606-616 (2003).
- Yang, L. V., Radu, C. G., Wang, L., Riedinger, M., Witte, O. N. Gi-independent macrophage chemotaxis to lysophosphatidylcholine via the immunoregulatory GPCR G2A. Blood. 105 (3), 1127-1134 (2005).
- Yoshida, M., Yoshida, K. Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+. Mol. Hum. Reprod. 17 (8), 457-465 (2011).
- Albini, A. Tumor and endothelial cell invasion of basement membranes. The matrigel chemoinvasion assay as a tool for dissecting molecular mechanisms. Pathol. Oncol. Res. 4 (3), 230-241 (1998).
- Fidler, I. J. Critical determinants of metastasis. Semin. Cancer Biol. 12 (2), 89-96 (2002).
- Steeg, P. S. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nat. Med. 12 (8), 895-904 (2006).
- Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. Chemotaxis in cancer. Nat. Rev. Cancer. 11 (8), 573-587 (2011).
- Zhang, Y., et al. Comparative study of 3D morphology and functions on genetically engineered mouse melanoma cells. Integr. Biol. (Camb. 4 (11), 1428-1436 (2012).
- Junger, W. G. Purinergic regulation of neutrophil chemotaxis. Cell. Mol. Life Sci. 65 (16), 2528-2540 (2008).
- Lazennec, G., Richmond, A. Chemokines and chemokine receptors: new insights into cancer-related inflammation. Trends Mol. Med. 16 (3), 133-144 (2010).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17, (2010).
- Cortesio, C. L., Boateng, L. R., Piazza, T. M., Bennin, D. A., Huttenlocher, A. Calpain-mediated proteolysis of paxillin negatively regulates focal adhesion dynamics and cell migration. J. Biol. Chem. 286 (12), 9998-10006 (2011).
- Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. Actin microtubules and focal adhesion dynamics during cell migration. Int. J. Biochem. Cell Biol. 35 (1), 39-50 (2003).
