Summary
생리와 해부학 적 기술은 갑각류 도보 사지 관절 proprioceptors과 근육의 긴장 수용체에 대한 기능과 구조를 해결하기 위해 증명된다.
Abstract
이러한 절차의 주요 목적들은 관절의 위치와 움직임을 검출하고, 근육 긴장 될 때 고유 감각에 대해 책임 차 감각 뉴런 리빙 활동을 기록하는 방법을 교육 및 연구 목적으로 입증하는 것이다. 갑각류 proprioceptors 탄력 수용체에서의 전기적 활동을 염기성 신경 생리 학적 계측에 의해 기록되고, 트랜스 듀서는 동시에 운동 신경 자극에 의해 생성되는 힘을 측정하기 위해 사용된다. 또한, 우리는 자신의 해부학 적 배열의 빠른 평가 또는 영구 고정 용 신경 세포를 염색하는 방법을 보여줍니다. 염색은 대부분의 갑각류의 chordotonal 기관의 대표 해부학 적 조직을 보여준다. 고유 감각 반응에 대한 긴장의 신경 반응을 비교하면 이러한 감각 신경이 기능적으로 정의 된 방법과 해부학이 함수에 상관 관계가되는 방법을 결정하는 효과적인 교육 도구입니다. 세 염색 기술연구자 및 강사가 자신의 실험실에 이상적 방법을 선택할 수 있도록 제공됩니다.
Introduction
고유 감각은 조정 된 모터의 동작을 가능하게 사지의 위치와 움직임의 감각이다. Proprioceptors는 위치 (정적) 및 운동 (운동 감각) 수용체로 구성되어 있습니다. 곤충과 갑각류에서 chordotonal 장기 CNS 1에 해당 정보를 제공하는 구조입니다. 모든 chordotonal 기관은 공동에 걸쳐하지만 그들은 여전히 인해 관절에 걸쳐 및 골격 근육과 관절 관절과 공동으로 이동 apodemes (구조 같은 건)에 자신의 첨부 파일 관절의 움직임을 모니터링 할 수 있습니다. 게 다리가 여섯 관절, 하나 또는 두 개의 chordotonal 기관 (2)를 갖는 각이있다. 일반적으로 chordotonal 기관은 탄성 가닥 내에 포함 된 60 ~ 100 이상 감각 신경, 정적 관절의 위치, 방향 및 이동 3-6의 속도로 신호를 신경 세포가 있습니다. 각 관절과 다리에 chordotonal 기관에서 입력은 다음 중앙에서 동물에 의해 조정 움직임을 허용 처리됩니다.
아래에 설명하는 절차는 chordotonal 탄성 가닥 apodeme에서의 위치를 기준으로 수용체의 두 가지 유형을 신경을 분포시키다 신경 세포의 구조 및 기능 분석을 가능하게합니다. 설명하기 위해, 우리는 propodite-dactylopodite (PD) chordotonal 기관, 게 다리 3의 원심 대부분의 세그먼트에 걸쳐있는 기관을 사용합니다.자세한 전기 생리학 연구는 1930 년대에 시작되어 오늘날까지 실시되고 있지만, 몇 가지 측면은 muscles10-16의 조정 컨트롤의 여러 관절과 자신의 역할에 proprioceptors의 분절 연결에 대한 알려져있다. 고유 감각 기관, 근육과 신경계의 구조 - 기능 관계를 구축하는 것은 더 이상이 역할을 정의하는 데 도움이 될 것입니다. 예를 들어, 인 somata과 apodeme에 삽입 긴장 신경의 말단 끝 레이블은 근육 섬유 8,17-21 자신의 상대적인 위치를 보여줄 것입니다.
우리는 연구 또는 학술 실험실에서 사용될 수 갑각류 다리 세 염색 기법을 제시한다. 메틸렌 블루 염색은 근육과 신경에 대한 적절한 대비를 제공하고 학생들이 해부학을 배울 수있는 간단한 기술로 추천합니다. 형광 현미경의 설정이 연구소는 간략하게 신경을 노출하여 더 선택적 신경 세포 염색을 수행 할 수 있습니다중요한 염료 4 - 디 -2 - ASP에 발. 세 번째 대안은 신경 세포를 얼룩 및 수정의 CoCl2 백필이며, 형광 이미징을 필요로하지 않습니다. 그것은 노동과 시간을 많이 사용하지만,이 염색 과정은 채워 신경에 대한 높은 콘트라스트와 특이도를 제공합니다. 함께 이들 기술은 사지 내의 또는 팔다리 사이뿐만 아니라, 다른 갑각류 및 곤충류 20-22 구비 chordotonal 각종 장기를 비교하기 위해 사용될 수있다. 생리 학적 기록에서 해부학 염색에 사용되는 꽃게 (C.의 sapidus)는 모든 미국의 남부 및 남동부 국경 주변에 쉽게 사용할 수 있습니다. 이 종은 대부분의 게에서 발견 chordotonal 긴장 신경 배열의 대표 역할을합니다. 서해안 연구소는이 실험에 대한 훨씬 더 큰 던저 니스 크랩 (암 매지)을 사용하는 것을 선호합니다.
Protocol
1. Propodite-dactylopodite (PD) 신경의 해부 및 녹화 전기 활동
- 뒤에서 갑에 걸쳐 게를 잡고 발톱을 피하고, 집게로 meropodite의 근위 부분을 꼬집어. 다리는 죽음에 출혈 동물을 방지하기 위해 autotomize됩니다. 그들은 오히려 공격적이고 매우 빠르다으로 꽃게를 취급 할 때주의해야합니다.
그림 1. 먼저 게의 다리를 산책. chordotonal 기관 (빗금 친 지역)의 해부학 적 위치는이 도식에 겹쳐있다. 이중 화살표 머리는 어디 PD 신경 실험의 다리를 절개하는 방법을 나타냅니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 . - propodite과 carpodite 사이의 상처를 확인합니다. carpopodite와 t 폐기 그는 (그림 1) meropodite 붙어 있습니다.
- . 깊이 잘라하지 마십시오 # 11 블레이드 (그림 2, 3) 주와 함께 메스와 propodite의 색소 (측면) 측의 표피에있는 큰 창을 잘라.
- 아래의 메스 블레이드를 밀어 큐티클 층을 제거하고 표피에 평행. 이 표피에 부착 된 근육 섬유를 절단한다.
- 같은 기술을 사용하면 pigmentless propodite의 (중간) 측면에 작은 창을 잘라하지만 (소켓 관절 또는 세그먼트 사이에 힌지) 외과를 남겨 첨부 그대로.
그림 2. propodite에 점선을 따라 잘라. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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그림 3. 창에서 신경 (화살표가 신경 다발 개요) 노출. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 . - 아래 준비를 고정하는 게 생리 식염수가 들어있는 실 가드 늘어선 요리를 준비합니다 :. 종의 특정 생리 조리법 표 1을 참조하십시오.
- 조심스럽게 불 연마 유리 바늘을 프로빙하여 PD 기관을 찾습니다. 관절에 걸쳐 탄성 가닥은 외관이있다.
- 힘줄의 양쪽에서 기관의보기를 모호하게 근육 섬유를 제거합니다. PD 기관 또는 신경을 손상하지 않도록주의해야합니다.
- 이것이 달성되면, 단단히 (도 4)를 위로 향하게 (횡) 안료면이 접시를 다시 제조.
그림 4. PD 기관과 신경을 노출. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
- 무료 업하는 신경의 긴 길이 (1.5 cm)를 기록 목적을 위해서는까지 근위 가능한 propodite의 PD 장기 신경을 따르십시오. PD 신경이 여전히 주요 다리 신경에 연결되어있는 동안이 가장 잘 수행됩니다.
- 유리 바늘의 도움으로 주요 다리 신경의 PD 신경을 분리 한 후, 홍채 가위로 근위 PD 신경을 절단 참고 :. 해부 동안 스트레칭이나 신경을 당기지 마십시오.
- 확장 완전히 근육이 수축 위치로 dactylopodite 이동합니다. 극단적 인 굴곡 및 확장 위치가 나중에 사용하기 위해 중간 지점 위치에 대한 메모를 가져 가라.
- 식염수 화장실 내부에 접지선을 놓습니다.
- 전자를 켭니다lectrophysiology 기록 하드웨어 / 소프트웨어 참고 :. 우리의 설정은 이전에 23에 설명되어 있습니다.
- 그것은 현미경의 무대를 내려다되도록 현미경을 배치합니다. 준비 요리가 스테이지에 배치되면, 당신은 최고의 준비를 시각화하는 높은 강도의 조명 빔의 위치를 조정해야합니다.
- 첨부 된 흡입 전극 어셈블리가 식염수 목욕 및 준비에 쉽게 액세스 할 수 있도록 미세 조작기를 놓습니다. 온라인 비디오 (24)에 나타낸 바와 같이 흡입 전극이 구성된다.
- , 신경 활동을 감지 흡입 전극에 PD 신경의 단면을 그립니다.
- 유리 프로브 또는 나무 다보의 도움으로 여러 사이클에 대한 확장과 근육이 수축 위치에 걸쳐 단단 격을 이동합니다.
- 단단 격이 확장 근육이 수축, 중간 위치에 고정 될 때 다음의 활동을 관찰합니다.
2. 긴장에서 전기 활동을 기록포스 세대에게 모니터링 신경 동안
- 다리의 외측과 내측을 결정합니다. 내측은 손톱으로 meropodite 지역에서 조심스럽게 집어 느낄 수있는 부드러운 질감이 있습니다.
- 접시에이 부드러운 표피면을 위로 놓습니다. 오프너 근육을 innervates excitor의 운동 신경도 carpopodite에 들것 근육을 innervates.
- 오프너 근육을 자극하기 위해 carpodite 지역 들것 운동 신경은 격리되어 흡입 전극과 자극. 다리의 기단 부분은 가위를 meropodite에 병행하여 제거된다.
- 안쪽의 손목 지역에있는 표피의 부분 (내측, 그림 5A)를 제거합니다.
- 벤더 근육의 apodeme를 잘라 다리 구멍 밖으로 주요 다리 신경을 당겨하지 않는주의 깊게 근육을 제거합니다 (그림 (b), C는 apodeme가 분리 벤더 화살표를 참고). 주요 다리 신경과 브라NCH는 들것 근육에 다음 (그림 5D) 관찰 할 수있다.
- 들것 근육 (화살표의 그림 5E)의 주요 신경 번들에서 분기 신경을 찾을 수 있습니다.이 주변 근육을 잘라 자극하는 흡입 전극으로 당겨질 수있다 (그림 5 층과 G를, 화살표는 지점을 나타낸다).
- 신경을 곤란하게하지 않고 오프너를 향해 돌출 신경의 한 부분을 애무 해줘. 들것 / 오프너 운동 신경을 절개.
- 흡입 전극에 운동 신경을 당긴 다음을 자극한다.
- 오프너 근육과 긴장의 신경을 노출하는 것은 가까이 근육과 propodite의 복부 지방을 제거합니다. propodite에서 # 11 블레이드 (그림 6)와 함께 메스와 가까운 근육을 잘라 주 :.는 오프너 운동 신경에 손상을 줄 수 있기 때문에 인접 지역에 깊이 잘라하지 마십시오.
그림 5. 오프너 근육을 자극의 운동 신경 세포를 노출 해부 단계. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 6. 이 제거 될 수 있도록 가까운 근육을 노출 propodite의 복부 절반에 표피를 잘라. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 . - 살아있는 뉴런을 유지하기 위해 해부 과정을 통해 신선한 냉각 식염수 식염수를 교환한다. 더 해부, 해부 현미경 준비 접시를 놓고 광섬유 조명을 사용합니다.
- 조심스럽게 그것의 첨부 파일에서 가까운 힘줄을 잘라뾰족한 중간 크기의 가위를 사용하여 단단 격.
- 명확하게 볼 수 있어야 주요 다리 신경에서 오프너 근육에 지점을 방해하지 않도록주의해야합니다.
- 제거하고 가까이 근육과 힘줄을 버린다.
- 해부 핀으로 단단 격에 구멍을 확인합니다. 이 구멍은 텐션 (포스) 변환기에 금속 핀을 연결하기 위해 사용될 것이지만,이 절차의 단계에서이를 확인하는 것이 필요하다.
- 오프너 근육의 말단 지역의 오프너 근육과 apodeme에 프로젝트 신경 분기를 찾습니다. 조심스럽게 불 연마 유리 도구를 사용하여 신경을 조사.
- 운동 신경 다발에 apodeme 진행의 말단부에서 발생하는 긴장의 신경을 준수하십시오.
- 신경 활동을 감지 게 식염수로 흡입 전극을 채우고 전극에 오프너 긴장 신경의 단면을 그립니다. 흡입 전극이 신경에 단단하게 설치되었는지 확인합니다.
- neura에 대한 검사오프너 apodeme에 수동 긴장의 L의 상관 관계. 긴장 신경의 전기적 활동을 기록하는 동안 (즉, 오프너 근육을 스트레칭) 확장 공동으로 급속하게 단단 격을 돌립니다.
- 다음으로, 자극 주파수 관련 테스트 활동력 전개.
- 후크의 끝이 단단 격에있는 작은 구멍을 통해 들어가도록 단단히 금속 걸이를 부착합니다.
- . 힘 센서로 금속 걸이의 다른 쪽 끝을 연결 참고 : 핀이 수직으로 발생하는 힘의 최대 탐지를위한 변환기에되도록 트랜스 듀서는 90 ° 각도마다 있는지 확인합니다.
- 이 오프너 공동의 약 45 ° 각도가되도록 후크와 단단 격을 당깁니다.
- 지금 250 밀리 초, 100 Hz에서 운동 신경을 자극하고 박력뿐만 아니라 인장 신경의 소성 주파수를 측정한다.
- 오프너 근육 섬유가 이완되도록 완전히 확장 된 위치로 관절을 놓습니다.
- 에스250 밀리 초 100 Hz에서 운동 신경을 timulate와 힘뿐만 아니라 긴장의 신경의 발사 주파수를 측정합니다.
- 완전히 (~ 90 °) 근육이 수축되도록 벤드 / 관절을 구부리. 이 위치에서 오프너의 근육 섬유가 완전히 뻗어있다. 때문에 근육의 수동적 스트레칭 변환기에 의해 측정 어떤 힘이있을 수 있습니다.
- 250 msec의 100 Hz에서 운동 신경을 자극하고 박력뿐만 아니라 인장 신경의 소성 주파수를 측정한다.
- 힘을 측정 한 후, 다양한 주파수의 일련의 진행 각 관절 위치에서 80-10 초 동안 20, 40, 60, 80, 및 100 Hz에서.
- 빠른 긴장의 출시와 함께 응답을 측정한다. 힘 센서에 후크가 쉽게 단단 격에서 홀의 압출 될 수 있도록 준비를 준비한다.
- 완전히 (~ 90 °) 근육이 수축되도록 벤드 / 관절을 구부리. 이제 5 초 연속 자극 100 Hz에서 운동 신경을 자극한다.
- 첫 번째 SECON 후긴장 오프너 근육에 구축했다로 D 이하, 단단 격에 구멍의 핀을 밀어.
- 단단 격을 들고 핀의 출시 이전과 이후의 긴장 신경 기록을 검사합니다.
- 그러한 장력 뉴런의 출력을 변경 옥토 파민, 세로토닌 및 proctolin 같은 신경 활성 물질이 조절 성 효과는 노출 오프너 근육 위에 입욕 매체에이 분자를 첨가하고 실험을 반복함으로써 결정될 수있다.
- 피펫을 사용하고 준비에 1 ~ 2 ㎖의 드립.
3. 갑각류에서 염색 말초 신경계의 구조는 다리 산책
- 메틸렌 블루의 기술
- 증류수의 두 부분으로 한 부분 메틸렌 블루 염화 원액 (0.25 %)를 희석.
- 완충 용액의 다섯 부분이 혼합물을 추가합니다. 철저하게 그 지역을 관개.
- 섹션 1의 프로토콜에 따라 다리를 해부하다. 사전을 품어12 ~ 13 ℃에서 메틸렌 블루 용액에 paration
- 준비에게 염색의 진행을 따라 낮은 강도의 조명을 사용하여 해부 현미경으로 매일 10 ~ 15 분을 검사합니다. 염색은 다른 사람에, 시간에 완료 될 경우에 따라서는 하룻밤 걸릴 수 있습니다.
- 4 - 디 -2 - ASP 기법
- 형광 염료는 다시 - 채우기 PD 신경 세포를 직접 화장실에서 준비를 염색하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 형광 얼룩을 볼 수있는 능력을 가진 적당한 현미경이 필요합니다.
- 섹션 1의 프로토콜에 따라 다리를 해부하다.
- 4 - 디 -2 - ASP 용액 10 μM 농도의 제제를 부화하고 15 분 동안 냉장고에 제제를 남긴다. 준비를 충당하기 위해 충분한 솔루션을 사용합니다.
- 빨리 준비를 사진과 수은 빛에 노출을 통해 피하십시오. 이 형광 염료는 비교적 빨리 사라진다.
- 섹션 1의 프로토콜에 따라 PD 신경을 노출하고 차가운 식염수에 담가 보관.
- 의 CoCl2를 개최 젤리 아니라 석유를 확인합니다. 임의의 CoCl2은 생리 욕조에 유출하는 경우 전체 준비는 검은 얼룩하고, 준비는 폐기해야합니다.
- , 폴리스티렌 시트의 작은 컷 미끄러짐 플라스틱 플랫폼을 만들고, 그것을 멀리 float 또는 (도 7) 식염수 욕에 침지되지되도록 수행 그것을 핀.
접시에 장소에서 개최 핀 그림 7. 폴리스티렌 시트. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 . - 일회용 주사기에 고정 벌금 피하 주사 바늘에서 석유 젤리를 추출,다음 신경 폴리스티렌의 슬립의 상단에 걸쳐 드리 워진됩니다 중간에 얕은 "V"를 제외하고 높은 약 1.5 mm이어야한다 장벽 (원형이 잘 작동하지 않을 수 있습니다)합니다.
- "V"근처 장벽의 양쪽에 생리 식염수를 작은 웅덩이를 확인합니다. 늘리거나 끼 신경을 요리에서주의 깊게 신경을 올리고 젤리 아니라 석유의 식염수 웅덩이에 배치되지 않도록주의.
- 신경의 부분이 노출 된 신경을 충당하기 위해 석유 젤리를 꺼내 조심스럽게 건조하지 않도록 신속하게 작업 할 수 있습니다. 지금 식염수 장벽을 테스트하고 확인이 새는되어 있는지 확인합니다.
- 장벽 안쪽에 식염수를 멀리 몰아 내고 목욕 식염수 양측 (그림 8) 서로 격리되어 있는지 확인하기 위해 바셀린의 벽 주위에 높은 경우가 차면 참조하십시오.
- 잘 티슈 종이를 사용하여 식염수 멀리 심지. 용지가 신경을 감싸주는 마십시오.
- 증류수 약간 작은 방울을 이용하여 새로운 웅덩이를 확인한 후 신경 말단을 잘라. 컷을 할 때 장벽을 통해 신경을 당겨지지 않도록주의하십시오. 증류수의 삼투압 충격 것 "풍선"축삭.
- 30 초 이내, 물에의 CoCl2의 작은 방울을 추가하고이 액을 흡수하고 신경이 단축 섹션 (그림 9)에 웅덩이를 형성 할만큼의 CoCl2를 추가합니다. 준비는 최고 12 ~ 24 시간 동안 13 ° C에서 냉장 보관됩니다.
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그림 9. 컷 PD 신경이의 CoCl2에 노출된다. 절단 된 신경은 신경 세포체에 축삭을 통해 염료 분자의 이동을 용이하게하고 가속화 물의 존재에 오릅니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 . - 가습 웅덩이를 제거합니다. 조직을 사용하여 코발트 솔루션을 멀리 몰아 내고 식염수 몇 가지 변경 사항과 코발트의 흔적을 씻어.
- 게 식염수의 약 10 ㎖가 들어있는 작은 유리 페트리 접시에 고립 된 준비를 전송합니다. 뉴런은 세척 및 다음 단계는 인 시츄로 수행된다. 기대 금속 툴이 단계 후에 제제를 (만약 생리학 나중에 사용할 수없는 특정 도구를 사용한다)를 처리하는 데 사용되어서는 안된다.
- (황화 암모늄 1 ~ 2 방울을 추가 NH4) 생리 식염수에 2 S. 단단히 (NH 4) 2 S 병 캡을 다시 후드에 배치합니다. 해부 현미경 제조에서 반응을 관찰
- 1 ~ 2 분 이내에, 코발트 가득 뉴런과 그 프로세스는 검은 얼룩 때문에 나타나기 시작한다.
- 5 ~ 10 분 후, 신선한 식염수 개발 솔루션을 교체합니다.
- 당신은 싱크대 배수구에 부어 한 개발 솔루션이 몇 분 동안이나 뚜껑이있는 폐기물 병에 수돗물을 실행하여 다음 않았는지 확인합니다.
- 식염수를 붓고 Bouin의의 솔루션 정착의 두 가지 변경 사항과 약 15 분 동안 신경 준비를 고정합니다. 오프너 근육 같은 큰 조직의 경우 (긴장 뉴런을 염색하기 위해), 30 분에 고정의 지속 시간을 증가시킨다.
- 70 % (즉, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %)에서 시작하여 에탄올 농도의 오름차순으로 직렬로 탈수. 각각의 농도에서 약 10 분에 충분하다작은 조직.
- 100 % 에탄올 두 가지 변경에 대해 10 ~ 15 분 후, 100 % 메틸 살리 실 레이트와 에탄올을 대체하여 조직을 취소합니다. 준비는 반복 시청을 위해 영구적으로이 솔루션에 남아있을 것입니다. 주변 조직이 명확하게 될 것입니다 때문에 시간 채워진 세포는 더 명백해질 것이다. 강화 방법은 25 시간 동안 페이딩 방지하기 위해 사용될 수있다.
- 의 CoCl2와 긴장의 신경을 채우기 위해 동일한 프로세스를 사용합니다. 그러나 각 에탄올 탈수 공정에서 에탄올 용액을 여러 번 변경하고 철저하게 근육을 탈수하고 잘 취소 할 수 있도록 각 단계에 약 20 분 동안 알코올 내부 준비를 품어.
Representative Results
PD 기관이 완전히 공동을 확장하여 연신 될 때, PD 신경의 활동이 개방 위치에 여전히 유지된다. 일부 활성이 남아도 10에서 첫 번째에 대해 도시 된 바와 같이 이동중 견고하다. 이 활동은 정적 위치에 민감한 뉴런 (그림 10의 기록 하반기)에서이다. 운동 변위 동안 응답을 끝 및 소성은 (그림 11) chordotonal 물가의 스트레칭 동안 주로 존재한다.
스파이크의 추가 분석은 쉽게 상대 진폭을 분류하여 접근 할 수 있습니다. 이 위치 나 움직임을 5 종류의 보충되는 감각 신경의 다른 인구를 보여줄 수있는 방법입니다. 전형적인 진폭 0.25-1.5 MV 범위 만이 값은 흡입 전극 씰 저항 (즉 기밀성)에 의존한다. T는 스파이크의 주파수그는 다양한 크기 범위는 또한 그래픽 분석 표현 될 수있다.
자극 주파수에 대하여 오프너 근육에 의해 생성 된 힘은 (도 13A 및 B) 서로의 상단에 각각 전압 - 시간 자취를 중첩하여 비교 될 수있다. 이것은 또한 각각의 관련 자극 주파수에서 각 관절 위치를 위해 수행 될 수있다. 인장 신경의 활동 각 자극 주파수에서 발생 상대적인 힘의 크기와 상관하고, 각 관절의 위치 일 수있다. PD 신경에서와 같이, 스파이크 진폭의 다양한 오프너 근육 (그림 13C)의 수축에 대한 응답으로 볼 수 있습니다.
걷는 다리 신경의 해부학 적 배열은 명확 메틸렌 블루 염색 (그림 14)로 관찰된다. apodeme에 가까운 탄성 chordotonal 가닥과 긴장 신경을합니다. 직경이 다른 여러 가지 인 somataD 특정 위치는이 그림도 볼 수 있습니다. 긴장의 신경과 들것 운동 신경의 전체 과정은 그림 15에 표시됩니다. PD 신경의 개별 뉴런은 4 - 디 -2 - ASP (그림 16)과의 CoCl2 (그림 17) 기술을 채워서 사용하여 높은 콘트라스트와 함께 표시됩니다. 높은 배율 감각 엔딩지지 scolopales (그림 16B) 21,22,26의 내부를 볼 수 있습니다.
그림 10. 이동 및 0 °에서 개최. 동적 뉴런은 운동을하는 동안 소성 견고하고 관절이 열려 유지하면서 정전기에 민감한 뉴런의 스파이크가 존재한다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭 </>.
그림 11. 빠른 개방과 완전히 확장 (90-0 °) 위치로 근육이 수축 마감이. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
PD 신경에서 기록 그림 12. 세포 외 스파이크. 관절은 완전히 확장하고 빠르게 ½ 이동 위치를 근육이 수축하고 여전히 유지된다. 이동하는 동안의 활동을 주목하고 때 정적 인 활동을 감소. 큰 IMA를 보려면 여기를 클릭하십시오GE.
그림 13. 공동으로 개발하는 상대 세력이 완전히 근육이 수축과 다양한 주파수에 자극. (A) 힘 센서에서 전압과 시간의 흔적이 각각의 자극 주파수로 표시됩니다. (B) 패널의 추적은 비교의 편의를 위해 다른 색으로 겹쳐있다. (C) 전압과 시간의 운동 신경이 80 Hz에서 자극 할 때 긴장의 신경에서 기록 된 전기 활동의 흔적. 신경 활동에 비해 자극 유물의 규칙적인 패턴을합니다. 또한, 신경 반응의 다양한 진폭을 확인합니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
걷는 다리의 준비 14. 메틸렌 블루 염색 그림. 개인 somas은 자신의 감각 엔딩 탄성 가닥으로 돌출 함께 표시됩니다. 긴장의 신경 세포가 표시되는 apodeme 부근에 있습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 15. 선단 (빨간색 화살표)에서 발생하여 운동 신경 (녹색 화살표)를 결합 긴장 신경. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
4 - 디 -2 - ASP와 암 마법 학자의 PD 신경의 그림 16. (A) 다시 채우기. (B) 감각 엔딩의 높은 배율. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 17. CoCl2를 가득 및 처리 된 뉴런 (A). 도시 스테인드 준비 추적 개요 (B). 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
| 식염 | G / L |
| 염화나트륨 | 27.29 |
| 의 KCl | 0.81 |
| 망초 • 7H 2 O | 4.81 |
| 염화칼슘 2 • 2H 2 O | 1.85 |
| 나 2 SO 4 • 10 H 2 O | 0.97 |
| 1.982 | |
| HEPES 산 | 0.476 |
| HEPES 소금 | 2.08 |
| 수산화 나트륨 또는 염산으로 pH 8.1로 조정 |
표 1. 게 식염수를위한 조리법.
Discussion
실험이 세트의 목적은 1) 가르치고 전시 세포 레코딩의 기본 원칙을 식별 고유 감각 기관과 긴장의 신경에서, 2) 특정 감각 시스템의 생리 기능과 관련하여 해부학 적 맵핑의 중요성을 강조하는 것입니다. 활용이 실험 방법 및 동물 모델은 저렴하고 신경 생리학 교육 연구소에서 수행하기가 비교적 쉽다.
chordotonal 기관의 신경 세포는 두 가지 특정 기능 유형, 움직임에 반응하는 그 정적 위치에 응답하는 중입니다. chordotonal 기관의 다양한에서 단일 세포 기록은 상관없이 관절이 조사되는,이 경우 3,5 것으로 나타 없다. 실제로, 바다 가재의 더듬이 관절과 관련된 chordotonal 기관은 동일한 두 개의 감각 유형 및 기본 해부학 (27)를 알 수있다. 이 두 신경 세포 유형 (운동과 positi의 것 외에도)에, 신경 세포는 각각의 탄성 스트랜드에 동일한 해부학 적 배열을 공유 할 수 있습니다. 물가에 근접하게 위치한 대형 인 somata 동적 움직임에 민감한 뉴런에 속하는 경향이있다. 정적 위치 신호를 뉴런은 작은 인 somata을 가지고 원심 있습니다. 이 세포는 tonically 활성화됩니다. 손목 - propodus (CP) 및 merus - 손목 (MC) 관절 두 chordotonal 기관이 있지만 PD 관절은 하나의 chordotonal 기관이 포함되어 있습니다.
전기 생리학 녹음 꽃게 (C.의 sapidus)에서 고유 감각 구조를 노출 해부 감각 뉴런에서 기록하는 동안 관절의 움직임이 자연의 위치에 자리를 대신 할 수있는 전략이 필요합니다. 걷는 다리 오프너 근육의 긴장 신경은 여러 신경 세포로 구성된 매우 미세한 신경이다. 주의를 취하지 않으면, 인장 신경뿐만 아니라 운동 신경을 자극하는 근육을 지배하는,이 절개 중에 손상 될 수있다. 에최적의 기록은 흡입 전극 신경의 크기에 맞게 조정해야한다. 녹음은 30 40 배 배율의 해부 현미경 및 로우 엔드 미세 조작기를 이용하여 학생의 실험실에서 쉽게 액세스 할 수 있습니다.
공동 chordotonal 기관으로 추구하는 흥미로운 일이 될 것이다 미래의 실험은 라이프 사이클의 다른 단계에서 다양한 종류의 다리를 재생하는 동안 구조 및 생리 학적 프로파일을 검사하는 것입니다 암 매지 19, 26을 사용하는 초기 연구에 따르 . 사지를 재생 할 때 해결해야 나머지 질문) 1 수 있습니다 재생 신경의 분포와 조직은 동물의 나이에 따라 달라 않고, 2) 기능 회생 가지의 CNS (복부 신경 코드)의 축삭 돌기 또는 그것을 수행 사지가 autot 때 기능적인 연결을 설정하는 시간과 공동 이용을, 3) 무엇 autotomy면에 인접 절단 축색 돌기에 발생omized? 28
갑각류는 환경 조건과 그 주위 온도에 부합하지만, 뉴런의 온도 변화에 대한 응답으로 자신의 활성을 변경 한대로 신경 회로 내에서 조정을 유지하는 방법 불분명하다. 급격한 변화는, 30 not29 수있는 반면 변화의 느린 속도는 동물에게 적응을위한 시간을 허용 할 수 있습니다. 때문에 신진 대사, 행동 31, 또는 환경에 미치는 영향에 산도 또는 삼투압의 생리적 변화는 고유 감각에 관련된 신경 회로와 유사한 과제를 제시 할 수있다. 이 갑각류 준비는 기능이 아니라 단일 세포 수준에서 특징이 있기 때문에 이러한 유형의 문제를 해결하기에 이상적이다.
이 프로토콜에서 우리는 오프너 근육에 의해 생성 된 힘을 모니터링 긴장의 신경 세포의 생리적 중요성을 증명하고있다. 이러한 장력 수용체 염색 절차를 사용하여 apodeme 내의 그들의 위치를 추적 할 수있다. 이들뉴런은 포유 동물에서와 같이, 다양한 수준의 힘을 감지하는 힘이 증가함에 따라 부가적인 뉴런 모집. 화물이 포화에 도달 할 때까지 활성이 주파수는 운동 신경의 자극 주파수에 관한 것이다. 근육이 수축 dactylus 조인트 퀵 릴리스 프로토콜을 사용하여, 긴장 활동은 빠르게 사라집니다하지만 완전히 확장 관절에 긴장을 되찾기에 반환합니다. 이 긴장 수용체에 의해 측정 된 힘을 설명하는 고전적인 실험 절차입니다. 각종 neuromodulators는 힘과 신경 반응의 발달을 초래하는 방식을 볼 준비하는데 적용될 수있다. 중요한 측면 중 하나는 신경 응답 처리 및 중추 신경계 및 운동 뉴런의 활성에 미치는 영향에 통합되는 방식이다. 우리가 보여준 기술은 하나가 다시 긴장 (감각) 신경 모터 신경 회로 기능, 신경절에 그대로 다리 즉, 신호에 대한 자세한 정보를 해결하기 시작할 수근육.
시연 염색 절차는 고유 감각 기관을 신경을 분포시키다 감각 신경의 생리를 이해하는 열쇠입니다. 기능과 소마의 크기에 따라 신경의 해부학 적 배열은 게의 다리 내에서 다양한 chordotonal 기관에서 유사하다. 유사한 신경 세포의 배열이 다른 갑각류 종이나 곤충에서 발견되는 경우는 알려져 있지 않다. 하나의 세포 생리 학적 기록을 결합하고 위치를 매핑하는 직접 구조 함수 관계를 할 수 있습니다. CoCl2를 염색하고 고정과 해부학 적 배열의 장기 보존이 하나가 반복적으로 측정을하고 구조적 배열을 평가할 수 있습니다.
고유 감각 및 골격근 긴장 리셉션은 골격근 구성의 다양한 관절 동물 협조 동작 및 내부 및 외부 환경에 대한 반응을 활성화 감각 양식 아르의. , 왕새우 복부 근육 수용체 기관은 다른 잘 문서화 준비 (Crawdad를 프로젝트를 볼 수 있습니다 http://www.crawdad.cornell.edu/ 복부 헤미 세그먼트 (23) 당 두 개의 뉴런과 고유 감각의 교육 목적을 위해) . 감각 신경 다발에 하나의 뉴런에서 기록 할 수있는 것은 자세한 내용에게 감각 운영의 기본 원칙을 이해하는 도움을 제공합니다. 이러한 비교적 간단 갑각류 준비 하나는 고유 감각과 다른 감각 입력 9-12, 32, 33의 중앙 통합을 가능하게하는 신경 회로를 결정하는 잠재력을 지닌, 고유 감각과 긴장 모니터링의 근본적인 측면을 해결 할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 혜원 쿠퍼의 예술 공헌에 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| HEPES acid | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
| HEPES base | Sigma | ||
| D-Glucose | Sigma | G7021 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma | M2643 | |
| Na2SO4•10H2O | Sigma | 246980 | |
| Bouin’s solution fixative | Sigma | HT10-1-32 | Caution: Hazardous material (Special shipping cost required) |
| CoCl2 | Sigma | Caution: Hazardous material. Please follow proper disposal according to local and federal regulations. | |
| Methylene blue chloride | Matheson Co., Inc | Basic Blue 9, C.I. 52015 | |
| 4-Di-2-ASP | Molecular Probes | 4-(4-diethylaminostyryl)-N-methylpyridinium iodide | |
| Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
| Materials | |||
| Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
| Intracellular electrode probe | |||
| Faraday cage | |||
| Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
| Dissecting microscope (100X) | |||
| Fiber optic lamp | |||
| Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
| Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, suction electrodes |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
| Raised preparation stand | |||
| Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
| Computer | Any company | ||
| AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
| PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
| Force transducer | AD Instruments | 0-50g | MLTF050/ST |
| Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
| LabChart7 | AD Instruments | ||
| Electrical leads | Any company | ||
| Glass tools | Make yourself | For manipulating nerves | |
| Cable and connectors | Any company | ||
| Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
| Beakers | Any company | ||
| Wax or modeling clay | Any company or local stores | ||
| Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
| Plastic tip for suction electrode | Local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size |
References
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