Fysiologiska och anatomiska tekniker visat att ta itu med funktion och struktur för gemensamma proprioceptorer och muskelspänningar receptorer i kräftdjur walking lemmar.
Det främsta syftet med dessa förfaranden är att visa för undervisnings-och forskningsändamål hur du spelar in aktiviteten av levande primära sensoriska nervceller som ansvarar för proprioception som de upptäcka gemensam position och rörelse, och muskelspänningar. Elektrisk aktivitet från kräftdjurs proprioceptorer och drag receptorer registreras av grundläggande neurofysiologisk instrumentering, och en omvandlare används för att samtidigt mäta kraften som genereras genom att stimulera en motorisk nerv. Dessutom visar vi hur man kan färga nervceller för en snabb bedömning av deras anatomiska arrangemang eller för permanent fixering. Färgning avslöjar anatomiska organisation som är representativ för chordotonal organ i de flesta kräftdjur. Jämföra spänning nerv svar på de proprioceptiva svaren är ett effektivt hjälpmedel i undervisningen i att bestämma hur dessa sensoriska neuroner definieras funktionellt och hur anatomin är korrelerad till funktionen. Tre färgningsteknikerpresenteras låta forskare och lärare att välja en metod som är idealisk för deras laboratorium.
Proprioception är känslan av lem position och rörelse som möjliggör samordnad motoriskt beteende. Proprioceptorer består av läge (statisk) och rörelse (kinestetiska) receptorer. I insekter och kräftdjur, chordotonal organ är de strukturer som tillhandahåller denna information till CNS 1. Inte alla chordotonal organ spänner över ett gemensamt, men de kan ändå följa gemensamma rörelser på grund av deras fastsättning på apodemes (senan som strukturer), som spänner över gemensamma och rör i anslutning till skelettmuskulaturen och gemensam artikulation. Krabba benen har sex leder, var och en har en eller två chordotonal organ 2. Vanligtvis en chordotonal organ har 60-100 eller flera sensoriska neuroner inbäddade i en elastisk tråd, nervceller som signalerar statiska gemensam position, riktning och hastighet på rörelsen 3-6. Ingången från chordotonal organ i varje led och ben är då centralt bearbetas möjliggör koordinerade rörelser av djuret.
<p class="jove_content"> De krafter som benmuskler producerar under isometriska och isotoniska sammandragningar upptäcks av spänn receptorer som är förknippade med muskelfibrer och deras bilagor till apodemes7-9. I de kräftdjur walking ben protokoll som följer presenterar vi metod för inspelningar från primära sensoriska nervceller som övervakar proprioception och de nervceller som reagerar på krafter som genereras av muskelfibrer. En teknik för aktivering av benrörelser och kvantifiera styrke presenteras också, liksom anatomiska tekniker som kan användas för att karakterisera arrangemanget av dessa perifera nervsystemet strukturer.De förfaranden som visat nedan möjliggör strukturell och funktionell analys av de nervceller som innerverar båda typerna av receptorer i förhållande till deras plats på en chordotonal elastisk tråd och apodeme. För att illustrera, använder vi propodite-dactylopodite (PD) chordotonal orgel, det organ som sträcker sig över den mest distala segmentet av krabba benet 3.Även om detaljerade elektrofysiologiska studier började på 1930-talet och fortfarande pågår i dag, har vissa aspekter blivit känt om segment anslutningar proprioceptorer i de olika lederna och deras roller i samordnad kontroll av muscles10-16. Upprätta struktur-funktion relationen mellan de proprioceptiva organ, muskler och nervsystem kommer att ytterligare hjälpa till att definiera dessa roller. Till exempel kommer att märka somata och distala ändelser av spänn neuroner införda i apodeme avslöja deras placering i förhållande till muskelfibrerna 8,17-21.
Vi presenterar tre färgningsteknik för kräftdjurs ben som kan användas i forskning eller akademiska laboratorier. Metylenblått färgning ger lämplig kontrast för muskler och nerver och rekommenderas som en enkel teknik för studenter att lära sig anatomi. Labs som har fluorescens mikroskopi uppställningar kan åstadkomma mer selektiv neuronal färgning genom att kort utsätta nervens till det vitala färgämnet 4-di-2-ASP. Det tredje alternativet är CoCl 2 återfyllning, som fläckar och fixar nervceller, och kräver inte fluorescens avbildning. Även om det är arbets-och tidskrävande, ger denna färgningsprocess med hög kontrast och specificitet för nerverna som är fyllda. Tillsammans dessa tekniker kan användas för att jämföra olika chordotonal organ, inte bara inom en lem eller mellan benen, men även bland annat kräftdjur och insektsarter 20-22. Blå krabbor (C. sapidus) som används i fysiologiska inspelningar och för anatomisk färgning är lätt tillgängliga över hela södra och sydöstra gränsen till USA. Arten fungerar som en representant för de chordotonal och spänningsnerv arrangemang finns i de flesta krabbor. Laboratorier på västkusten kommer att föredra att använda den mycket större Dungeness krabba (Cancer magister) för dessa experiment.
Syftet med denna uppsättning av experiment är 1) att lära och ställa ut de grundläggande principerna för extracellulära inspelningar från en identifierbar proprioceptiva organ och spänningsnerven och 2) för att betona vikten av anatomisk kartläggning i samband med fysiologiska funktionen av vissa sensoriska system. Denna experimentella metod och djurmodeller används är billiga och relativt lätta att genomföra i neurofysiologi undervisningslaboratorier.
De nervceller i chordotonal organ är av två specifika funktionella typer, de som reagerar på rörelse och de som svarar på statiska positioner. Encelliga inspelningar från en variation av chordotonal organ, oavsett vilken gemensam undersöks, har visat detta vara fallet 3,5. Faktum chordotonal tillhörande organen de antennal lederna hummer avslöjar samma två sensoriska typer och grundläggande anatomi 27. Förutom att det finns två neurontyper (rörelse-och positipå), nervceller har samma anatomiska arrangemang på sina respektive elastiska strängar. Den stora somata belägen proximalt på strängen brukar tillhöra de dynamiska rörelsekänsliga nervceller. Nervceller som signalerar statiska positioner har små somata och ligger distalt. Dessa celler är tonically active. PD gemensamt innehåller endast en enda chordotonal orgel medan det finns två chordotonal organ i carpus-propodus (CP) och Merus-carpus (MC) leder.
Den dissektion att exponera proprioceptiva strukturer i blå krabbor (C. sapidus) för elektrofysiologiska inspelning kräver en strategi som gör att gemensamma rörelser att äga rum i de naturliga positioner medan du spelar in från sensoriska neuroner. Spänningen nerv för öppnaren muskeln i gångbenet är en mycket fin nerv består av flera neuroner. Såvida man är försiktig, spänningen nerven samt motor nerv innerverar muskeln som skall stimuleras, kan skadas under denna dissektion. Föroptimala inspelningar sug elektroder måste anpassas till storleken på nerven. Inspelningar är lätt tillgängliga i en studentlaboratorium med hjälp av en 30-40X förstoring dissekera mikroskop och low-end micromanipulators.
Framtida experiment som skulle vara intressant att fortsätta med de gemensamma chordotonal organ skulle vara att undersöka de strukturella och fysiologiska profiler under benet förnyelse i olika arter i olika skeden i livscykeln som en uppföljning till en inledande studie som använde Cancer magister 19,26 . Frågor som återstår att lösas är 1) gör distribution och organisation av regenererade nervceller beror på åldern på djuret när regenerera en lem, 2) är de axonal prognoser till CNS (ventrala nerv sladd) i en regenererande lem funktionell eller gör det tar tid och gemensam användning för att inrätta funktionella anslutningar, och 3) vad som händer med de avhuggna axoner proximalt om autotomy planet när lem är autotomized? 28
Kräftdjur uppfyller miljöförhållanden och den omgivande temperaturen, men det är oklart hur de upprätthåller samordningen inom en neural krets som nervceller förändrar sin verksamhet till följd av temperaturförändringar. En långsam förändringshastighet kan tillåta djuret lite tid för acklimatisering under det att en snabb förändring kan not29, 30. Fysiologiska förändringar i pH eller osmolaritet på grund av ämnesomsättning, beteende 31, eller miljöpåverkan kan medföra liknande utmaningar till nervbanor som är involverade i proprioception. Dessa kräftdjur förberedelser är idealiska för att hantera dessa typer av problem, eftersom deras funktion är väl beskriven i en enda cell nivå.
I detta protokoll har vi visat den fysiologiska betydelsen av spännings neuroner vid övervakning kraft som genereras av öppnaren muskeln. Dessa spänningsreceptorer kan spåras till sin plats inom apodeme med färgningsförfaranden. Dessanervceller, som hos däggdjur, detektera kraft på olika nivåer och rekrytera ytterligare neuroner som kraften ökar. Frekvensen i aktivitet är relaterad till stimuleringen frekvensen hos motor neuron tills mättnad i sändningen har skett. Med hjälp av en snabbkoppling protokoll med böjd dactylus gemensamma, försvinner spänningen aktivitet snabbt men återvänder sedan när återfå spänning i en helt utsträckt gemensamt. Detta är ett klassiskt experimentella förfarandet för att illustrera den kraft som mäts av spänn receptorer. Olika neuromodulators kan användas till att förbereda för att se hur det påverkar utvecklingen av våld och neuronal svar. En av de viktigaste aspekterna är hur de neurala svaren behandlas och integreras i det centrala nervsystemet och deras inverkan på aktiviteten av motoriska nervceller. De tekniker som vi har visat tillåter en att börja ta itu med mer information om spänning (sensoriska) nerv-motorneuron krets funktion, dvs signal i en intakt ben till ganglion och tillbakatill muskeln.
De färgningsförfaranden visade är nyckeln till att förstå fysiologi sensoriska nervceller som innerverar proprioceptiva organ. Anatomiska arrangemang av nervceller som bygger på funktion och storleken på soma är liknande i de olika chordotonal organen inom krabba benen. Det är inte känt om liknande neuronala arrangemang finns också i andra skaldjursarter och insekter. Kombinera fysiologiska inspelningar från enstaka celler och kartlägga läget möjliggör direkt struktur funktionssamband. Den långsiktigt bevarande av den anatomiska arrangemanget med CoCl2 färgning och fixering gör att man upprepade gånger göra åtgärder och bedöma den strukturella arrangemang.
Proprioception och spänning mottagning av skelettmuskulaturen är sensoriska modaliteter som möjliggör samordnade beteenden och reaktioner på yttre och inre miljö för ledade djur i en mängd olika skelettmuskulaturen konfigurationer. Muskeln receptorn organ i buken av kräftor är en annan väldokumenterad preparat (se Crawdad Project, http://www.crawdad.cornell.edu/ ) för undervisningsändamål av proprioception med bara två neuroner per buken hemi-segmentet 23 . Att kunna spela in från enskilda nervceller till sensoriska nervbuntar ger ytterligare information som stöd i att förstå de grundläggande principerna för sensorisk mottagning. Dessa relativt enkla kräftdjur förberedelser tillåter en att ta itu med grundläggande aspekter av proprioception och spänningsövervakning, med potential att fastställa de nervbanor som möjliggör central integration av proprioceptiva och andra sensoriska ingångar 9-12, 32, 33.
The authors have nothing to disclose.
Författarna är tacksamma för de konstnärliga bidrag Hyewon Cooper.
Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
HEPES acid | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
HEPES base | Sigma | ||
D-Glucose | Sigma | G7021 | |
MgSO4•7H2O | Sigma | M2643 | |
Na2SO4•10H2O | Sigma | 246980 | |
Bouin’s solution fixative | Sigma | HT10-1-32 | Caution: Hazardous material (Special shipping cost required) |
CoCl2 | Sigma | Caution: Hazardous material. Please follow proper disposal according to local and federal regulations. | |
Methylene blue chloride | Matheson Co., Inc | Basic Blue 9, C.I. 52015 | |
4-Di-2-ASP | Molecular Probes | 4-(4-diethylaminostyryl)-N-methylpyridinium iodide | |
Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
Materials | |||
Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
Intracellular electrode probe | |||
Faraday cage | |||
Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
Dissecting microscope (100X) | |||
Fiber optic lamp | |||
Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, suction electrodes |
Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
Raised preparation stand | |||
Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
Computer | Any company | ||
AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
Force transducer | AD Instruments | 0-50g | MLTF050/ST |
Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
LabChart7 | AD Instruments | ||
Electrical leads | Any company | ||
Glass tools | Make yourself | For manipulating nerves | |
Cable and connectors | Any company | ||
Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
Beakers | Any company | ||
Wax or modeling clay | Any company or local stores | ||
Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
Plastic tip for suction electrode | Local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size |