Summary
تسليم خلية داخل عضلة القلب في نماذج الفئران من أمراض القلب والأوعية الدموية، مثل ارتفاع ضغط الدم أو احتشاء عضلة القلب، ويستخدم على نطاق واسع لاختبار الإمكانات العلاجية من أنواع مختلفة من الخلايا في الدراسات التجدد. ولذلك، فإن وصفا مفصلا وتصورا واضحا لهذا الإجراء الجراحي يساعد على تحديد حدود ومزايا خلية التحليلات العلاجية القلب والأوعية الدموية في القوارض الصغيرة.
Abstract
وأظهرت دراسات سابقة أن تسليم خلية يعزز تحسين وظيفة القلب عن طريق الإفراج عن السيتوكينات والعوامل التي تزيد من عودة التوعي أنسجة القلب وبقاء الخلية. بالإضافة إلى ذلك، كشفت المزيد من الملاحظات أن الخلايا الجذعية محددة، مثل الخلايا الجذعية القلبية، الخلايا الجذعية الوسيطة وcardiospheres لديهم القدرة على الاندماج داخل عضلة القلب المحيطة عن طريق التفريق في العضلية، خلايا العضلات الملساء والخلايا البطانية.
هنا، نقدم المواد والأساليب لتقديم موثوق الخلايا noncontractile في جدار البطين الأيسر من الفئران immunodepleted. الخطوات البارزة لهذا الإجراء المجهرية تشمل التخدير وحقن تسكين، داخل الرغامى التنبيب، شق لفتح الصدر وكشف القلب والتسليم من الخلايا العقيمة عيار 30 إبرة وحقنة الدقة ميكروليتر.
معالجة الأنسجة التي تتكون من حصاد القلب، embeddiنانوغرام، باجتزاء وأظهرت تلطيخ النسيجية أن حقن الخلايا داخل عضلة القلب أنتج الضرر صغيرة في منطقة النخابية، وكذلك في جدار البطين. تم الإبقاء على الخلايا Noncontractile في جدار عضلة القلب لدى الفئران المناعة وكانت محاطة بطبقة من الأنسجة متليفة، من المحتمل للحماية من الضغط القلب وتحميل الميكانيكية.
Introduction
وقد تم اختبار مختلف البروتوكولات تسليم خلية في الفئران والجرذان نماذج من أمراض القلب والشرايين وذلك بهدف ترجمة كفاءة وفعالية وسلامة هذا الإجراء التجريبي في المرضى من البشر. في قلوب القوارض الصغيرة، والتسليم خلية داخل عضلة القلب هو الأسلوب الأكثر جدوى من تسليم خلية 1،2، في حين أنه في تقدمي الفئران القلب 3 و 4 إلى الوراء خلية داخل التاجي التسريب يمكن أن تستخدم أيضا. كلتا الطريقتين لها حدود ومزايا. تسليم الخليوي عبر الطريق داخل التاجي مزاياه النظرية على الحقن العضلي المباشر في تعزيز نشر خلية العالمية 3، ولكن كما أن لديها خطر التسبب في انسداد الشريان التاجي 3،5. وترتبط القيود على تسليم داخل عضلة القلب مع اصابة الميكانيكية، والتهاب حاد، وعضلة القلب الضرر 6،7. في البشر، يتم تسليم خلايا لإصلاح القلب عن طريق الحقن داخل عضلة القلب من خلال النخابية الشغاف أو الجراحيالاقتراب أو الطريق الشرياني داخل التاجي 8. هي مناسبة حقن عبر طرق transvascular في المرضى الذين يعانون من احتشاء عضلة القلب الحاد وإشباعها، ولكن قد لا يكون ممكنا في حالة انسداد أو مجموع ضعف تدفق داخل الأوعية من أراضي تنفذ 9. الحقن المباشر في جدار البطين عن طريق الحقن أو transendocardial transepicardial مجدية تقنيا تبعا لحالة المريض الصحية. في الواقع، وقد تبين أن هذه التقنية آمنة 10،11، على الرغم من حقن transepicardial عملية جراحية مفتوحة الصدر ضروري وللtransendocardial نهج مخطط الكهربية لكل مريض مطلوب للتمييز مواقع قابلة للحياة الدماغية أو شوه عضلة القلب 9.
الأهم من ذلك، في الدراسات العلاج بالخلايا اختيار أفضل الخلية المراد زرعها لا يزال قيد التحقيق. وأظهرت التحليلات على المدى القصير (4 أسابيع) أن حقن الخلايا الجذعية في القلب يعرف بأنه cardiospheres
في الماوس والفئران نماذج، كشفت دراسات طويلة الأجل التي حقن الخلايا لم مواصلة تحسين وظيفة القلب (12 شهرا). في الواقع، تم عزل ترقيع الخلايا العضلية الجنينية الجذعية البشرية المستمدة من الخلايا (HESC-CM) إلى حد كبير من عضلة القلب المضيف طبقة من الأنسجة متليفة 22،23. وقد لوحظت نتائج مماثلة بعد زرع داخل عضلة القلب والهيكل العظمي من myoblasts في قلب الفئران احتشاء 24. Furthermoإعادة، والقدرة على المدى الطويل من اللجان الدائمة خيفي للحفاظ على وظيفة في قلب احتشاء كان محدودا بسبب الانتقال من immunoprivileged إلى حالة مناعة بعد التمايز 25.
مع الأخذ بعين الاعتبار التحديات والآفاق المذكورة أعلاه، وتبين لنا هنا كيفية إيصال الخلايا عن طريق الحقن داخل عضلة القلب في الفئران. نلاحظ أن الخلايا دون cardiomyocyte خصائص مقلص لا ترتبط عضلة القلب المضيف وتشكل كتلة متماسكة مع حاجز متليفة رقيقة. على الرغم من أن في بعض الحالات هذه النتيجة قد يكون من المفيد، قد يكون التحليل التالي المفيد أن نفهم كيف يمكن التضمين engraftment الخلايا لتوليد هياكل عضلة القلب متصلة وظيفيا كذلك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع الدراسات الحيوانية في الامتثال الدولي (التوجيه 2010/63/EU في البرلمان الأوروبي) والوطنية (وزارة الداخلية في المملكة المتحدة، لعام 1986) اللوائح. الإجراءات المذكورة هنا هي جزء من خطة عملنا تحت رخصة السلطات في المملكة المتحدة والتي لم يتم الاضطلاع بها لغرض التسجيل.
1. إعداد خلايا
يصف هذا البروتوكول إعداد خط خلية معينة (الكلى الجنينية البشرية، وخلايا HEK293) لأغراض العرض التوضيحي. يجب أن توظف بروتوكولات خلية محددة لزراعة والتفريق المحفزة أو الكبار الخلايا الجذعية في الأنساب خلية معينة في نهاية المطاف.
- تنمو الخلايا في وسائل الاعلام DMEM (الجلوكوز عالية، 4،500 مجم / لتر) يحتوي على 1٪ البيروفات الصوديوم، 2 مم الجلوتامين، 1٪ للمضادات الحيوية القلم / بكتيريا و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS). ينبغي تقسيم واحد 10 سم لوحة عادة في 1:03 وتستكمل وسائل الإعلام الجديدة كل يومين.
- علاج الخلايا أقل ما يقال مع trypsفي 1X و resuspend في DMEM المتوسطة كما هو موضح في 1:1.
- عد الخلايا في غرفة عدادة الكريات وجمع 3 × 10 6 خلايا في أنبوب منفصل.
- أجهزة الطرد المركزي في دلو الدوار أرجوحة في 100 غ لمدة 5 دقائق.
- تجاهل طاف ويغسل بيليه الخلية مع العازلة الفوسفات العقيمة 2X.
- resuspend في برنامج تلفزيوني 1X بتركيز 10 6/50 شباط للحقن في البطين الأيسر من الفئران immunodepleted.
2. شروط سابق للجراحة
- الحفاظ على الفئران immunodepleted (NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD) مع الكريات العقيمة الغذاء والماء في المعزل التي تسيطر عليها درجة الحرارة (22 درجة مئوية؛ الجدول 1) قبل كل عملية جراحية.
- إجراء عملية جراحية من الفئران immunodepleted تحت غطاء تدفق الصفحي. تنظيف المنطقة العمل مع الايثانول 70٪ والأوتوكلاف الأدوات الجراحية (ملقط ومقص).
- بدوره على منصات التدفئة لعملية جراحية والانتعاش. منصات التدفئة مهمةلمنع انخفاض درجة حرارة الجسم التي تحدث أثناء وبعد الجراحة.
- وضع قفص نظيفة وتعقيمها على لوحة الانتعاش التدفئة.
- نقل الفئران في أقفاص الأصلية من المعزل إلى غرفة الجراحة في كيس معقم تعقيمها.
- تزن الماوس وفقا لوزن الجسم حقن تحت الجلد (الشوري) محلول يحتوي على medetomidine والكيتامين هيدروكلوريد المخفف في 0.9٪ محلول ملحي معقم لتخدير الماوس، وكذلك للاسترخاء عضلات (medetomidine 1 ملغ / كغ؛ الكيتامين هيدروكلوريد 75 ملغم / كغم).
- إزالة الماوس من القفص عندما تخدير كامل (في غضون 1-2 دقيقة، لا ارادي إصبع القدم قرصة بعد التحفيز)
- تطبيق كريم إزالة الشعر على الجانب الأيسر من الصدر ومنطقة الحلق. بعد كمية مناسبة من الوقت (حوالي 2-5 دقائق)، يمسح الشعر فضفاضة بمنديل مبلل بالماء.
- ضع الماوس على لوحة جراحة في موقف ضعيف. منوجهة نظر الجراح موقف عمودي، ذيل أسفل الرأس حتى.
- حقن مسكنة في حل 0.1-0.2 ميكروغرام / غرام مخففة في محلول ملحي معقم (البوبرينورفين) في أطرافهم الخلفيتين تحت الجلد، وتغطي منطقة حلق مع العقيم اليود البوفيدون حل باستخدام قضيب من القطن غيض.
- تركيز المجهر (الهدف 2.5X) على منطقة الحلق.
3. شروط الجراحية
- مع مقص حادة جعل خط الوسط بطني شق الجلد حوالي 0.5-1 سم طول أقل قليلا من الغضروف الحلقي. فصل الجلد من النسيج الضام لتصور الغدد اللعابية.
- تقسيم الغدد اللعابية على تقسيم خط الوسط الطبيعي من خلال سحب في وقت واحد كل جزء sideward مع forcep والمغناطيسية ضام الصدر وفضح القصبة الهوائية.
- سحب اللسان بلطف إلى الجانب لفضح الحنجرة. حرك أنبوب التنبيب بعناية في القصبة الهوائية. غيض أنبوب مرئيا من خلال عرض لarynx والقصبة الهوائية. الأهم من ذلك، إذا كان الأنبوب هو في، ولكن غير مرئية بشكل واضح، هو في المريء. إزالته وتغيير الموقف من طرف الأنبوب.
- توصيل أنبوب إلى الجهاز التهوية. تعيين حجم المخ في 200 ميكرولتر و 150 سكتة دماغية / دقيقة. تأمين أنابيب التهوية على لوحة الجراحة مع الشريط.
- مع مقص حادة وملقط، وجعل الذيل العمودي لرئاسة 1 - إلى 1.5 سم طويلة شق الجلد فوق منطقة الصدر اليسرى.
- ترخي البشرة من طبقات الأنسجة الضامة / العضلات والعضلات الصدرية الكبرى والصغرى دون شقوق.
- أداء بضع الصدر بين الأضلاع الثالث والرابع على النحو التالي:
- خرم طبقة العضلات الوربية التي كتبها معسر والخدش مع، ملقط صغيرة مدورة.
- بمجرد مثقبة طبقة العضلات الوربية، ضع ضام الصدر لفتح الحد الأقصى تجويف الصدر. الأجزاء العليا والوسطى من البطين الأيسر (LV) بفضل الأذن المغطي (الأذين) هيمرئية الآن.
- تحضير حقنة الدقة مع الخلايا. يجب أن تكون الحقنة قادرة على تقديم مبلغ من حجم 10 ماي لكل الحقن. يلقي G 30 إبرة في طرف الحقنة.
- مع تحديد الشريط قنية بلاستيكية صغيرة (من introcan-W 20 G) على الإبرة، وترك يتعرض فقط 1 ملم بما في ذلك غيض من الإبرة مفتوحة. وهذا منع الإبرة من تثقيب كامل جدار البطين الأيسر وحقن الخلايا في تجويف البطين الأيسر.
- مع مساعدة من الهدف 5X، تصور في هذا التكبير البطين الأيسر وحقن الخلايا في جدار البطين الأيسر في 5 مواقع مختلفة (كل حقنة سيلقي 10 شباط ليصبح المجموع 106 حقن الخلايا). إذا كان حقن ناجحا، فإن المنطقة البيضاء وغياب العكسى الرئيسية للخلايا تكون مرئية (إذا كان الحقن لم يكن ناجحا، ستستبعد الحيوان من التحليل الوظيفي).
- إزالة ضام. إغلاق جدار الصدر ب ذ تضم اثنين من أضلاعه منفصلة مع اثنين من غرز خياطة الحرير 6-0.
- ترطيب الجلد وعضلات الصدر مع طرف القطن منقوع في برنامج تلفزيوني 1X ووضع بلطف عضلات الظهر إلى الوضع الأصلي مع ملقط.
- إغلاق الجلد مع 3-4 غرز خياطة الحرير 6-0 من. خياطة شق الحلق 2-3 مع غرز لإغلاق الجلد.
- حقن atipamezole (1 ملغ / كغ تركيز النهائي) أن تعود آثار مخدر.
- حالما يبدأ الماوس التنفس بشكل مستقل، واخراج أنبوب من القصبة الهوائية ووضع الماوس على جانبها الأيمن. من المتوقع أن يتعافى في غضون دقائق الماوس.
- عندما يبدأ الماوس لتشغيل والمشي، وضعه في قفص الانتعاش الدافئة (IVC قفص صغير مع مغلقة أعلى تصفيتها) لمدة ساعة.
- ترك بين عشية وضحاها الحيوانات في مربع ساخنة للرقابة (37 درجة مئوية).
- ملء طبق بالماء والغذاء بيليه لدعم الانتعاش خلال الأيام الأولى بعد الجراحة 2.
ق ق = "jove_title"> 4. تحليلات الجراحة آخر
ويتم تحليل عشرة قلوب حقنها بخلايا و10 السيطرة قلوب لا حقن تشريحيا على النحو التالي:
- إجراء تحليل الخلايا المطعمة بعد 1 أسبوع حقن (الشكلان 1 و 3).
- بعد القتل الرحيم بواسطة جرعة زائدة من isoflurane و، يروي قلوب مع 20 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لإصلاح الأنسجة. يذوى الأنسجة الثابتة في زيادة نسبة الإيثانول (70-100٪) وتغرس في كتل البارافين.
- القسم قلوب في البارافين مع مشراح في 5 ميكرون وصمة عار مع الهيماتوكسيلين ويوزين للتحليل الصرفي.
- تصور النسيج الضام باستخدام ماسون ثلاثي الألوان وصمة عار.
- تحليل الصور تحت المجهر الماسح الضوئي الشريحة (أرقام 1A، 2A، 3A، 3B، و 3C) وتصور قلب كامل في عرض المحور قصيرة باستخدام المجهر الماسح الضوئي الشريحة الرقمية (فيقوالدقة 1B و 1C).
- بعد التحليلات أعلاه، deparaffinize أنسجة القلب في الزيلين، ترطيب قبل غمر العينات في خفض نسبة الايثانول (من 100٪ الى الماء) وعملية المجهر الإلكتروني (SEM) على النحو التالي:
- احتضان كتل deparaffinized مع حمض التانيك 1٪ في 0.1 م العازلة الفوسفات لمدة 1 ساعة.
- يذوى العينات في زيادة نسبة الإيثانول (25-100٪).
- العينات الجافة مع HMDS (hexamethyldisilazane).
- جبل العينات على ستابس مع اتشيسون فضة داغ ومعطف لهم مع الذهب والبلاديوم.
- عرض العينات التحليلية في المجهر الإلكتروني الماسح (الشكل 2B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن حقن HEK293 الخلايا، والتي يمكن تمييزها من خلايا القلب من قبل التشكل المختلفة (الشكل 1)، مع شكل حصوه مقارنة العضلية ممدود (الشكل 1A). كانت الخلايا أكثر استجابة لمطالب HEK293 صبغ الهيماتوكسيلين (اللون الأزرق) مقارنة العضلية (اللون الوردي)، من المحتمل بسبب زيادة المحتوى النووية الخاصة بهم (الشكل 1A). لمزيد من التمييز حقن الخلايا من الأنسجة المضيفة، وصفت الخلايا HEK293 مع دابي 2 ساعات قبل الحقن. كانت الخلايا المسمى مرئية في أنسجة عضلة القلب كما هو موضح في الشكل 1E. وأظهرت مراقبة الشام التي تديرها الفئران أي ضرر في القلب كله (الشكل 1C) وسلامة الأنسجة (الشكل 1D).
في طريقة عرض المحور قصيرة كلها من القلب، وحقن الخلايا مرئية كمجموعة متجانسة في مجال الحقن (الشكل 1B). ج مجمعةوتحيط أذرع بطبقة رقيقة من الأنسجة متليفة، والتي ظهرت باعتبارها منطقة الأزرق في تلوين ثلاثي الألوان (الشكل 2A). لم تكن مرتبطة مع خلايا الأنسجة عضلة القلب المضيف، كما هو مبين من خلال المجهر الإلكتروني (الشكل 2B)، من المحتمل بسبب وظيفتها وهيكلها noncontractile الخلوية المختلفة.
بالإضافة إلى الملاحظات السابقة، لاحظنا مناطق صغيرة من ضرر حيث تم حقن الإبرة (الشكل 3A). هذه المناطق تدار من طبقة النخابية الخارجية للقلب في جدار عضلة القلب (الشكل 3A). حقن الخلايا (السهم الأخضر، الشكل 3B) موجودة على مقربة من المنطقة المصابة (الأسهم السوداء، الشكل 3B). كانت الخلايا دابي إيجابية واضحة على طول موقع الحقن (الشكل 3C، السهام البيضاء). بعد أسبوع واحد الإصابة، لم تونيل الفحص لم تظهر زيادة الخلايا أفكارك في موقع الإصابة، مما يشير إلى أن نخربدلا من موت الخلايا المبرمج وقعت بعد إبرة الحقن (الشكل 3D).
الشكل 1. التحليل النسيجي للخلايا المحقونة. A) بعد أسبوع واحد كانت جزءا لا يتجزأ قلوب حقن الخلايا في البارافين ومعالجتها لالهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ. كانت الخلايا HEK293 حقن الحاضر في جدار البطين الأيسر. تم الحصول على الصور مع مضان ستيريو المجهر. B) أظهر ثلاثي الألوان الملون الأنسجة أن الخلايا جمعت في نفس المنطقة حيث تم حقن (السهم). تظهر لوحات أسفل اليمين عرض المحور قصيرة مع الحق (RV) والبطينين الأيسر (LV). المستطيل الأحمر يدل على المنطقة التي يتم الاحتفاظ الخلايا (1.5X). وسجلت الصور مع مجهر المسح الشريحة. C) ثلاثي الألوان الحادي وaining السيطرة قلوب الشام التي تديرها. عرض القلب كله مع 5X الهدف. D) ثلاثي الألوان تلطيخ الفئران الشام التي تديرها تبين سلامة الأنسجة عضلة القلب. E) كانت ملطخة HEK293 الخلايا مع دابي 2 ساعات قبل الحقن. بعد أسبوع واحد كانت جزءا لا يتجزأ قلوب الحقن في أكتوبر ومقطوع في ناظم البرد في 6 ميكرون. وتصور الخلايا تحت الأشعة فوق البنفسجية في المجهر الفلورسنت. اليسار وتظهر البطينين الأيمن. في البطين الأيمن، اللوحة اليمنى، يمثل الخط الأبيض طبقة النخابية. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 2. تشكيل طبقة متليفة بين حقن الخلايا والأنسجة المضيف. أ) عرض ثلاثي الألوان تلطيخالأنسجة كولاجيني شكلت بين الخلايا HEK293 والأنسجة عضلة القلب الفئران (السهام). وسجلت الصور مع مجهر المسح الرقمي. تم deparaffinized B) قلوب والمجهزة للالمجهر الإلكتروني. وسجلت الصور مع المجهر الإلكتروني الماسح وتظهر ألياف الكولاجين (السهام) بين الخلايا HEK293 حقن (الجانب الأيسر)، وعضلة القلب المضيف (الجانب الأيمن). اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الرقم 3. أنتجت حقن الخلايا مناطق صغيرة من ضرر. A) يظهر ثلاثي الألوان تلطيخ مناطق صغيرة من ضرر حيث تم حقن إبرة (اللون الأزرق؛ السهام) B) كانت ملطخة أقسام البارافين من قبل ثلاثي الألوان ستايشار ining والمنطقة حيث تم حقن الخلايا عن طريق السهام السوداء. كانت حقن الخلايا (السهم الأخضر) واضحة في القرب من المنطقة المصابة. C) HEK293 الخلايا، ملطخة دابي 2 ساعات حقن السابقة، كانت موجودة على طول موقع الحقن (السهم الأبيض). يشار موقع الحقن مع السهم الأخضر والأبيض يمثل خط مفتوح طبقة التامور. D) في Tunel الفحص، التي أجريت على أقسام البارافين، لم تظهر نواة إيجابية الفلورسنت ذات الصلة. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا المخطوط، لقد أظهرنا كيفية إجراء الحقن داخل عضلة القلب من الخلايا في قلوب الفئران. كدليل على هذه المنهجية، وقد استخدمنا HEK293 الخلايا. من المهم التأكيد على أن خلايا HEK293 لا تستخدم في أي دراسة العلاج بالخلايا وبالتالي فإن نتائج هذه المخطوطة ليست مناسبة لترجمة مباشرة إلى نهج العلاجية. ومع ذلك، فإن حقيقة أن الخلايا HEK293 ليست خلايا مقلص ولا تحورها في أنواع الخلايا الأخرى يركز الاهتمام على الجوانب الفنية مثل خصائص الخلايا ليتم تسليمها ومسار التسليم.
وقد أفيد أن طريقا داخل عضلة القلب يميل إلى يسبب مجموعات الخلايا جزءا لا يتجزأ من أنسجة القلب 24،26، في حين أن الطريق داخل التاجي يمكن أن يوفر توزيعا أكثر تجانسا في موقع الإصابة. لاستبدال cardiomyocyte، يجب أن الخلية المانحة مثالية يحمل الكهربية، properti الهيكلية ومقلصيجب أن فاق من العضلية وتكون قادرة على الاندماج هيكليا ووظيفيا في الأنسجة المضيفة، مما يشير إلى ضرورة وجود برنامج تمايز الخلايا لاستخدامها قبل الزرع.
النقاط الرئيسية لعملية جراحية ناجحة يمكن تلخيصها على النحو التالي:
- تخدير الفئران مع المركبات عن طريق الحقن لإبطاء معدل ضربات القلب، وتسهيل حقن الخلايا
- أداء القسطرة داخل الرغامى من الفئران لصالح وظيفة الرئتين.
- أداء بضع الصدر تجنب شق العضلات للحفاظ على وظائف العضلات الصدرية للالتنفس الصحيح.
- بعد تعريض القلب، ومراقبة البطين الأيسر تحت المجهر لتصور ما إذا كان قد حدث حقن (مرئية كما لون شاحب).
- استخدام إبرة رقيقة وحقنة الدقة لتجنب ثقب واسعة من الأنسجة عضلة القلب وضخ المبلغ المطلوب من المواد التوالي.
- غمد الإبرة مع نظام أنابيب بلاستيكية تعريض سرهف الجزء طرف. هذا من شأنه أن يسمح إدخال الإبرة إلى عمق معين في البطين الأيسر (0.5 ملم)، وتجنب الحقن في تجويف البطين.
- إغلاق الصدر والفضاء بين الضلوع بعناية لتجنب تعرض الرئتين للضغوط الخارجية.
هذه التقنية لديها مستوى عال من النجاح إذا تم تحديد أولويات الظروف الصحية بعد العمليات الجراحية. الحيوانات يجب أن تراقب بشكل مكثف في كل يوم تصل إلى أسبوع لعلامات الضيق والألم. يجب أن تدار حقن مركبات مسكنة للسيطرة على الألم كما هو مطلوب بعد العملية. التطبيق الموضعي لتخفيف الألم، مثل يدوكائين، يمكن أن تستخدم أيضا. ينبغي منع النزيف من خلال تقنيات جراحية حذرا. ومع ذلك، إذا تحدث، فإنه يمكن وقفها من قبل ضغط أو ربط الأوعية. لاحظنا أن الحيوانات استرداد أفضل وأسرع إذا ما تركت في مربع التدفئة على 37 درجة مئوية لمدة 12-20 ساعة بعد الجراحة. وهذا العلاج منع انخفاض درجة حرارة الجسم بسرعة، ولاماللي التي تحدث بعد إجراء العمليات الجراحية وإدارة التخدير. قد تحدث التهابات بعد الجراحة ولكن يجب أن تكون أقل من 1٪. يجب أن يتبع الإجراءات العقيم الصارمة لمنع العدوى. ويمكن علاج العدوى المحلية مع تطبيق المضادات الحيوية. الأهم من ذلك، ينبغي أن تسيطر الجفاف عن طريق الحقن تحت الجلد من المياه المالحة.
فمن الأفضل لإدارة حقن مخدر على استنشاق مثل isoflurane و. في الواقع، لاحظنا أن التخدير عن طريق الحقن انخفضت نبضات القلب، مما يسهل الحقن وأقل النزيف دون التسبب في إزعاج الحيوانات.
على الرغم من الغازية، حقن كميات صغيرة من الخلايا (25-50 ميكرولتر) في الفئران غير مجدية وآمنة. كان لدينا وفيات أقل من 1٪ عن طريق حقن 50 ميكرولتر من الخلايا HEK293 في 5 مناطق مختلفة من جدار البطين الأيسر (10 ميكرولتر / الحقن). هذه المنهجية ضمان وجود الخلايا في عدة مناطق من جدار عضلة القلب، وهو أمر مهم فيالعلاج بالخلايا الجذعية عندما تحتاج المناطق مدد الضرر الدماغية التي سيتم التوصل إليها من قبل خلايا تسليمها. لإجراء عملية جراحية أقل الغازية، وقد تم نشر العديد من البروتوكولات في الآونة الأخيرة، على الرغم من التكاثر في مختبرات مختلفة لم يتم بعد التحقق منها. على سبيل المثال، حقن الخلايا يمكن أن يقوم بها تقنية قريبة الصدر باستخدام عالية الدقة ضربات القلب 27. استخدام هذا النظام يتطلب مهارات عالية المشغل لتصور بوضوح في صورة يومين البعد جدار البطين الأيسر والحفاظ على الإبرة في مكان معين خلال دورات الانقباضي / الانبساطي العادي. في الاستفادة من هذه التقنية هو زرع الخلايا في عضلة القلب الماوس إلى الأماكن المطلوبة في إطار زمني ذات الصلة سريريا بعد احتشاء عضلة القلب الاستقراء. ومع ذلك، فإن هذا النهج غير ممكن مع العمليات الجراحية مثل عضلة القلب احتشاء تحريض أو النطاقات بطريق الأبهر بسبب زيادة وفيات الحيوانات تمر العملية الثانية 27. ومن المثير للاهتمام، حمدي وزملاؤه مقارنة الحقن داخل عضلة القلب مباشرة مقابل إيصال الخلايا في جلفوم بناء على المنطقة النخابية 28. لاحظوا أن تتراكب الخلية بناء على النخاب أسفر عن وظيفة الكسب غير المشروع أفضل بالمقارنة مع حقن الخلايا داخل عضلة القلب، وأفاد أن هذا الأسلوب هو استنساخه، سهل الاستعمال، وأقل من صدمة للحيوانات 28.
سمة هامة من التجارب حقن الخلايا هو تعقب الخلايا وبقائهم على قيد الحياة. لقد أظهرنا أن الخلايا HEK293 يكون من السهل اكتشاف بسبب التشكل تمييزها مقارنة مع الخلايا القلبية. نجا هذه الخلايا حقن (لا تظهر البيانات) واستبقيت في الأنسجة أسبوع واحد بعد الجراحة. لتتبع الخلايا لدراسات طويلة الأجل وتحليل engraftment في الأنسجة التسليم وكذلك في الأنسجة الأخرى، العديد من التقنيات قيد الاستخدام، بما في ذلك وضع العلامات الفلورية والأسماك وnalysis في الجنس عدم تطابق التجارب زرع 29. الأهم من ذلك، سوف في الجسم الحي التصوير تلعب دورا رئيسيا نحو تحليل في المختبر في الدراسات المستقبلية. في الواقع، ميزة واحدة من التصوير في الجسم الحي على أساليب النسيجي هو تتبع الخلايا في الدراسات الطولية في نفس الحيوانات من دون الحاجة إلى القتل الرحيم 29. في هذه المنهجية، وخلايا يمكن أن تكون علامة مع الكواشف تلألؤ بيولوجي، جزيئات الحديد، والجينات مراسل محددة ليمكن تصوير مع التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) والرنين المغناطيسي (MRI).
أظهرت تحليلاتنا أن الخلايا مثل الخلايا noncontractile HEK293 تجميع تفضيلي في المنطقة التي تم حقنها محاطة الأنسجة كولاجيني رقيقة. على الرغم من أن الآليات المرضية في جسم المريض مما يؤدي إلى تشكيل نسيج تليفي في الماوس immunodepleted غير معروفة، والأنسجة كولاجيني مرئية حول الخلايا المزروعة قد تكون قابلة للمقارنة إلى نقطة النهاية لزرع الأنسجة متوافق. في هذه الحالة، لا يمكن إزالة المواد الخارجية من الخلايا الالتهابية ويصبح مغلفة في طبقة كثيفة من النسيج الضام متليفة، الذي يعزل فإنه من الأنسجة المحيطة بها. على نحو مماثل لمراحل نهاية مرحلة من التئام الجروح، هذا النسيج هو محبب أوعية دموية للغاية ويضمن بقاء المواد مزروع.
من الناحية الفنية كان الأسلوب هو موضح هنا ناجحة، على الرغم من حقن إبرة داخل عضلة القلب تنتج منطقة صغيرة من الأضرار التي لحقت الأنسجة المحيطة بها. على الرغم من القياسات وظيفة القلب لم تكن الهدف من هذا الاستعراض، ينبغي أن الدراسات المستقبلية التحقيق في ما إذا تلف الأنسجة طفيفة يمكن التشويش التحليلات العلاج بالخلايا. وعلاوة على ذلك، سيكون من المهم تحليل ما إذا كانت الإصابة المنتجة في منطقة حقن ينجم عن إبرة، من خلال كمية حقن الخلايا أو مزيج من الاثنين معا.
لدعم النتائج التي توصلنا إليها، وقد تبين أن transplantatioأسفرت ن السكان مختلطة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المتباينة (HESC) التي تحتوي على 20-25٪ العضلية (HESC-CM) في صحة القلب من الفئران المناعة (NOD-SCID) في الإسراع في تشكيل الطعوم التي أصبحت العضلية المنظمة ونضجت مع مرور الوقت والسكان noncardiomyocyte فقد 23. ومن المثير للاهتمام، لاحظ الباحثون أن HESC-CM تم عزل إلى حد كبير من عضلة القلب المضيف طبقة من الأنسجة متليفة التي حالت دون تشكيل مخلى الكهربية 22،23. في دراسة مختلفة، Kehat وآخرون. وجدت أن HESC-CM الخطى بنجاح البطين في الخنازير مع كامل كتلة القلب. وأظهرت هذه الدراسة أن الخلايا المزروعة على قيد الحياة، وظيفته، ودمجها مع الخلايا المضيفة، وتوفير الدليل على قدرتها على العمل كبديل البيولوجية لتنظيم ضربات القلب الإلكترونية 30. هذه نتيجتين المتنافرة يمكن التوفيق بين من الاختلاف في بنية ووظيفة حوالحادي والأنواع المانحة. في الواقع، فمن الممكن أن كفاءة اقتران العضلية المزروعة قد تعتمد على وتيرة الضرب النسبي للخلايا المضيفة والمانحة. في الدراسة فان Laake البالغ عددهم 23، قد يكون ضعف تشكيل التقاطعات وظيفية بسبب وتيرة مختلفة من الضرب العضلية الإنسان (60-100 نبضة في الدقيقة) مقابل العضلية القوارض (300-600 نبضة في الدقيقة). وهذا لن يكون الحال في الإنسان مقابل تجارب زرع الخنازير، كما هو موضح في تحليل Kehat 30.
طول الوقت هو عامل المراقبة التباس آخر. HESC-CM زرعها في قلب القوارض بعد احتشاء عضلة القلب الناجم عن القلب وظيفة تحسين فقط للحصول على نقاط الوقت على المدى القصير (4 أسابيع). ومع ذلك، في 12 أسابيع، لم يستمر وظيفة القلب مزيد من البقاء على قيد الحياة على الرغم من الكسب غير المشروع 23. لاحظ الباحثون أن حجم الكسب غير المشروع (زيادة كمية خلايا) لم يترافق مع تحسين برنامج GSS القلب على المدى الطويلival وظيفية تحسن 31، مشيرا إلى أن على المدى الطويل مقابل يحلل تحليلات المدى المتوسط القصير أو ينبغي أن يؤديها في الدراسات المستقبلية دون الحاجة إلى زيادة أعداد الخلايا للحقن.
في هذه الدراسة، لا تزال العديد من الأسئلة بشأن نوع الخلايا المراد زرعها، واختيار الأنواع المضيفة الجهات المانحة لفحصها وتقييم مفصل لإمكانات عدم اتساق نبضات القلب من الخلايا. من الناحية المثالية، وخلايا زرعها في عضلة القلب لاستبدال جهاز تنظيم ضربات القلب أو وظيفة تنبع ينبغي زوجين وظيفيا مع myocytes المتبقية. في نموذج الفئران من احتشاء عضلة القلب، وفرنانديز وآخرون 32 يستخدم المبرمج الكهربائية تحفيز (PES) لتقييم القابلية عدم انتظام ضربات القلب، مبديا inducibility زيادة عدم انتظام ضربات القلب البطيني في قلوب حقن myoblast مقارنة مع الضوابط. في تلك الدراسة نفسها، فإن حقن العظام المستمدة من الخلايا نخاع ذاتي لا يؤدي إلى زيادة inducibilإيتي من عدم انتظام ضربات القلب البطيني مقارنة مع الضوابط، وبالتالي يقود إلى الاستنتاج بأن الكتاب myoblasts أظهرت خطر محدث اضطراب النظم المحددة. في دراسة مختلفة، العظام المستمدة من نخاع الخلايا (BMC) المطعمة بكفاءة في مجموعات داخل ندبة أو احتشاء المنطقة الحدودية، ولكن أظهرت أثار أي الكترونيا الكالسيوم العابرين 33. ومن المثير للاهتمام، وي وآخرون أظهرت أن الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) لا يكتسب خصائص الكهربية من العضلية ناضجة خلال الفترة البقاء على قيد الحياة في قلوب احتشاء. ومع ذلك، فإنها يمكن أن تخفف من الضعف الكهربائية وعدم انتظام ضربات القلب البطيني تعزيز 34.
فعالية وعدم انتظام ضربات القلب قوع العلاج بالخلايا الجذعية يعتمد على الخلايا وكذلك على طرق التسليم. في الواقع، في قلوب الفئران بعد MI 35، والحقن BMC داخل عضلة القلب، على الرغم من تحسين وظيفة القلب، وزيادة متتالية البطين سابقا لأوانه تقلصات والبطين tachycardالجيش العراقي لمدة 14 يوما الأولي. عندما كان يستخدم الطريق داخل التاجي، عدم انتظام ضربات القلب البطيني انخفض حدوث ملحوظ. في الدراسات السريرية، من الصعب تقييم لأن معظم المرضى تلقي كلاء بيتا مانع كما هو مبين لمرض القلب الإقفاري وظيفة الموالية لعدم اتساق نبضات القلب من حقن الخلايا. العلاج مع حاصرات بيتا قد تخفي تأثير المؤيدة للاضطراب النظم المحتملة للخلايا المزروعة. لذا الدراسات الحيوانية ضرورية لتقييم الأسس من المحفزات الموالية للاضطراب النظم في العلاج بالخلايا الجذعية.
باختصار، يوضح البيانات المتوفرة لدينا جدوى خلية داخل عضلة القلب في الفئران حقن ولكن أيضا يؤكد على الحاجة إلى تحليل مفصل بشأن شروط سلامة التطعيم الخلية. في البشر، وقد تبين أن حقن الخلايا يرتبط الموالية لعدم انتظام ضربات القلب 36-38، عودة التضيق 39، تسارع تصلب الشرايين 40، وانسداد الشريان التاجي 41. وسوف يكون من المهم البحوث الأساسية في التطبيق السريري المستقبلlications لفهم الذي ينبغي تسليم الخلايا، وطريقة التسليم، وآليات الخلية بوساطة عضلة القلب إصلاح وظيفة، وتصميم خيفي مقابل ذاتي بروتوكول زرع الخلايا التي تعود بالفائدة على جميع السكان من البشر. بسبب التكاليف العالية المرتبطة التجارب السريرية الكبيرة، استنساخ كفاءة وفعالية بروتوكولات زرع تحتاج إلى معالجة قبل السريرية في نماذج مثل تلك الموصوفة هنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر معهد مجدي يعقوب (MYI) لدعم التحليل المجهري والمشاريع التي تنطوي على إصلاح القلب، وفنيي ومدير منشأة الحيوانية لدينا. وقد تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة القلب البريطانية (فتقول)، ومنحة مشروع PG/10/019. ويدعم MPS من قبل MYI وفتقول. TP هو التميز زميل فتقول البحوث. NR هو NH & MRC أستراليا زميل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolator | Pfi systems | Quotation needed | |
| Heating Pad | Vet Tech Solutions | HE006 | For small animals |
| Medetomidine | National Veterinary Service | Veterinary prescription is necessary | |
| Ketamine hydrochloride | National Veterinary Service | Veterinary prescription is necessary | |
| Atipamezole | National Veterinary Service | Veterinary prescription is necessary | |
| Hair removal cream | commercial shops | ||
| Buprenorphine | NVS | Veterinary prescription is necessary | |
| Leica MZFLIII microscope | Leica | Model S6E | With swing arm stand TS0 |
| Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner | Hamamatsu | RS series | |
| Scanning Electron Microscope | Jeol | JSM-6610 | |
| Blunt scissors | FST | 14084-09 | |
| Minivent | Harvard Apparatus | 73-0043 | Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844) |
| Forceps | FST | 11052-10 | |
| Retraction system | FST | 18200-20 | Kit for animals up to 200 g |
| 30 G 12 mm; ½ inch | BBraun | A210 | Fine yellow |
| Microliter syringe | ESSLAB | 81201 | Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalog number 83700 |
| 6-0 Silk suture | Ethicon | W1614T |
References
- Menasche, P., et al. Myoblast transplantation for heart failure. Lancet. 357, 279-280 (2001).
- Taylor, D. A., et al. Regenerating functional myocardium: improved performance after skeletal myoblast transplantation. Nat. Med. 4, 929-933 (1998).
- Suzuki, K., et al. Cell transplantation for the treatment of acute myocardial infarction using vascular endothelial growth factor-expressing skeletal myoblasts. Circulation. 104, 207-212 (2001).
- Suzuki, K., et al. Targeted cell delivery into infarcted rat hearts by retrograde intracoronary infusion: distribution, dynamics, and influence on cardiac function. Circulation. 110, 225-230 (2004).
- Robinson, S. W., et al. Arterial delivery of genetically labelled skeletal myoblasts to the murine heart: long-term survival and phenotypic modification of implanted myoblasts. Cell Transplant. 5, 77-91 (1996).
- Muller-Ehmsen, J., et al. Survival and development of neonatal rat cardiomyocytes transplanted into adult myocardium. J. Mol. Cell Cardiol. 34, 107-116 (2002).
- Reinecke, H., Zhang, M., Bartosek, T., Murry, C. E. Survival, integration, and differentiation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts. Circulation. 100, 193-202 (1999).
- Dimmeler, S., Zeiher, A. M., Schneider, M. D. Unchain my heart: the scientific foundations of cardiac repair. J. Clin. Invest. 115, 572-583 (2005).
- Oettgen, P., Boyle, A. J., Schulman, S. P., Hare, J. M. Cardiac Stem Cell Therapy. Need for Optimization of Efficacy and Safety Monitoring. Circulation. 114, 353-358 (2006).
- Krause, K., et al. Percutaneous intramyocardial stem cell injection in patients with acute myocardial infarction: first-in-man study. Heart. 95, 1145-1152 (2009).
- Rodrigo, S. F., et al. Intramyocardial injection of bone marrow mononuclear cells in chronic myocardial ischemia patients after previous placebo injection improves myocardial perfusion and anginal symptoms: an intra-patient comparison. Am. Heart J. 164, 771-778 (2012).
- Smith, R. R., et al. Regenerative potential of cardiosphere-derived cells expanded from percutaneous endomyocardial biopsy specimens. Circulation. 115, 896-908 (2007).
- Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration. J. Cardiovasc. Transl. Res. 2, 173-181 (2009).
- Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circ Res. 95, 911-921 (2004).
- Malliaras, K., et al. Safety and efficacy of allogeneic cell therapy in infarcted rats transplanted with mismatched cardiosphere-derived cells. Circulation. , 125-1100 (2012).
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114, 763-776 (2003).
- Bearzi, C., et al. Identification of a coronary vascular progenitor cell in the human heart. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 15885-15890 (2009).
- Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. JAMA. 308, 2369-2379 (2012).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379, 895-904 (2012).
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378, 1847-1857 (2011).
- Brunt, K. R., Weisel, R. D., Li, R. K. Stem cells and regenerative medicine - future perspectives. Can. J. Physiol. Pharmacol. 90, 327-335 (2012).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat. Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
- van Laake, L. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes survive and mature in the mouse heart and transiently improve function after myocardial infarction. Stem Cell Res. 1, 9-24 (2007).
- Leobon, B., et al. Myoblasts transplanted into rat infarcted myocardium are functionally isolated from their host. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7808-7811 (2003).
- Huang, X. P., et al. Differentiation of allogeneic mesenchymal stem cells induces immunogenicity and limits their long-term benefits for myocardial repair. Circulation. 122, 2419-2429 (2010).
- Reinecke, H., Poppa, V., Murry, C. E. Skeletal muscle stem cells do not transdifferentiate into cardiomyocytes after cardiac grafting. J. Mol. Cell Cardiol. 34, 241-249 (2002).
- Springer, M. L., et al. Closed-chest cell injections into mouse myocardium guided by high-resolution echocardiography. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289, 1307-1314 (2005).
- Hamdi, H., et al. Cell delivery: intramyocardial injections or epicardial deposition? A head-to-head comparison. Ann. Thorac. Surg. 87, 1196-1203 (2009).
- Terrovitis, J. V., Smith, R. R., Marban, E. Assessment and optimization of cell engraftment after transplantation into the heart. Circ. Res. 106, 479-494 (2008).
- Kehat, I., et al. Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 22, 1282-1289 (2004).
- van Laake, L. W., et al. Improvement of mouse cardiac function by hESC-derived cardiomyocytes correlates with vascularity but not graft size. Stem Cell Res. 3, 106-112 (2009).
- Fernandes, S., et al. Autologous myoblast transplantation after myocardial infarction increases the inducibility of ventricular arrhythmias. Cardiovasc. Res. 69, 348-358 (2006).
- Scherschel, J. A., Soonpaa, M. H., Srour, E. F., Field, L. J., Rubart, M. Adult bone marrow-derived cells do not acquire functional attributes of cardiomyocytes when transplanted into peri-infarct myocardium. Mol. Ther. 16, 1129-1137 (2008).
- Wei, F., et al. Mesenchymal stem cells neither fully acquire the electrophysiological properties of mature cardiomyocytes nor promote ventricular arrhythmias in infarcted rats. Basic Res Cardiol. 107, 274 (2012).
- Fukushima, S., et al. Direct intramyocardial but not intracoronary injection of bone marrow cells induces ventricular arrhythmias in a rat chronic ischemic heart failure model. Circulation. 115, 2254-2261 (2007).
- Bartunek, J., et al. Intracoronary injection of CD133-positive enriched bone marrow progenitor cells promotes cardiac recovery after recent myocardial infarction: feasibility and safety. Circulation. 112, 178-183 (2005).
- Britten, M. B., et al. Infarct remodeling after intracoronary progenitor cell treatment in patients with acute myocardial infarction (TOPCARE-AMI): mechanistic insights from serial contrast-enhanced magnetic resonance imaging. Circulation. 108, 2212-2218 (2003).
- Smits, P. C., et al. Catheter-based intramyocardial injection of autologous skeletal myoblasts as a primary treatment of ischemic heart failure: clinical experience with six-month follow-up. J. Am. Coll. Cardiol. 42, 2063-2069 (2003).
- Kang, H. J., et al. Effects of intracoronary infusion of peripheral blood stem-cells mobilised with granulocyte-colony stimulating factor on left ventricular systolic function and restenosis after coronary stenting in myocardial infarction: the MAGIC cell randomised clinical trial. Lancet. 363, 751-756 (2004).
- Fernandez-Aviles, F., et al. Experimental and clinical regenerative capability of human bone marrow cells after myocardial infarction. Circ. Res. 95, 742-748 (2004).
- Vulliet, P. R., Greeley, M., Halloran, S. M., MacDonald, K. A., Kittleson, M. D. Intra-coronary arterial injection of mesenchymal stromal cells and microinfarction in dogs. Lancet. 363, 783-784 (2004).
