Summary
Tecniche fisiologiche e anatomiche sono dimostrati per affrontare funzione e la struttura per propriocettori articolari e recettori tensione muscolare degli arti crostacei piedi.
Abstract
Lo scopo principale di queste procedure è di dimostrare per fini didattici e di ricerca come registrare l'attività dei neuroni sensoriali primari vivere responsabili della propriocezione come sono Rilevazione della posizione comune e il movimento, e la tensione muscolare. Attività elettrica da propriocettori crostacei e recettori di tensione viene registrata dalla strumentazione neurofisiologico di base, e un trasduttore viene utilizzato per misurare simultaneamente forza generata stimolando un nervo motore. Inoltre, dimostriamo come macchiare i neuroni per una rapida valutazione della loro organizzazione anatomica o per il fissaggio permanente. La colorazione rivela organizzazione anatomica che è rappresentativo di organi cordotonali nella maggior parte dei crostacei. Confrontando le risposte tensione nervose verso le risposte propriocettive è uno strumento didattico efficace nel determinare come questi neuroni sensoriali sono definiti funzionalmente e come l'anatomia è correlata alla funzione. Tre tecniche di colorazionesono presentati consentendo ai ricercatori e istruttori di scegliere un metodo che è ideale per il loro laboratorio.
Introduction
Propriocezione è la sensazione di posizione dell'arto e movimento che consente comportamento coordinato motore. Propriocettori consistono in posizione (statico) e il movimento recettori (cinestetica). In insetti e crostacei, gli organi cordotonali sono le strutture che forniscono tali informazioni al sistema nervoso centrale 1. Non tutti gli organi cordotonali abbracciano una comune, ma possono ancora controllare i movimenti articolari a causa del loro attaccamento alle apodemes (come le strutture tendinee), che coprono il giunto e si muovono in associazione con il muscolo scheletrico e l'articolazione congiunta. Granchio gambe hanno sei giunti, ciascuno con uno o due organi cordotonali 2. Tipicamente un organo cordotonali ha 60-100 o più neuroni sensoriali incorporati all'interno di un filo elastico, i neuroni che segnalano la posizione comune statica, direzione e velocità di movimento 3-6. L'ingresso da organi cordotonali ad ogni articolazione e la gamba viene poi elaborato centralmente permettendo movimenti coordinati da parte degli animali.
Le procedure illustrate in dettaglio successivamente consentire l'analisi strutturale e funzionale dei neuroni che innervano entrambi i tipi di recettori relativi alla loro posizione su un filo elastico cordotonali e apodeme. Per illustrare, usiamo il propodite-dactylopodite (PD) organo cordotonali, l'organo che attraversa il segmento più distale della gamba granchio 3.Anche se studi elettrofisiologici dettagliati iniziarono nel 1930 e sono ancora in corso oggi, alcuni aspetti sono diventati noti per le connessioni segmentale dei propriocettori nelle varie articolazioni e il loro ruolo nel controllo coordinato di muscles10-16. Stabilire il rapporto struttura-funzione tra gli organi propriocettivi, i muscoli e il sistema nervoso ulteriormente aiutare a definire questi ruoli. Ad esempio, l'etichettatura del somata e terminazioni distali dei neuroni tensione inserite nel apodeme rivelerà la loro posizione rispetto alle fibre muscolari 8,17-21.
Presentiamo tre tecniche di colorazione per le gambe dei crostacei che possono essere utilizzati nella ricerca o laboratori accademici. Metilene colorazione blu offre un contrasto adeguato per muscoli e nervi ed è raccomandato come una semplice tecnica per gli studenti di imparare l'anatomia. Labs che hanno configurazioni microscopia a fluorescenza possono realizzare più selettivo colorazione neuronale esponendo brevemente il nervos al colorante vitale a 4-di-2-ASP. La terza alternativa è CoCl 2 di recupero, che colora e fissa i neuroni, e non necessita di imaging di fluorescenza. Anche se è lavoro e tempo intenso, questo processo di colorazione conferisce un elevato contrasto e specificità per i nervi che sono pieni. Insieme, queste tecniche possono essere utilizzate per la comparazione dei vari organi cordotonali, non solo all'interno di un arto o tra gli arti, ma anche tra le altre specie di crostacei e insetti 20-22. Granchi blu (C. sapidus) utilizzati nelle registrazioni fisiologiche e anatomiche per la colorazione sono facilmente disponibili in tutto il confine meridionale e sud-est degli Stati Uniti. Questa specie funge da rappresentante del regime nervose cordotonali e la tensione si trovano nella maggior parte dei granchi. Laboratori sulla costa occidentale preferiscono utilizzare il molto più grande granchio Dungeness (Cancer magister) per questi esperimenti.
Protocol
1. Dissection e registrazione attività elettrica del nervo Propodite-dactylopodite (PD)
- Tenere il granchio attraverso il carapace da dietro, ed evitando gli artigli, pizzicare la parte prossimale del meropodite con una pinza. La gamba si autotomize per evitare che l'animale dissanguato. Prestare attenzione quando si maneggiano i granchi blu così come sono piuttosto aggressivi e molto veloce.
Figura 1. Prima camminare gamba di un granchio. La posizione anatomica degli organi cordotonali (regioni tratteggiate) sono sovrapposti su questo schema. La freccia doppia testa indica dove transetto la gamba per gli esperimenti PD nervose. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita . - Effettuare un taglio tra il propodite e carpodite. Eliminare il carpopodite e t ha attaccato meropodite (Figura 1).
- Tagliare una grande finestra nella cuticola sulla pigmentato (laterale) lato del propodite con un bisturi con lama # 11 (Figura 2 e 3). Nota: Non tagliare profondamente.
- Rimuovere lo strato della cuticola facendo scorrere la lama di bisturi di sotto e parallelamente alla cuticola. Questo recide le fibre muscolari allegate alla cuticola.
- Con la stessa tecnica tagliare una piccola finestra sul (mediale) lato del propodite pigmentless, ma lasciare il condilo (joint presa o cerniera tra i segmenti) allegato intatto.
Figura 2. Tagliare lungo la linea tratteggiata sulla propodite. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
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Figura 3. Esporre il nervo nella finestra (le frecce delineano il fascio nervoso). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita . - Preparare un piatto Sylgard alberato contenente granchio soluzione fisiologica per bloccare la preparazione verso il basso. Nota: Vedi Tabella 1 per determinate specie ricette saline.
- Individuare l'organo PD sondando attentamente con gli aghi di vetro fuoco lucido. Il filo elastico che attraversa il giunto ha un aspetto argento.
- Rimuovere fibre muscolari che oscurano l'immagine dell'organo da entrambi i lati del tendine. State molto attenti a non ferire l'organo PD o il suo nervo.
- Una volta che questo è stato fatto, saldamente riattaccare la preparazione al piatto con il lato pigmento (laterale) rivolto verso l'alto (figura 4).
Figura 4. Esposti organo PD e dei nervi. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
- Seguire l'organo nervo PD nel propodite quanto prossimalmente possibile per liberare-up una lunga durata del nervo (1,5 cm) per scopi di registrazione. Questo è fatto meglio, mentre il nervo PD è ancora attaccato alla principale nervo della gamba.
- Dopo aver separato il nervo PD dalla principale nervo della gamba con l'ausilio di aghi di vetro, recidere il nervo PD prossimale con le forbici iris. Nota: Non allungare o tirare il nervo durante la dissezione.
- Spostare il dactylopodite ad una posizione estesa e completamente flesso. Prendete nota di dove le posizioni di flessione ed estensione estremi sono e un punto a metà strada per un uso successivo.
- Mettere un filo di terra all'interno del bagno salino.
- Accendere la postahardware di registrazione lectrophysiology / software. Nota: La nostra impostazione è stata descritta in precedenza 23.
- Posizionare il microscopio in modo che si affaccia sul palco microscopio. Una volta che il piatto di preparazione è posto sul palco, sarà necessario regolare la posizione di alta intensità del fascio illuminatore per visualizzare al meglio la preparazione.
- Posizionare il micromanipolatore in modo che il gruppo di elettrodi di aspirazione allegata avrà facile accesso al bagno salino e preparazione. L'elettrodo di aspirazione è costruito come mostrato in un video online 24.
- Per rilevare l'attività neurale, disegnare l'estremità tagliata del nervo PD nel elettrodo di aspirazione.
- Spostare il dattilo in tutta posizioni estese e flesse per diversi cicli con l'ausilio di una sonda di vetro o tassello di legno.
- Avanti osservare l'attività quando il dattilo è bloccato nelle posizioni estese, flesse, e metà.
2. Registrazione attività elettrica dalla tensioneNervo mentre il monitoraggio della forza
- Determinare il lato mediale e laterale della gamba. Il lato mediale ha una texture morbida che può essere sentito da pizzicando delicatamente nella regione meropodite con un'unghia.
- Mettere questo morbido cuticola verso l'alto nel piatto. Il nervo motore excitor che innerva il muscolo opener innerva anche il muscolo barella nella carpopodite.
- Per stimolare il muscolo apri nervo motore barella nella regione carpodite è isolato e stimolato con un elettrodo di aspirazione. La parte prossimale della gamba viene rimosso dal sezionare il meropodite con le forbici.
- Rimuovere una sezione della cuticola nella regione carpo sul lato interno (lato mediale, Figura 5A).
- Tagliare il apodeme del muscolo bender e rimuovere con cautela il muscolo per non tirare la principale nervo della gamba fuori della cavità gamba (Figura 5B, C notare le frecce dove Bender apodeme è separato). Il nervo gamba principale e un reggisenoNCH al muscolo barella può essere osservato (Figura 5D).
- Trova il nervo dirama dalla principale fascio nervoso al muscolo barella (Figura 5E, a freccia). Ciò può essere tagliato vicino al muscolo e tirato in un elettrodo di aspirazione per stimolare (Figure 5F e G, freccia rappresenta il ramo).
- Prendere in giro una sezione del nervo che proietta verso l'opener senza pizzicare il nervo. Transetto nervo motore barella / opener.
- Tirare il nervo motore in elettrodo di aspirazione e poi stimolarlo.
- Per esporre il muscolo apri e la tensione nervosa rimuovere il muscolo più stretta e la regione ventrale del propodite. Tagliare il muscolo più stretto con un bisturi con lama # 11 nella propodite (Figura 6). Nota: Non tagliare profondamente nella regione prossimale perché potrebbe danneggiare il nervo motore opener.
Figura 6. Tagliare la cuticola sulla parte ventrale del propodite per esporre il muscolo più vicino in modo che possa essere rimosso. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita . - Sostituire la soluzione salina fresca salina raffreddata durante tutto il processo di dissezione per mantenere in vita i neuroni. Per maggiori dissezione, posizionare il piatto preparato sotto un microscopio da dissezione e l'uso di illuminazione a fibre ottiche.
- Tagliare con cautela il tendine più vicino dal suo attaccamento alil dattilo con le forbici di medie dimensioni appuntito.
- State molto attenti a non disturbare i rami al muscolo opener dal nervo principale della gamba che deve essere chiaramente visibile.
- Rimuovere e gettare il muscolo vicino e tendine.
- Fare un buco nel dattilo con un perno dissezione. Questo foro sarà utilizzato successivamente per agganciare il perno di metallo sulla tensione (forza) trasduttore, ma è necessario fare in questa fase del procedimento.
- Individuare il ramo nervoso che proietta al muscolo opener e apodeme nella regione distale del muscolo opener. Sondare con attenzione il nervo con lo strumento di vetro lucidati a fuoco.
- Osservare il nervo tensione che nasce dalla estremità distale del apodeme e procede al fascio nervo motore.
- Per rilevare l'attività neurale, riempire un elettrodo di aspirazione con granchio soluzione salina e disegnare l'estremità del taglio della tensione nervosa opener nel dell'elettrodo. Assicurarsi che l'elettrodo di aspirazione si adatta perfettamente sul nervo.
- Esaminare la NEURAl correlato di tensione passiva sul apodeme opener. Durante la registrazione dell'attività elettrica del nervo tensione, ruotare il dattilo rapidamente in un giunto estesa (cioè stiramento del muscolo opener).
- Successivamente, test di sviluppo forza attiva in funzione della frequenza di stimolazione.
- Fissare saldamente un gancio metallico in modo che la punta del gancio passa attraverso un piccolo foro nel dattilo.
- . Fissare l'altra estremità del gancio metallico al trasduttore di forza Nota: Assicurarsi che il trasduttore è a un angolo di 90 ° ogni volta in modo che il perno è perpendicolare al trasduttore per il rilevamento massima della forza generata.
- Tirare il gancio e dattilo in modo che sia a circa un angolo di 45 ° del giunto opener.
- Ora stimolare il nervo motore a 100 Hz per 250 msec e misurare la forza e la frequenza di scarica del nervo tensione.
- Posizionare il giunto in una posizione completamente estesa in modo che le fibre muscolari sono apertore flaccido.
- Stimulate nervo motore a 100 Hz per 250 msec e misurare la forza e la frequenza di scarica del nervo tensione.
- Bend / flettere il giunto in modo che sia completamente flessa (~ 90 °). In questa posizione le fibre muscolari del apertore sono completamente allungati. Ci può essere qualche forza misurata dal trasduttore a causa di questo allungamento passivo del muscolo.
- Stimolare il nervo motore a 100 Hz per 250 msec e misurare la forza e la frequenza di scarica del nervo tensione.
- Dopo aver misurato una forza, procedere in una serie di varie frequenze: 20, 40, 60, 80, e 100 Hz per 8-10 secondi in ogni posizione comune.
- Misurare la risposta con un rilascio di tensione rapido. Disporre il preparato in modo che il gancio sul trasduttore di forza può essere facilmente spinto fuori dal foro del dattilo.
- Bend / flettere il giunto in modo che sia completamente flessa (~ 90 °). Ora stimolare il nervo motore a 100 Hz con una stimolazione continua di 5 sec.
- Dopo la prima secondad o meno, come tensione ha costruito sul muscolo apertura, spingere il perno dal foro nel dattilo.
- Esaminare la registrazione tensione nervosa, prima e dopo il rilascio del perno che tiene il dattilo.
- Effetti modulatori di sostanze neuroattivi come octopamina, serotonina, e proctolin, che alterano l'uscita dei neuroni tensione, possono essere determinati aggiungendo queste molecole ai media balneazione sopra il muscolo apri esposto e ripetendo gli esperimenti.
- Utilizzare una pipetta e gocciolare 1-2 ml sulla preparazione.
3. Colorazione nervoso periferico strutture di sistema in Crostaceo Walking Gambe
- Metilene tecnica blu
- Diluire soluzione madre di cloruro di blu di metilene una parte (0,25%) con due parti di acqua distillata.
- Aggiungi questa miscela a cinque parti di soluzione salina tamponata. Lavare bene l'area di interesse.
- Sezionare una gamba secondo il protocollo nella sezione 1. Incubare la preparativ nella soluzione di blu di metilene a 12-13 ° C.
- Esaminare il preparato ogni 10-15 minuti con il microscopio da dissezione con illuminazione bassa intensità per seguire l'avanzamento della colorazione. In alcuni casi la colorazione sarà completato in un'ora, in altri può prendere durante la notte.
- Tecnica a 4-di-2-ASP
- Coloranti fluorescenti possono essere utilizzati per eseguire riempire il neurone PD o macchiare direttamente il preparato dal bagno. Tuttavia è necessario un microscopio adatto con capacità di vedere la macchia fluorescente.
- Sezionare una gamba secondo un protocollo nella sezione 1.
- Incubare il preparato in una concentrazione 10 mM di soluzione di 4-Di-2-ASP e lasciare il preparato in frigorifero per 15 min. Utilizzare la soluzione appena sufficiente a coprire la preparazione.
- Fotografare i preparati in modo rapido e evitare un'eccessiva esposizione alla luce mercurio. Questo colorante fluorescente svanisce in tempi relativamente brevi.
- Esporre il nervo PD secondo il protocollo nella sezione 1 e tenerlo immerso in soluzione fisiologica fredda.
- Fare un vaselina bene a tenere la CoCl 2. Se uno qualsiasi CoCl 2 sversamenti nel bagno salino l'intera preparazione si macchia nera, e la preparazione deve essere scartato.
- Scivolare un piccolo taglio di una lastra di polistirolo, per fare una piattaforma di plastica, e perno in modo tale che esso non galleggia via o immergersi nella vasca salina (Figura 7).
Figura 7. Foglio di polistirolo con perni per tenere a posto nel piatto. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita . - Espellere vaselina da un ago ipodermico multa fissata ad una siringa monouso,poi fare una barriera (un cerchio potrebbe funzionare bene), che dovrebbe essere di circa 1-1,5 mm di altezza, eccetto per una "V" superficiale sul punto centrale in cui verrà avvolto il nervo di tutti, in cima al pezzo di polistirene.
- Fai una piccola pozza di soluzione salina su entrambi i lati della barriera nei pressi del "V". Facendo attenzione a non allungare o pizzicare il nervo, il nervo sollevare con cautela dal piatto e posizionarlo nella pozzanghera salina nella vaselina bene.
- Lavorare velocemente in modo che la sezione del nervo non si asciughi, con attenzione espellere vaselina per coprire il nervo scoperto. Ora prova la barriera con soluzione salina e assicurarsi che non perde.
- Tamponare distanza salina all'interno della barriera e vedere se si riempie quando la vasca salina è alto intorno alla parete di vaselina per essere sicuri che le due parti sono isolate l'una dall'altra (Figura 8).
- Stoppino via la soluzione salina nel pozzo utilizzando un pezzo di carta velina. Evitare di lasciare la carta avvolgere il nervo.
- Effettuare una nuova pozza con un paio di piccole gocce di acqua distillata, e poi tagliare l'estremità del nervo. Fare molta attenzione a non tirare il nervo attraverso la barriera quando si effettua il taglio. Lo shock osmotico dell'acqua distillata volontà "balloon" gli assoni.
- Entro 30 sec aggiungere una piccola goccia di CoCl 2 per l'acqua, assorbire questa soluzione, e poi aggiungere abbastanza CoCl 2 per formare una pozza sul tratto accorciato di nervi (Figura 9). I preparativi sono meglio conservati in frigorifero a 13 ° C per 12-24 ore.
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Figura 9. Il PD nervo tagliato di essere esposto a CoCl 2. Il nervo taglio si gonfia in presenza di acqua che facilita e accelera il movimento delle molecole di colorante attraverso gli assoni nei corpi cellulari dei neuroni. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita . - Rimuovere le pozzanghere di umidificazione. Asciugare lontano la soluzione di cobalto con un fazzoletto di carta e lavare via i resti di cobalto, con diversi cambi di soluzione salina.
- Trasferire la preparazione isolato di una capsula di Petri piccolo bicchiere contenente circa 10 ml di soluzione fisiologica granchio. I neuroni sono lavati e le seguenti operazioni vengono eseguite in situ. Buone utensili metallici non devono essere utilizzati per gestire la preparazione dopo questo passaggio (si consiglia di utilizzare gli strumenti specifici che non devono essere utilizzati in un secondo momento per la fisiologia).
- Aggiungere 1-2 gocce di solfuro di ammonio (NH4) 2 S alla salina. Tappare la bottiglia da 2 S (NH 4) ermeticamente e mettere di nuovo nel cofano. Osservare la reazione nella preparazione sotto un microscopio da dissezione
- Entro 1-2 minuti, i neuroni cobalto-riempita ei loro processi dovrebbero iniziare a comparire perché si macchia nera.
- Dopo 5-10 minuti, sostituire la soluzione di sviluppo con soluzione salina fresca.
- Assicurarsi che la soluzione di sviluppo è stato versato nello scarico lavandino è seguita da acqua corrente per alcuni minuti o in una bottiglia di scarico con un coperchio.
- Versare la soluzione salina e fissare la preparazione del nervo per circa 15 minuti, con due cambi di soluzione fissante di Bouin. Per i tessuti più grandi come il muscolo apri (a macchiare neuroni tensione), aumentare la durata della fissazione a 30 min.
- Disidratare in una serie di crescente concentrazione di etanolo iniziando 70% (cioè 70%, 80%, 90%, 100%). Circa 10 min per ogni concentrazione è sufficiente perpiccoli tessuti.
- Dopo circa 10-15 minuti in due ricambi di etanolo al 100%, deselezionare il tessuto sostituendo etanolo al 100% salicilato di metile. La preparazione rimarrà in questa soluzione permanente per l'osservazione ripetuta. Con il tempo le celle piene diventeranno più evidenti in quanto il tessuto circostante diventerà più chiara. Metodi di intensificazione possono essere usati per aiutare a prevenire lo scolorimento nel tempo 25.
- Utilizzare lo stesso processo per riempire il nervo tensione con CoCl 2. Tuttavia, cambiare soluzione etanolica più volte in ogni etanolo disidratazione passo e incubare la preparazione all'interno alcol per circa 20 minuti per ogni passaggio per disidratare completamente i muscoli e permettere loro di cancellare bene.
Representative Results
Quando l'organo PD è allungato estendendo completamente il giunto, attività nel nervo PD è robusto durante il movimento come illustrato per il primo secondo in Figura 10. Alcune attività rimane mentre è tenuto fermo nella posizione di apertura. Questa attività è dai neuroni sensibili statici posizione (seconda metà di registrazione mostrato nella Figura 10). Movimento evoca una risposta durante lo spostamento, e la cottura è presente soprattutto durante l'allungamento del filamento cordotonali (Figura 11).
Ulteriori analisi delle punte può essere facilmente avvicinato di classificare le relative ampiezze. Questo è un approccio per dimostrare le diverse popolazioni di neuroni sensoriali essere reclutati per posizioni o tipi di movimenti 5. Ampiezze tipiche vanno 0,25-1,5 mV, ma questi valori dipendono dalla resistenza (cioè tenuta) della tenuta elettrodo di aspirazione. Frequenza dei picchi di tha varie gamme di dimensioni può anche essere rappresentato graficamente per l'analisi.
Forze generate dal muscolo apri rispetto alla frequenza di stimolazione possono essere confrontati sovrapponendo le rispettive tracce tensione-tempo sopra l'altra (Figure 13A e B). Questo può anche essere eseguita per ogni posizione collettiva a ogni data frequenza di stimolazione. Attività del nervo tensione può poi essere correlato con la quantità di forza relativa generato per ciascuna frequenza di stimolazione, e per ogni posizione comune. Come nel nervo PD, una varietà di ampiezze picco sono considerati in risposta alla contrazione del muscolo apri (Figura 13C).
Disposizione anatomica dei neuroni nella gamba a piedi è chiaramente osservata con colorazione blu di metilene (Figura 14). Notare il cordotonali filo e la tensione neurone elastico che si trova vicino al apodeme. Diversi somata con differenti diametri did località specifiche sono visibili anche in questa figura. L'intero corso del nervo tensione e barella nervo motore sono mostrati in Figura 15. Neuroni individuali del nervo PD sono mostrati con maggiore contrasto utilizzando 4-Di-2-ASP (Figura 16) e CoCl 2 (Figura 17) di recupero informazioni tecniche. Ad alto ingrandimento le terminazioni sensoriali possono essere visti all'interno delle scolopales di supporto (Figure 16B) 21,22,26.
Figura 10. Spostare e tenere a 0 °. I neuroni dinamici sono robusti in cottura durante il movimento e picchi di neuroni sensibili all'elettricità statica sono presenti mentre il comune è tenuto aperto. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita </ A>.
Figura 11. Rapid aperto e chiusura da completamente flessa in posizione estesa (90-0 °). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 12. Extracellulari picchi registrati dal nervo PD. Il giunto è completamente estesa e poi rapidamente spostato in una ½ posizione flessa e poi tenendola ferma. Si noti l'attività durante il movimento e la diminuzione dell'attività quando statica. Clicca qui per ingrandire image.
Figura 13. Le forze relative che si sviluppano con il giunto completamente flesse e stimolati alle varie frequenze. (A) tracce Voltage-time dal trasduttore di forza sono indicati con ogni frequenza di stimolazione. (B) Le tracce nel pannello A si sovrappongono in diversi colori per la facilità di confronto. (C) Tensione in tempo le tracce di attività elettrica registrate dal nervo tensione quando il nervo motore è stato stimolato a 80 Hz. Si noti la struttura regolare di manufatti come stimolo rispetto all'attività neurale. Inoltre, notare le diverse ampiezze delle risposte neurali. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 14. Blu di metilene macchia della preparazione gamba a piedi. Somas individuali vengono mostrati con le loro terminazioni sensoriali proiettando nel filo elastico. Vicino alla apodeme un neurone tensione è mostrato. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 15. Il nervo tensione derivante dalla estremità distale (frecce rosse) e unire il nervo motore (freccia verde). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 16. (A) Un back-riempimento del nervo PD in Cancer magister con 4-Di-2-ASP. (B) Maggiore ingrandimento delle terminazioni sensitive. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 17. I neuroni che sono stati riempiti con CoCl 2 e trattati (A). Contorno Tracciato della preparazione macchiato mostrato (B). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
| Salino | g / L |
| NaCl | 27.29 |
| KCl | 0.81 |
| MgSO 4 • 7H 2 O | 4.81 |
| CaCl 2 • 2H 2 O | 1.85 |
| Na 2 SO 4 • 10H 2 O | 0.97 |
| 1.982 | |
| L'acido HEPES | 0,476 |
| HEPES sale | 2.08 |
| Regolare a pH 8.1 con NaOH o HCl |
Tabella 1. Ricette per granchi salina.
Discussion
Lo scopo di questa serie di esperimenti è 1) insegnare ed esporre i principi fondamentali di registrazioni extracellulari da un organo propriocettiva identificabile e la tensione nervosa e 2) per sottolineare l'importanza della mappatura anatomica in relazione alla funzione fisiologica di particolari sistemi sensoriali. Questo approccio sperimentale e modelli animali utilizzati sono poco costoso e relativamente facile da condurre in laboratori didattici neurofisiologia.
I neuroni di organi cordotonali sono di due tipi funzionali specifici, quelli che rispondono al movimento e coloro che rispondono a posizioni statiche. Registrazioni di cellule singole a partire da una varietà di organi cordotonali, non importa quale viene esaminato congiunta, hanno dimostrato che questo sia il caso di 3,5. Infatti, gli organi cordotonali associati alle articolazioni antennali di aragoste rivelano gli stessi due tipi sensoriali e anatomia di base 27. Oltre a ci siano due tipi di neuroni (movimento e position), i neuroni condividono la stessa disposizione anatomica sui rispettivi fili elastici. Il grande somata trova prossimale sul filamento tendono ad appartenere ai neuroni sensibili movimento dinamico. I neuroni che segnalano posizioni statiche hanno piccole somata e si trovano distale. Queste cellule sono tonico attivo. Il giunto PD contiene solo un singolo organo cordotonali mentre ci sono due organi cordotonali nel carpo-propodus (CP) e merus-carpo (MC) articolazioni.
La dissezione di esporre le strutture propriocettivi in granchi blu (C. sapidus) per la registrazione elettrofisiologica richiede una strategia che permette movimenti articolari che si terrà nelle posizioni naturali, mentre la registrazione da neuroni sensoriali. Il nervo tensione per il muscolo opener nella gamba a piedi è un bellissimo nervo composto da diversi neuroni. A meno che non si fa attenzione, il nervo tensione nonché il nervo motore che innervano il muscolo da stimolare, possono essere danneggiati durante questa dissezione. Perregistrazioni ottimali gli elettrodi di aspirazione devono essere adattati alle dimensioni del nervo. Le registrazioni sono facilmente accessibili in un laboratorio studente utilizzando un microscopio ingrandimento di dissezione 30-40X e micromanipolatori di fascia bassa.
Futuri esperimenti che sarebbe interessante proseguire con gli organi cordotonali comune sarebbe quello di esaminare i profili strutturali e fisiologiche durante la rigenerazione gamba in varie specie nelle diverse fasi del ciclo di vita come un follow-up a un primo studio che ha utilizzato Cancer magister 19,26 . Domande ancora da affrontare sono: 1) non effettua la distribuzione e l'organizzazione dei neuroni artificiali dipendono dall'età dell'animale quando rigenerare un arto, 2) sono le proiezioni assonale al CNS (cordone nervoso ventrale) in un arto rigenerante funzionale o lo fa prendere tempo e l'uso congiunto di stabilire connessioni funzionali, e 3) che cosa accade agli assoni mozzate prossimale al piano autotomy quando l'arto è autotomized? 28
Crostacei conformi alle condizioni ambientali e la loro temperatura circostante, ma non è chiaro come si mantengono coordinamento all'interno di un circuito neurale come neuroni alterano la loro attività in risposta alle variazioni di temperatura. Un basso tasso di cambiamento potrebbe permettere all'animale po 'di tempo per acclimatarsi, mentre un rapido cambiamento può not29, 30. Cambiamenti fisiologici di pH o di osmolarità a causa di metabolismo, il comportamento 31, o l'impatto ambientale, possono presentare problemi simili ai circuiti neurali coinvolti nella propriocezione. Queste preparazioni crostacei sono ideali per affrontare questi tipi di problemi perché la loro funzione è ben caratterizzata a livello di singola cellula.
In questo protocollo abbiamo dimostrato l'importanza fisiologica dei neuroni tensione in forza generata dal muscolo apri monitoraggio. Questi recettori di tensione possono essere ricondotte alla loro posizione all'interno della apodeme utilizzando procedure di colorazione. Questeneuroni, come nei mammiferi, rilevano forza a vari livelli e reclutare neuroni addizionali come la forza aumenta. La frequenza di attività è correlata alla frequenza di stimolazione del motoneurone fino a saturazione in ricezione. Utilizzando un protocollo sgancio rapido con il giunto dactylus flessa, attività tensione sparisce rapidamente, ma poi torna sui riconquistare la tensione in un giunto completamente esteso. Questa è una procedura sperimentale classico per illustrare la forza misurata dai recettori di tensione. Vari neuromodulatori possono essere applicati alla preparazione di vedere come effettua lo sviluppo della forza e della risposta neuronale. Uno degli aspetti importanti è come le risposte neurali vengono elaborati e integrati nel sistema nervoso centrale e loro impatto sull'attività dei neuroni motori. Le tecniche che abbiamo mostrato permettono di iniziare ad affrontare ulteriori informazioni sulla (sensoriale) Funzione circuito neurone nervo motore tensione, cioè il segnale in una gamba intatta al ganglio e ritornoal muscolo.
Le procedure di colorazione sono dimostrati chiave per comprendere la fisiologia dei neuroni sensoriali che innervano organi propriocettivi. Disposizione anatomica dei neuroni in base alla funzione e la dimensione del soma sono simili nei vari organi cordotonali all'interno delle gambe di granchio. Non è noto se accordi neuronali simili si trovano anche in altre specie di insetti o crostacei. Combinando le registrazioni fisiologiche da singole cellule e la mappatura della posizione permette relazioni funzionali struttura diretta. La conservazione a lungo termine del regime anatomica con CoCl 2 colorazione e dal fissaggio permette di fare ripetutamente le misure e valutare la disposizione strutturale.
Propriocezione e ricezione tensione dei muscoli scheletrici sono modalità sensoriali che consentono comportamenti coordinati e risposte ambiente esterno ed interno per animali articolati in una varietà di configurazioni di muscolo scheletricos. L'organo recettore muscolare nell'addome del gambero è un altro preparato ben documentata (vedi il Progetto Crawdad, http://www.crawdad.cornell.edu/ ) a fini didattici di propriocezione con soli due neuroni per addominali emi-segmento 23 . Essere in grado di registrare da singoli neuroni a fasci nervosi sensoriali fornisce ulteriori dettagli che aiuti a comprendere i principi fondamentali della percezione sensoriale. Questi relativamente semplici preparazioni di crostacei permettono di affrontare gli aspetti fondamentali della propriocezione e controllo tensione, con il potenziale per determinare i circuiti neurali che consentono l'integrazione centrale di ingressi propriocettivi e altri sensoriali 9-12, 32, 33.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Gli autori sono grati per i contributi artistici di Hyewon Cooper.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| HEPES acid | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
| HEPES base | Sigma | ||
| D-Glucose | Sigma | G7021 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma | M2643 | |
| Na2SO4•10H2O | Sigma | 246980 | |
| Bouin’s solution fixative | Sigma | HT10-1-32 | Caution: Hazardous material (Special shipping cost required) |
| CoCl2 | Sigma | Caution: Hazardous material. Please follow proper disposal according to local and federal regulations. | |
| Methylene blue chloride | Matheson Co., Inc | Basic Blue 9, C.I. 52015 | |
| 4-Di-2-ASP | Molecular Probes | 4-(4-diethylaminostyryl)-N-methylpyridinium iodide | |
| Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
| Materials | |||
| Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
| Intracellular electrode probe | |||
| Faraday cage | |||
| Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
| Dissecting microscope (100X) | |||
| Fiber optic lamp | |||
| Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
| Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, suction electrodes |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
| Raised preparation stand | |||
| Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
| Computer | Any company | ||
| AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
| PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
| Force transducer | AD Instruments | 0-50g | MLTF050/ST |
| Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
| LabChart7 | AD Instruments | ||
| Electrical leads | Any company | ||
| Glass tools | Make yourself | For manipulating nerves | |
| Cable and connectors | Any company | ||
| Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
| Beakers | Any company | ||
| Wax or modeling clay | Any company or local stores | ||
| Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
| Plastic tip for suction electrode | Local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size |
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