Fysiologiske og anatomiske teknikker er demonstreret at løse funktion og struktur for fælles proprioceptors og muskelspændinger receptorer i krebsdyr walking lemmer.
Det primære formål med disse procedurer er at demonstrere for undervisnings-og forskningsformål hvordan du optager aktiviteten af levende primære sensoriske neuroner, der er ansvarlige for proprioception, da de er at opdage fælles position og bevægelse, og muskelspændinger. Elektrisk aktivitet fra krebsdyr proprioceptorer og spændingshovedpine receptorer registreres ved basisk neurofysiologiske instrumentering, og en transducer bruges til samtidig kraft, der er genereret ved at stimulere en motor nerve. Derudover viser vi, hvordan pletten neuronerne for en hurtig vurdering af deres anatomiske arrangement eller til permanent fiksering. Farvning afslører anatomiske organisation, der er repræsentativ for chordotonal organer i de fleste krebsdyr. Sammenligning af spænding nerve reaktioner på de proprioceptive responser er et effektivt pædagogisk redskab til at bestemme, hvordan disse sensoriske neuroner er defineret funktionelt, og hvordan anatomien er korreleret til funktionen. Tre farvningsteknikkerpræsenteres tillader forskere og undervisere til at vælge en metode, der er ideel til deres laboratorium.
Proprioception er den fornemmelse af lemmer position og bevægelse, der giver mulighed for en koordineret motorisk adfærd. Proprioceptors består af position (statisk) og bevægelse (kinæstetiske) receptorer. I insekter og krebsdyr, chordotonal organer er de strukturer, der giver disse oplysninger til CNS 1.. Ikke alle chordotonal organer spænder over en fælles, men de kan stadig overvåge fælles bevægelser på grund af deres tilknytning til de apodemes (senen lignende strukturer), som spænder over fælles og flytte i samarbejde med skeletmuskulatur og fælles artikulation. Krabbeben har seks samlinger, der hver har en eller to chordotonal organer 2. Typisk en chordotonal organ har 60-100 eller flere sensoriske neuroner indlejret i et elastisk streng, neuroner, der signalerer statisk fælles position, retning og hastighed bevægelse 3-6. Inputtet fra chordotonal organer ved hver samling og ben er så centralt behandles tillader koordinerede bevægelser af dyret.
<p class="jove_content"> De kræfter, som benmusklerne producerer i løbet af isometrisk og isotoniske kontraktioner detekteres af spændinger receptorer er forbundet med muskelfibre og deres vedhæftede filer til apodemes7-9. I de krebsdyr walking ben protokoller, der følger vi præsenterer metode til optagelser fra primære sensoriske neuroner, der overvåger proprioception og neuroner, der reagerer på kræfter, der genereres af muskelfibre. En teknik til aktivering benbevægelser og kvantificere force generation er også præsenteret, samt anatomiske teknikker, der kan anvendes til at karakterisere arrangementet af disse perifere nervesystem.Procedurerne demonstreret nedenfor muliggøre strukturelle og funktionelle analyse af de neuroner, der innerverer begge typer af receptorer i forhold til deres placering på en chordotonal elastisk streng og apodeme. For at illustrere, bruger vi propodite-dactylopodite (PD) chordotonal orgel, orglet, der spænder over mest distale segment af krabbe ben 3.Selvom detaljerede elektrofysiologiske undersøgelser begyndte i 1930'erne og er stadig ved at blive gennemført i dag, har nogle aspekter blevet kendt om de segmenter forbindelser proprioceptors i de forskellige led og deres roller i koordineret kontrol af muscles10-16. Etablering af struktur-funktion forholdet mellem de proprioceptive organer, muskler og nervesystemet vil yderligere hjælpe med at definere disse roller. For eksempel vil mærkning af somata og distale endelser spændinger neuroner indsat i apodeme afsløre deres placering i forhold til muskelfibre 8,17-21.
Vi præsenterer tre farvningsteknikker for krebsdyrssygdomme ben, der kan bruges i forskning eller akademiske laboratorier. Methylenblåt farvning giver passende kontrast til muskler og nerver, og anbefales som en simpel teknik for studerende at lære anatomi. Labs, der har fluorescens mikroskopi opsætninger kan udrette mere selektiv neuronal farvning ved kortvarigt at udsætte nerves til den vitale farvestof 4-di-2-ASP. Det tredje alternativ er CoCI2 opfyldning, der farver og løser neuroner, og kræver ikke fluorescensimagografi. Selv om det er arbejds-og tidskrævende, denne farvning proces giver høj kontrast og specificitet for de nerver, der er fyldt. Sammen disse teknikker kan bruges til at sammenligne forskellige chordotonal organer, ikke kun inden for et lem eller mellem benene, men også blandt andre krebsdyr og insektarter 20-22. Blå krabber (C. sapidus), der anvendes i fysiologiske optagelser og anatomiske farvning er let tilgængelige over hele det sydlige og sydøstlige grænse i USA. Denne art fungerer som en repræsentant for de chordotonal og spænding nerve ordninger findes i de fleste krabber. Laboratorier på vestkysten vil foretrække at bruge den meget større Dungeness krabber (Cancer magister) for disse eksperimenter.
Formålet med dette sæt af eksperimenter er 1) at undervise og udstille de grundlæggende principper for ekstracellulære optagelser fra en identificerbar proprioceptive orgel og spænding nerve og 2) at understrege betydningen af anatomisk kortlægning i forhold til fysiologiske funktion af bestemte sansesystemer. Denne eksperimenterende tilgang og dyremodeller udnyttet er billig og forholdsvis let at gennemføre i neurofysiologi undervisningslaboratorierne.
Neuronerne i chordotonal organer er af to specifikke funktionelle typer, dem, der reagerer på bevægelse og dem, der reagerer statiske positioner. Encellede optagelser fra en række chordotonal organer, uanset hvilken fælles undersøges, har vist, at dette er tilfældet 3,5. Faktisk chordotonal organer er forbundet med de antennal leddene af hummere afslører de samme to sensoriske typer og grundlæggende anatomi 27. Ud over at der er to neuron typer (bevægelses-og posion), neuroner deler den samme anatomiske arrangement på deres respektive elastiske tråde. Den store somata placeret proksimalt på strengen har tendens til at tilhøre de dynamiske bevægelse følsomme neuroner. Neuroner der signalerer statiske positioner har små somata og er placeret distalt. Disse celler er tonisk aktive. PD fælles indeholder kun en enkelt chordotonal orgel, mens der er to chordotonal organer i håndroden-propodus (CP) og Merus-håndroden (MC) leddene.
Dissektion at eksponere proprioceptive strukturer i blå krabber (C. sapidus) for elektrofysiologiske optagelse kræver en strategi, der giver mulighed for fælles bevægelser til at finde sted i de naturlige positioner, mens du optager fra sensoriske neuroner. Spændingen nerver åbneren muskel i walking ben er en meget fin nerve består af flere neuroner. Medmindre omhu, spændingen nerve samt motorisk nerve, som innerverer musklen skal stimuleres, kan blive beskadiget under denne dissektion. Foroptimale optagelser af sugeelektroder skal tilpasses til størrelsen af nerve. Optagelser er let tilgængelige i en studerendes laboratorium ved hjælp af en 30-40X forstørrelse dissektionsmikroskop og low-end mikromanipulatorer.
Fremtidige eksperimenter, der ville være interessant at forfølge de fælles chordotonal organer ville være at undersøge de strukturelle og fysiologiske profiler under ben regenerering i forskellige arter på forskellige stadier i livscyklussen som en opfølgning på en indledende undersøgelse, der brugte Cancer magister 19,26 . Spørgsmål resterende skal behandles, er 1) ikke distribution og organisering af regenererede neuroner afhænger af alder af dyret, når regenerere en lem, 2) er de axonale fremskrivninger til CNS (ventrale nerve ledning) i en regenererende lemmer funktionel eller gør det tage tid og fælles brug for at etablere funktionelle sammenhænge, og 3) hvad der sker med de afhuggede axoner proksimalt for autotomy plan, når benet er autotomized? 28
Krebsdyr i overensstemmelse med miljømæssige forhold og deres omgivende temperatur, men det er uklart, hvordan de opretholde koordinering inden en neurale kredsløb som neuroner ændre deres aktivitet som reaktion på temperaturændringer. En langsom ændring kan give dyret mulighed for lidt tid til akklimatisering mens en hurtig ændring kan not29 30. Fysiologiske ændringer i pH eller osmolaritet på grund af stofskiftet, adfærd 31 eller miljøbelastningen kan frembyde lignende udfordringer til neurale kredsløb, der er involveret i proprioception. Disse krebsdyr præparater er ideelle til at løse disse typer af problemer, fordi deres funktion er godt karakteriseret ved en enkelt celle niveau.
I denne protokol har vi vist den fysiologiske betydning af spænding neuroner i overvågningen kraft genereret af åbneren musklen. Disse spændinger receptorer kan spores til deres placering i apodeme ved hjælp farvningsprocedurer. Disseneuroner, som i pattedyr, opdage kraft på forskellige niveauer og rekruttere yderligere neuroner som den kraft stiger. Frekvensen i aktivitet er relateret til stimulering hyppigheden af motorneuroner til mætning i modtagelse er nået. Ved hjælp af en hurtig release protokol med bøjet dactylus fælles, spænding aktivitet forsvinder hurtigt, men derefter vender tilbage efter at genvinde spændinger i en fuldt udstrakt joint. Dette er en klassisk eksperimentelle procedure til at illustrere den kraft målt ved spændinger receptorer. Forskellige neuromodulatorer kan anvendes til forberedelse til at se, hvordan det påvirker udviklingen af kraft og neuronal respons. Et af de vigtige aspekter er, hvordan de neurale reaktioner behandles og integreres i det centrale nervesystem og deres indvirkning på aktiviteten af motoriske neuroner. De teknikker, vi har vist, at man kan begynde at behandle mere information om spændingen (sensorisk) nerve-motor neuron kredsløb funktion, dvs signal i en intakt benet til ganglion og tilbagetil musklen.
De farvningsprocedurer demonstreret er nøglen til at forstå fysiologi sensoriske neuroner, der innerverer proprioceptive organer. Anatomisk placering af neuroner baseret på funktion og størrelsen af soma er ens i de forskellige chordotonal organer i Krabbe ben. Det vides ikke, om lignende neuronale arrangementer også findes i andre krebsdyr arter eller insekter. Ved at kombinere fysiologiske optagelser fra enkelte celler og kortlægge placering giver direkte struktur funktion forhold. Den langsigtede bevaring af den anatomiske arrangement med CoCI2 farvning og fiksering tillader en at gentagne gøre foranstaltninger og vurdere strukturelle arrangement.
Proprioception og spænding modtagelse af skeletmuskulatur er sensoriske modaliteter, der muliggør koordinerede adfærd og reaktioner på eksterne og interne miljø for leddelte dyr i en bred vifte af skeletmuskulatur konfigurationsek. Musklen receptor orgel i maven af krebs er en anden veldokumenteret præparat (se Crawdad projektet; http://www.crawdad.cornell.edu/ ) til undervisningsbrug af proprioception med kun to neuroner pr abdominal hemi-segment 23. . At være i stand til at optage fra enkelte neuroner til sensoriske nerve bundter giver yderligere oplysninger, at støtte i at forstå de grundlæggende principper for sensorisk modtagelse. Disse relativt simple krebsdyr forberedelser tillader en at løse fundamentale aspekter af proprioception og spænding overvågning, med potentiale til at bestemme de neurale kredsløb, der muliggør central integration af proprioceptive og andre sensoriske inputs 9-12, 32, 33.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne er taknemmelige for de kunstneriske bidrag Hyewon Cooper.
Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
HEPES acid | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
HEPES base | Sigma | ||
D-Glucose | Sigma | G7021 | |
MgSO4•7H2O | Sigma | M2643 | |
Na2SO4•10H2O | Sigma | 246980 | |
Bouin’s solution fixative | Sigma | HT10-1-32 | Caution: Hazardous material (Special shipping cost required) |
CoCl2 | Sigma | Caution: Hazardous material. Please follow proper disposal according to local and federal regulations. | |
Methylene blue chloride | Matheson Co., Inc | Basic Blue 9, C.I. 52015 | |
4-Di-2-ASP | Molecular Probes | 4-(4-diethylaminostyryl)-N-methylpyridinium iodide | |
Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
Materials | |||
Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
Intracellular electrode probe | |||
Faraday cage | |||
Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
Dissecting microscope (100X) | |||
Fiber optic lamp | |||
Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, suction electrodes |
Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
Raised preparation stand | |||
Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
Computer | Any company | ||
AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
Force transducer | AD Instruments | 0-50g | MLTF050/ST |
Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
LabChart7 | AD Instruments | ||
Electrical leads | Any company | ||
Glass tools | Make yourself | For manipulating nerves | |
Cable and connectors | Any company | ||
Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
Beakers | Any company | ||
Wax or modeling clay | Any company or local stores | ||
Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
Plastic tip for suction electrode | Local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size |