Summary
De suministro de células intramiocárdica en modelos murinos de enfermedades cardiovasculares, como la hipertensión o infarto de miocardio, es ampliamente utilizado para poner a prueba el potencial terapéutico de diferentes tipos de células en los estudios de regeneración. Por lo tanto, una descripción detallada y una visualización clara de este procedimiento quirúrgico ayudarán a definir los límites y las ventajas de los análisis de células terapéuticas cardiovasculares en pequeños roedores.
Abstract
Estudios previos mostraron que la entrega celular promueve la función cardíaca mejora por la liberación de citoquinas y factores que aumentan la revascularización del tejido cardiaco y la supervivencia celular. Además, otras observaciones revelaron que las células madre específicas, tales como las células madre cardíacas, células madre mesenquimales y cardioesferas tienen la capacidad de integrar dentro del miocardio circundante por diferenciarse en cardiomiocitos, células musculares lisas y células endoteliales.
A continuación, presentamos los materiales y métodos para la entrega fiable células contráctiles en la pared del ventrículo izquierdo de los ratones immunodepleted. Los pasos principales de este procedimiento microquirúrgico implican anestesia y la analgesia de inyección, intubación intratraqueal, incisión para abrir el pecho y exponer el corazón y la entrega de las células por una estéril aguja de calibre 30 y una jeringa de microlitro de precisión.
Procesamiento de tejidos que consiste en la recolección del corazón, embedding, seccionamiento y tinción histológica mostró que la inyección intramiocárdica de células produce un pequeño daño en la zona epicárdica, así como en la pared ventricular. Células no contráctiles fueron retenidos en la pared del miocardio de ratones inmunocomprometidos y fueron rodeados por una capa de tejido fibrótico, probablemente para proteger de la presión cardiaca y la carga mecánica.
Introduction
Varios protocolos de suministro de células se han probado en modelos murinos y de rata de enfermedades cardiovasculares con el fin de traducir la eficiencia, la eficacia y la seguridad de este procedimiento experimental en pacientes humanos. En pequeños corazones de roedores, de suministro de células intramiocárdica es el método más viable de suministro de células 1,2, mientras que en el corazón de rata 3 anterógrada y retrógrada de infusión intracoronaria de células 4 también se puede utilizar. Ambos métodos tienen límites y ventajas. La entrega de la célula a través de la vía intracoronaria tiene ventajas teóricas sobre la inyección intramuscular directa en la promoción de la difusión de células mundial 3, pero también tiene el riesgo de provocar embolia coronaria 3,5. Limitaciones en la entrega intramyocardial están asociados con la lesión mecánica, inflamación aguda y 6,7 daño miocárdico. En los seres humanos, las células para la reparación cardíaca son entregados por inyección intramiocárdica mediante un epicárdica endocárdica o quirúrgicoacercarse o por vía arterial intracoronaria 8. Inyección de rutas transvasculares es adecuado en pacientes con infarto agudo de miocardio y la reperfusión, pero puede no ser posible en caso de oclusiones totales o mala circulación en los vasos del territorio efectuada 9. La inyección directa en la pared ventricular por inyección transendocárdica o transepicárdico es técnicamente factible en función del estado de salud del paciente. De hecho, se ha demostrado que esta técnica es segura 10,11, aunque para inyección transepicárdica es necesaria una cirugía abierta de tórax y para transendocárdico se acerca a un mapeo electrofisiológico para cada paciente es necesario para diferenciar los sitios de viables miocardio isquémico o cicatrices 9.
Es importante destacar que, en los estudios de terapia celular la elección de la mejor célula para ser trasplantado está aún bajo investigación. Análisis a corto plazo (4 semanas) mostraron que la inyección de células madre cardiacas definidos como cardioesferas
En modelos de ratón y de rata, los estudios a largo plazo revelaron que la inyección de células no mejoró aún más la función cardíaca (12 meses). De hecho, los injertos de cardiomiocitos madre embrionarias humanas derivadas de células (hESC-CM) fueron en gran medida aisladas del miocardio acogida por una capa de tejido fibrótico 22,23. Resultados similares se han observado tras el trasplante intramiocárdico de mioblastos esqueléticos en el corazón de ratones infartados 24. FurthermoRe, la capacidad a largo plazo de las MSC alogénicas para preservar la función en el corazón infartado se ha limitado por la transición de una inmunoprivilegiado a un estado inmunogénica después de la diferenciación 25.
Teniendo en cuenta los desafíos y las perspectivas señaladas anteriormente, se muestra aquí cómo entregar las células por inyección intramiocárdica en ratones. Observamos que las células sin propiedades contráctiles de cardiomiocitos no están conectados con el miocardio anfitrión y forman una masa cohesiva con una barrera delgada fibrótica. Aunque en algunos casos este resultado puede ser ventajoso, el siguiente análisis puede ser útil para entender cómo el injerto de células puede ser modulada para generar estructuras de miocardio funcionalmente conectados.
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Protocol
Se realizaron todos los estudios con animales de conformidad con las normas internacionales (Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo) y nacional (UK Home Office, Ley 1986) regulaciones. Los procedimientos descritos en este documento son parte de nuestro plan de trabajo bajo licencia autoridades del Reino Unido y no se han llevado a cabo con el propósito de la grabación.
1. Preparación de las células
Este protocolo describe la preparación de una línea celular específica (riñón embrionario humano, células HEK293) con fines de demostración. Protocolos específicos de la célula deben ser empleados para el cultivo y, finalmente, la diferenciación de células madre pluripotentes o adultos en linajes celulares específicos.
- Se cultivan las células en medio DMEM (glucosa alta, 4.500 mg / L) que contiene piruvato de sodio 1%, glutamina 2 mM, 1% de antibiótico penicilina / estreptomicina y 10% de suero fetal bovino (FBS). Un 10 cm plato debe estar normalmente divide a 01:03 y los medios de comunicación complementado fresca cada dos días.
- Tratar las células suavemente con trypsen 1x y resuspender en medio DMEM como se describe en 1:01.
- Contar las células en una cámara de hemocitómetro y recoger 3 x 10 6 células en un tubo separado.
- Centrifugar en un rotor de cubeta oscilante a 100 g durante 5 min.
- Eliminar el sobrenadante y lavar el sedimento de células con tampón de fosfato estéril 2x.
- Resuspender en PBS 1x a una concentración de 10 6/50 ul para la inyección en el ventrículo izquierdo de ratones immunodepleted.
2. Condiciones prequirúrgicas
- Mantener los ratones immunodepleted (NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD) con gránulos estériles alimentos y el agua en un aislador de temperatura controlada (22 º C, Tabla 1) antes de cada cirugía.
- Lleve a cabo la cirugía de los ratones immunodepleted bajo una campana de flujo laminar. Limpie el área de trabajo con un 70% de etanol y autoclave instrumentos quirúrgicos (pinzas y tijeras).
- Encienda almohadillas térmicas para la cirugía y la recuperación. Los cojines de calefacción son importantespara bloquear la disminución de la temperatura corporal que ocurre durante y después de la cirugía.
- Coloque una jaula limpia y tratada en autoclave en la plataforma de recuperación de calor.
- Transportar los ratones en sus jaulas originales del aislador a la sala de cirugía en una bolsa de autoclave estéril.
- Pesar el ratón y de acuerdo con el peso corporal de inyección por vía subcutánea (sc) una solución que contiene medetomidina y clorhidrato de ketamina diluido en solución salina estéril al 0,9% para anestesiar el ratón, así como para relajar la musculatura (medetomidina 1 mg / kg; clorhidrato de ketamina 75 mg / kg).
- Retire el ratón de la jaula cuando está completamente anestesiado (a menos de 1-2 minutos, sin reflejo toe-pinch después de la estimulación)
- Aplicar crema de depilación en el lado izquierdo del pecho y el área de la garganta. Después de una cantidad adecuada de tiempo (aproximadamente 2-5 minutos), limpie los pelos sueltos con un pañuelo de papel humedecido con agua.
- Coloque el ratón en el panel de la cirugía en posición supina. Desdepunto de vista del cirujano la posición es vertical, la cola hacia abajo la cabeza.
- Inyectar la solución analgésica a 0,1-0,2 mg / diluida en solución salina estéril (buprenorfina) en la vía subcutánea de las extremidades posteriores g y para abarcar la zona afeitada con la solución de yodo povidona aséptica utilizando un aplicador con punta de algodón.
- Enfocar el microscopio (objetivo 2,5 veces) en el área de la garganta.
3. Condiciones Quirúrgicos
- Con unas tijeras romas hacen una incisión en la piel ventral de aproximadamente 0,5-1 cm de longitud ligeramente por debajo del cartílago cricoides. Separar la piel del tejido conectivo para visualizar las glándulas salivales.
- Dividir las glándulas salivales en su división de línea media natural, tirando al mismo tiempo cada parte lateral con fórceps y magnético retractor pecho y exponer la tráquea.
- Tirar de la lengua suavemente a un lado para dejar al descubierto la laringe. Deslice el tubo de intubación con cuidado dentro de la tráquea. La punta del tubo es visible a través del l visualizadoarynx y la tráquea. Es importante destacar que, si el tubo está en, pero no claramente visible, que es en el esófago. Retirar y cambiar la posición de la punta del tubo.
- Conectar el tubo a la máquina de ventilación. Ajuste el volumen de eyección a 200 ly 150 tiempos / min. Asegure el tubo de ventilación en el panel de la cirugía con una cinta.
- Con tijeras de punta roma y pinzas, hacer una cola vertical a frente 1 - a 1,5 cm de largo incisión en la piel sobre el área del tórax izquierdo.
- Afloje la piel desde las capas de tejido / conectivos y musculares mayores y menores músculos pectorales sin hacer incisiones.
- Realizar toracotomía entre las tercera y cuarta costillas de la siguiente manera:
- Perfore la capa de músculo intercostal pellizcando y arañando con pinzas pequeñas, redondeadas.
- Una vez que la capa de músculo intercostal está perforado, colocar el retractor pecho para abrir al máximo la cavidad torácica. Las partes alta y media del ventrículo izquierdo (VI) con su oreja suprayacente (aurícula) sonahora visible.
- Preparar una jeringa de precisión con las células. La jeringa debe ser capaz de entregar una cantidad de volumen de 10 ul para cada inyección. Fundido una aguja de 30 G en la punta de la jeringa.
- Fijar con cinta una pequeña cánula de plástico (de una-Introcan W 20 G) en la aguja, dejando expuesto sólo 1 mm incluyendo la punta abierta de la aguja. Esto evitará que la aguja de perforación de toda la pared ventricular izquierda y la inyección de las células en la cavidad del ventrículo izquierdo.
- Con la ayuda de un objetivo de 5X, visualizar a este aumento del ventrículo izquierdo e inyectar las células en la pared del ventrículo izquierdo en 5 lugares diferentes (cada inyección entregará 10 ul para un total de 106 células inyectadas). Si la inyección se realiza correctamente, un área blanca y la ausencia de gran lavado de las células serán visibles (si la inyección no se ha realizado correctamente, el animal sería excluido de análisis funcional).
- Retire el retractor. Cierre la pared torácica by que encierra los dos nervios separados con dos puntos de sutura de seda 6-0.
- Hidratar los músculos pectorales y la piel con un bastoncillo de algodón empapado en 1x PBS y ponga suavemente los músculos de nuevo en su posición original con las pinzas.
- Cierre la piel con puntos de sutura 3-4 de sutura de seda 6-0. La sutura la incisión de la garganta con 2-3 puntos de sutura para cerrar la piel.
- Inyectar atipamezol (1 mg / kg de concentración final) para revertir los efectos anestésicos.
- Tan pronto como el ratón comienza a respirar de forma autónoma, sacar el tubo de la tráquea y poner el ratón sobre su lado derecho. Se espera que el ratón para recuperarse en cuestión de minutos.
- Cuando el ratón comienza a girar y caminar, colóquelo en la jaula de recuperación tibia (pequeña jaula IVC con la parte superior filtrada cerrado) durante una hora.
- Deje a los animales durante la noche en una caja climatizada controlada (37 º C).
- Llene un recipiente con agua y comida de pellets para apoyar la recuperación durante los primeros 2 días después de la cirugía.
Diez corazones inyectados con células y 10 de control corazones no inyectadas se analizan histológicamente como sigue:
- Realizar análisis de las células injertadas 1 semana después de la inyección (Figuras 1 y 3).
- Después de la eutanasia por sobredosis de isoflurano, perfundir los corazones con 20 ml de paraformaldehído al 4% (PFA) para reparar el tejido. Deshidratar el tejido fijado en el aumento de los porcentajes de etanol (70-100%) e incrustarlo en bloques de parafina.
- Sección los corazones en parafina con un micrótomo a 5 micras y se tiñen con hematoxilina y eosina para el análisis morfológico.
- Visualizar tejido conectivo usando tinción tricrómica de Masson.
- Analizar las imágenes bajo un microscopio escáner de diapositivas (Figuras 1A, 2A, 3A, 3B, y 3C) y visualizar todo el corazón en vista de eje corto usando un microscopio de escáner de diapositivas digitales (Figures 1B y 1C).
- Después de los análisis anteriores, Desparafinar los tejidos del corazón en xileno, rehidratar sumergiendo las muestras en la disminución de los porcentajes de etanol (a partir de 100% de agua) y el proceso de Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) de la siguiente manera:
- Incubar bloques desparafinados con ácido tánico al 1% en tampón de fosfato 0,1 M durante 1 hora.
- Deshidratar las muestras en el aumento de los porcentajes de etanol (25-100%).
- Las muestras secas con HMDS (hexametildisilazano).
- Monte los especímenes en Stubbs con Acheson Plata Dag y recubrirlos con oro-paladio.
- Ver las muestras en un microscopio electrónico de barrido de análisis (Figura 2B).
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Representative Results
Hemos inyectado células HEK293, que son distinguibles de las células del corazón por su diferente morfología (Figura 1), con una forma de adoquines en comparación con los cardiomiocitos alargados (Figura 1A). HEK293 células fueron más reactivas a colorante hematoxilina (color azul) en comparación con los cardiomiocitos (color rosa), probablemente debido a su contenido nuclear aumentó (Figura 1A). A fin de distinguir las células inyectadas desde el tejido del huésped, las células HEK293 se marcaron con DAPI 2 horas antes de la inyección. -Las células marcadas eran visibles en el tejido miocárdico como se muestra en la Figura 1E. Ratones con operación simulada de control no mostraron daños en todo el corazón (Figura 1C) y la integridad del tejido (Figura 1D).
En una vista de conjunto de eje corto del corazón, células inyectadas eran visibles como un grupo homogéneo en la zona de la inyección (Figura 1B). El c agrupadosells estaban rodeados por una capa delgada de tejido fibrótico, que apareció como una zona azul en la tinción tricrómica (Figura 2A). Las células no estaban conectados con el tejido miocárdico anfitrión, como se muestra por microscopía electrónica de barrido (Figura 2B), probablemente debido a su función no contráctil y diferente estructura celular.
Además de las observaciones anteriores, hemos observado pequeñas áreas de daño en el que se inyecta la aguja (Figura 3A). Estas áreas se ejecutan desde la capa externa epicárdica del corazón en la pared miocárdica (Figura 3A). Células inyectadas (flecha verde, Figura 3B) están presentes en la proximidad de la zona lesionada (flechas negras, Figura 3B). Células DAPI-positivos eran visibles a lo largo del sitio de la inyección (Figura 3C, flechas blancas). Una semana después de la lesión, el ensayo Tunel no mostró un aumento de las células apoptóticas en el sitio de la lesión, lo que sugiere que la necrosisen lugar de la apoptosis se ha producido después de la inyección de la aguja (Figura 3D).
Figura 1. El análisis histológico de las células inyectadas. A) Una semana después de la inyección de células corazones fueron incluidos en parafina y se procesaron para tinción con hematoxilina y eosina. HEK293 células inyectadas estuvieron presentes en la pared del ventrículo izquierdo. Las imágenes se obtuvieron con un microscopio de fluorescencia estéreo. B) Trichrome tejidos teñidos mostraron que las células se agrupan en la misma zona donde se les inyectó (flecha). Paneles de la parte inferior derecha se muestran los ejes cortos ver con el derecho (VD) y los ventrículos izquierdo (VI). El rectángulo rojo muestra el área donde las células se mantienen (1,5 X). Las imágenes fueron grabadas con un microscopio de barrido de diapositivas. C) Trichrome staining de control de corazones con operación simulada. Ver corazón entero con un objetivo de 5X. D) la tinción tricrómica de los ratones con operación simulada que muestran la integridad del tejido del miocardio. E) HEK293 células fueron teñidas con DAPI 2 horas antes de la inyección. Una semana después de los corazones de inyección fueron incorporados en octubre y se seccionaron en un criostato a 6 micras. Las células se visualizaron bajo UV en un microscopio de fluorescencia. Izquierda y ventrículos derecho se muestran. En el ventrículo derecho, el panel de la derecha, la línea blanca marca la capa epicárdica. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 2. Formación de una capa fibrótica entre células inyectadas y tejido huésped. A) muestran la tinción tricrómicatejido de colágeno formado entre las células HEK293 y el tejido miocárdico murino (flechas). Las imágenes fueron grabadas con un microscopio de barrido digital. B) Los corazones fueron deparaffinized y se procesaron para microscopía electrónica de barrido. Las imágenes fueron registradas con un microscopio electrónico de barrido y muestran las fibras de colágeno (flechas) entre las células HEK293 inyectados (lado izquierdo) y el miocardio host (lado derecho). Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 3. Inyección de la célula produce pequeñas áreas de daño. A) tinción tricrómica muestra pequeñas áreas de daño en el que se inyecta la aguja (de color azul;. Flechas) B) Secciones de parafina se tiñeron por Trichrome stanando y el área donde se inyectaron las células se indica por las flechas negras. Células inyectadas (flecha verde) eran visibles en la proximidad de la zona lesionada. C) HEK293 células, teñidas con DAPI 2 horas antes de inyección, estaban presentes a lo largo del sitio de la inyección (flecha blanca). El sitio de la inyección, se indica con una flecha verde y la línea blanca abierta marca la capa pericárdica. D) Tunel ensayo, realizado en secciones de parafina, no mostró núcleos positivos fluorescentes pertinentes. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
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Discussion
En este manuscrito, hemos demostrado cómo llevar a cabo la inyección intramiocárdica de células en corazones murinos. Como prueba de esta metodología, hemos utilizado células HEK293. Es importante destacar que las células HEK293 no se utilizan en cualquier estudio de terapia celular y por lo tanto los resultados de este manuscrito no son apropiados para la traducción directa a un enfoque terapéutico. Sin embargo, el hecho de que las células HEK293 no son células contráctiles y no transdiferenciarse en otros tipos de células se centra la atención en los aspectos técnicos como las propiedades de las células para ser entregados y la vía de administración.
Se ha informado de que una ruta intramiocárdica tiende a causar racimos de células incrustadas en el tejido cardíaco 24,26, mientras que la vía intracoronaria podría proporcionar una distribución más homogénea en el sitio de la lesión. Para el reemplazo de cardiomiocitos, la célula donante ideal debe exhibir el electrofisiológico, properti estructural y contráctilES de cardiomiocitos y deben ser capaces de integrar estructuralmente y funcionalmente en el tejido del huésped, lo que sugiere la necesidad de un programa de diferenciación de las células para ser empleado antes del trasplante.
Los puntos clave para una exitosa cirugía se pueden resumir de la siguiente manera:
- Anestesie ratones con compuestos inyectables bajar la frecuencia cardíaca y facilitar la inyección de células
- Realizar canulación intratraqueal de ratones para favorecer la funcionalidad pulmones.
- Lleve a cabo una toracotomía incisión evitando muscular para mantener la funcionalidad del músculo pectoral para una correcta respiración.
- Después de exponer el corazón, el ventrículo izquierdo observar bajo un microscopio para visualizar si se ha producido la inyección (visible como un color pálido).
- Utilice una aguja fina y una jeringa de precisión para evitar extensa perforación del tejido miocárdico y para inyectar la cantidad deseada de material, respectivamente.
- Cubra la aguja con un sistema de tubos de plástico exponer oólo la parte de la punta. Esto permitiría la introducción de la aguja a una profundidad específica en el ventrículo izquierdo (0,5 mm), evitando la inyección en la cavidad ventricular.
- Cierre el pecho y el espacio entre las costillas con cuidado para evitar la exposición de los pulmones a la presión externa.
Esta técnica tiene un alto nivel de éxito si se da prioridad a las condiciones de salud post-operatorio. Los animales deben ser supervisados intensamente todos los días hasta una semana en busca de signos de angustia y dolor. La inyección de compuestos analgésicos para controlar el dolor se debe administrar como sea necesario después de la operación. La aplicación tópica de alivio del dolor, tales como lidocaína, puede también ser utilizado. El sangrado se debe prevenir mediante técnicas quirúrgicas cuidadosas. Sin embargo, si se produce, puede ser detenido por la compresión o la ligadura de los vasos. Hemos tomado nota de que los animales se recuperan mejor y más rápidamente si se deja en una caja de calentamiento a 37 ° C durante 12 a 20 horas después de la cirugía. Este tratamiento bloquear el rápido descenso de la temperatura corporal, ninormalmente ocurre después de intervención quirúrgica y la administración de la anestesia. Infecciones postquirúrgicas pueden ocurrir, pero debe ser inferior a 1%. Procedimientos asépticos deben seguirse estrictamente para evitar la infección. La infección local puede ser tratado con una aplicación de antibióticos. Es importante destacar que, deshidratación debe ser controlada por la inyección subcutánea de solución salina.
Es preferible administrar inyectable sobre anestésico inhalado, tal como isoflurano. De hecho, se observó que el anestésico inyectable disminuyó latido del corazón, lo que permite la inyección más fácil y menos sangrado sin causar molestias animales.
Aunque invasiva, la inyección de volúmenes pequeños de células (25-50 mu l) en ratones es factible y segura. Tuvimos una mortalidad inferior al 1% mediante la inyección de 50 l de células HEK293 en 5 zonas diferentes de la pared ventricular izquierda (10 l / inyección). Esta metodología asegura la presencia de las células en varias áreas de la pared del miocardio, que es importante enterapia de células madre cuando áreas extensas de daño isquémico necesitan ser alcanzado por las células entregadas. Para realizar una cirugía menos invasiva, varios protocolos han sido publicados recientemente, aunque su reproducibilidad en diferentes laboratorios aún no ha sido verificado. Por ejemplo, la inyección de células se puede realizar por la técnica de cerca del pecho usando alta resolución ecocardiografía 27. El uso de este sistema requiere habilidades altos de operador para visualizar con claridad una imagen de dos dimensiones en la pared del ventrículo izquierdo y para mantener la aguja en una ubicación específica durante los ciclos normales sistólica / diastólica. La ventaja de esta técnica es la implantación de las células en el miocardio de ratón a lugares deseados en un marco de tiempo clínicamente relevante después de la inducción del infarto de miocardio. Sin embargo, este enfoque no es posible con procedimientos de cirugía tales como la inducción de infarto de miocardio o de bandas transaórtico debido al aumento de la mortalidad de los animales sometidos a una segunda operación 27. Curiosamente, Hamdi y sus colegas compararon la inyección intramiocárdica directa versus parto de las células en un Gelfoam construir en la zona epicárdica 28. Observaron que la superposición de la célula de construir en el epicardio se tradujo en una mejor funcionalidad del injerto en comparación con la inyección de células intramiocárdica e informó de que esta técnica es reproducible y fácil de usar, y menos traumática para los animales 28.
Una característica importante de los experimentos de inyección de células es el rastreo de las células y su supervivencia. Hemos demostrado que las células HEK293 son fáciles de detectar debido a su morfología distinguible en comparación con las células cardíacas. Estas células sobrevivieron a la inyección (datos no mostrados) y se mantuvieron en el tejido de una semana después de la cirugía. Para rastrear las células para estudios a largo plazo y analizar su injerto en el tejido de la entrega, así como en otros tejidos, varias técnicas se utilizan, incluido el etiquetado fluorescente y un FISHnálisis en el sexo-desajuste experimentos de trasplante 29. Es importante destacar que, de imágenes in vivo jugará un papel importante para los análisis in vitro en estudios futuros. De hecho, una de las ventajas de imágenes in vivo sobre los métodos histológicos es el seguimiento de las células en los estudios longitudinales en los mismos animales sin la necesidad de la eutanasia 29. En esta metodología, las células se pueden marcar con reactivos de bioluminiscencia, partículas de hierro, y genes indicadores específicos para obtener imágenes con la tomografía por emisión de positrones (PET) y resonancia magnética (MRI).
Nuestros análisis mostraron que las células no contráctiles tales como células HEK293 preferentemente agrupados en la zona donde se les inyectó rodeado por un tejido de colágeno delgado. Aunque los mecanismos fisiopatológicos que conducen a la formación de tejido fibrótico en un ratón immunodepleted son desconocidos, el tejido colágeno visible alrededor de las células trasplantadas puede ser comparable a la de un punto finalimplante compatible con los tejidos. En este caso, el material exógeno no se puede quitar por las células inflamatorias y queda encapsulado en una densa capa de tejido conjuntivo fibrótico, que aísla de los tejidos circundantes. De manera similar a las fases de la fase final de la curación de heridas, este tejido granular es altamente vascularizado y asegura la supervivencia del material implantado.
Técnicamente, el método descrito aquí fue exitosa, a pesar de la aguja de inyección intramiocárdica produce una pequeña área de daño al tejido circundante. Aunque las mediciones de la función cardíaca no fueron el objetivo de esta revisión, los estudios futuros deberían investigar si el daño tisular menor puede perturbar análisis de terapia celular. Además, sería importante analizar si la lesión producida en la zona de inyección es causado por la aguja, por la cantidad de células inyectadas o por una combinación de ambos.
En apoyo de nuestros resultados, se ha demostrado que transplantation de poblaciones mixtas de células diferenciadas madre embrionarias humanas (hESC) que contienen 20-25% cardiomiocitos (células madre-CM) en la salud del corazón de los ratones inmunodeprimidos (NOD-SCID) dio lugar a una rápida formación de injertos en el que los cardiomiocitos se organizaron y se maduraron con el tiempo y la población noncardiomyocyte se perdió 23. Curiosamente, los autores observaron que hCME-CM fueron en gran medida aislada del miocardio anfitrión por una capa de tejido fibrótico que impidió la formación de un sincitio electrofisiológico 22,23. En un estudio diferente, Kehat et al. Encontró que hESC-CM se paseó con éxito el ventrículo en cerdos con bloqueo cardíaco completo. Este estudio mostró que las células trasplantadas sobrevivieron, funcionaban, y se integran con las células huésped, proporcionando evidencia por su capacidad para funcionar como una alternativa biológica para el marcapasos electrónico 30. Estos dos resultados discordantes se pueden reconciliar por la diferencia en la estructura y la función de Hoª y especie donante. De hecho, es posible que la eficiencia de acoplamiento de los cardiomiocitos trasplantados puede depender de la frecuencia de latidos relativa de células huésped y de los donantes. En el estudio de Van Laake 23, la formación de uniones funcionales podría verse afectada debido a la diferente frecuencia de latidos de los cardiomiocitos humanos (60-100 ppm) frente a los cardiomiocitos de roedores (300-600 ppm). Este no sería el caso en humanos en comparación con los experimentos de trasplante de porcino, como se describe en el análisis Kehat 30.
La longitud de tiempo de observación es otro factor de confusión. hESC-CM transplanta en el corazón de roedores después de un infarto de miocardio inducido función cardíaca mejora sólo para los puntos de tiempo a corto plazo (4 semanas). Sin embargo, a las 12 semanas, la función cardiaca no fue sostenido más a pesar de la supervivencia del injerto 23. Los autores observaron que el tamaño del injerto (aumento de la cantidad de células) no se asoció con una mejora Surv cardíaca a largo plazoival y funcional mejora de 31 años, lo que indica que los análisis a largo plazo frente a los análisis a corto o mediano plazo se debe realizar en futuros estudios, sin necesidad de aumentar el número de células inyectable.
En el presente estudio, varias preguntas permanecen sin respuesta, el tipo de células a trasplantar, la selección de las especies de acogida de donantes a probar y una evaluación detallada del potencial arrítmico de las células. Lo ideal es que las células madre implantadas en el miocardio para el reemplazo o el funcionamiento del marcapasos debe funcionalmente par con los miocitos restantes. En un modelo de rata de infarto de miocardio, Fernandes et al. 32 se usa estimulación eléctrica programada (PES) para evaluar la susceptibilidad de arritmias, que muestra un aumento de la capacidad de inducción de arritmias ventriculares en corazones de mioblastos inyectados en comparación con los controles. En este mismo estudio, las inyecciones de células autólogas derivadas de médula ósea no dieron como resultado un aumento de la inducibildad de las arritmias ventriculares en comparación con los controles, lo que conduce a los autores a concluir que los mioblastos exhibieron un riesgo arritmogénica específico. En otro estudio, las células derivadas de la médula ósea (BMC) injertados de manera eficiente en grupos dentro de la cicatriz del infarto o de la zona fronteriza, pero no acusó electrónicamente evocó Ca transitorios 33. Curiosamente, Wei et al. Mostró que las células madre mesenquimales (MSC) no adquieren las propiedades electrofisiológicas de los cardiomiocitos maduros durante el período de supervivencia en los corazones infartados. Sin embargo, pueden aliviar la vulnerabilidad eléctrica y no generar arritmias ventriculares 34.
La eficacia y la ocurrencia de arritmias de la terapia de células madre depende de las células, así como en las rutas de entrega. De hecho, en corazones de ratas después de un IM 35, las inyecciones intramiocárdicos BMC, aunque la mejora de la función cardiaca, aumento de contracciones prematuras ventriculares consecutivos y tachycard ventricularia para los primeros 14 días. Cuando se utilizó la vía intracoronaria, la aparición de arritmia ventricular se redujo notablemente. En los estudios clínicos, la función de pro-arrítmico de las células inyectadas es difícil de evaluar ya que la mayoría de los pacientes reciben los agentes beta-bloqueadores como se indica para la enfermedad isquémica del corazón. El tratamiento con betabloqueantes puede enmascarar un posible efecto pro-arrítmico de las células trasplantadas. Los estudios en animales son por lo tanto cruciales para evaluar las bases de estímulos pro-arrítmicos en la terapia de células madre.
En resumen, nuestros datos demuestran la viabilidad de la célula de inyección intramiocárdica en ratones, pero también hace hincapié en la necesidad de un análisis detallado sobre las condiciones de seguridad de injerto celular. En los seres humanos, se ha demostrado que la inyección de células está asociada con Pro-arritmias 36-38, reestenosis 39, aterosclerosis acelerada 40, y la obstrucción coronaria 41. La investigación básica será importante en el futuro la aplicación clínicacaciones para entender que las células deben ser entregados, el tipo de parto, los mecanismos de reparación del miocardio función mediada por células, y el diseño de un protocolo de trasplante alogénico contra autólogo trasplante de células que benefician a toda la población humana. Debido a los altos costos asociados con los grandes ensayos clínicos, la reproducibilidad de la eficiencia y la eficacia de los protocolos de trasplante debe ser abordado en modelos preclínicos, tales como los descritos aquí.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos al Instituto Magdi Yacoub (MYI) para soportar el análisis de microscopía y los proyectos relacionados con la reparación cardíaca, los técnicos y el Gerente de nuestra instalación para animales. Este trabajo ha sido financiado por la Fundación Británica del Corazón (BHF), PG/10/019 Subvención de proyectos. MPS es compatible con el MYI y BHF. TP es un BHF-Research Excellence Fellow. NR es un NH & MRC Australia Fellow.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolator | Pfi systems | Quotation needed | |
| Heating Pad | Vet Tech Solutions | HE006 | For small animals |
| Medetomidine | National Veterinary Service | Veterinary prescription is necessary | |
| Ketamine hydrochloride | National Veterinary Service | Veterinary prescription is necessary | |
| Atipamezole | National Veterinary Service | Veterinary prescription is necessary | |
| Hair removal cream | commercial shops | ||
| Buprenorphine | NVS | Veterinary prescription is necessary | |
| Leica MZFLIII microscope | Leica | Model S6E | With swing arm stand TS0 |
| Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner | Hamamatsu | RS series | |
| Scanning Electron Microscope | Jeol | JSM-6610 | |
| Blunt scissors | FST | 14084-09 | |
| Minivent | Harvard Apparatus | 73-0043 | Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844) |
| Forceps | FST | 11052-10 | |
| Retraction system | FST | 18200-20 | Kit for animals up to 200 g |
| 30 G 12 mm; ½ inch | BBraun | A210 | Fine yellow |
| Microliter syringe | ESSLAB | 81201 | Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalog number 83700 |
| 6-0 Silk suture | Ethicon | W1614T |
References
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