Summary
Les ondes de choc sont aujourd'hui bien connus pour leurs effets régénérateurs. Par conséquent, des expériences in vitro sont d'un intérêt croissant. Nous avons donc développé un modèle in vitro pour les essais d'ondes de choc dans (de IVSWT) qui nous permet de mimer les conditions in vivo, évitant ainsi les effets physiques distrayantes.
Abstract
Les ondes de choc sont aujourd'hui bien connus pour leurs effets régénérateurs. Résultats de la recherche de base ont montré que les ondes de choc ne provoquent un stimulus biologique pour cibler les cellules ou les tissus sans aucun dommage ultérieur. Par conséquent, des expériences in vitro sont d'un intérêt croissant. Différents procédés d'application des ondes de choc sur des cultures de cellules ont été décrites. En général, tous les modèles existants se concentrent sur la façon d'appliquer les meilleures ondes de choc sur les cellules.
Toutefois, cette question reste: Que deviennent les vagues après le passage de la culture cellulaire? La différence de l'impédance acoustique du milieu de culture cellulaire et de l'air ambiant est très élevé, que plus de 99% des ondes de choc se traduit! Nous avons donc développé un modèle qui se compose essentiellement d'un récipient construit en plexiglas qui permet aux ondes de se propager dans l'eau après passage de la culture cellulaire. Cela permet d'éviter les effets de cavitation ainsi que la réflexion des ondes qui seraient autrement perturber ceux à venir. Wie ce modèle, nous sommes en mesure de reproduire les conditions in vivo et ainsi gagner de plus en plus de connaissances sur la façon dont le stimulus physique des ondes de choc se traduit en un signal de cellule biologique ("mécanotransduction").
Introduction
Les ondes de choc sont des ondes de pression acoustique résultant d'une libération soudaine d'énergie, par exemple. que le tonnerre quand la foudre. En médecine ondes de choc ont été utilisés depuis plus de 30 ans de lithotritie pour la désintégration de calculs rénaux. Depuis la découverte fortuite de l'os iliaque épaississement chez les patients lithotritie au début des années 1980, les premières études ont été menées pour évaluer l'effet du traitement par ondes de choc (SWT) sur l'os de guérison 1. Des résultats impressionnants de l'amélioration de la cicatrisation des pseudarthroses des os longs ont pu être observés 2. Par la suite, des indications ont été élargies à des blessures des tissus mous 3. Résultats de la recherche de base ont montré que les ondes de choc ne provoquent un stimulus biologique pour le tissu cible sans dommages ultérieurs. Libération de facteurs de croissance angiogéniques (par exemple, VEGF, PIGF, FGF) est suivie par une angiogenèse significative. Cela a conduit à une nouvelle expansion des indications vers les pathologies ischémiques. Notre groupe et d'autres ont montré l'eff positifect de SWT sur les maladies cardiaques ischémiques chez les modèles animaux, ainsi que dans des essais cliniques 4-6.
Cependant, le mécanisme exact de la manière dont le stimulus physique de SWT est traduit en un signal biologique (mechanotransduction) reste en grande partie inconnue. Comme l'intérêt dans SWT de plusieurs domaines de la médecine augmente continuellement, la quête du mécanisme est de plus en plus intense. Par conséquent, expériences in vitro d'ondes de choc dans gagnent en importance. Outre la réduction de l'expérimentation animale et de la rentabilité, le plus grand avantage de vitro traitement par ondes de choc dans (de IVSWT) peut être la possibilité d'étudier le comportement spécifique d'un certain type de cellule. Dans l'onde de choc régénération tissulaire médiée probablement toutes les cellules du tissu traité sont en cause, même effets systémiques sont discutées. Néanmoins, chaque type de cellule joue un rôle spécifique et possède sa propre fonction intrinsèque. IVSWT nous permet de détecter cette fonction particulière d'une nous donne ainsi une meilleure compréhension des processus sous-jacents complexes.
Les connaissances actuelles sur les effets de l'onde de choc sur les cultures de cellules comprend l'augmentation de la prolifération, de la modification des récepteurs de la membrane cellulaire, l'augmentation et l'accélération de la différenciation cellulaire, la libération de facteurs de croissance et chimio-attractants ainsi qu'une augmentation de la migration cellulaire 9.7.
Effets physiques distrayantes dans la plupart des modèles in vitro diverses méthodes d'application des ondes de choc sur des cultures de cellules ont été décrits. Ce fait conduit au problème qu'il est très difficile de comparer les résultats, que les conditions physiques de la stimulation des cellules sont tout à fait différent entre ces modèles. En général, tous les modèles existants se concentrent sur la façon d'appliquer les meilleures ondes de choc sur les cellules.
Toutefois, cette question reste: Que deviennent les vagues après le passage de la culture cellulaire? Le problème principal est que la différence de l'acoustiqueimpédance du milieu de culture cellulaire et de l'air ambiant est très élevé, que plus de 99% des ondes de choc se traduit Figure 1.
En raison de la différence d'impédance acoustique des deux milieux ne sont pas les ondes reflétées mais seulement un déphasage de 180 ° se produit résultant en des forces de traction solides aux cellules Figure 2.
L'impédance acoustique est définie comme le produit de la densité d'un matériau et sa vitesse de propagation Z = ρ x c. Pour l'eau de l'impédance acoustique est ZWater = 1440000 Ns / m 3, pour l'air, il est à seulement 420 Ns / m 3. La grande différence entre ces deux valeurs donne la réflexion et le déphasage des ondes de choc. Le déphasage devient une impulsion de pression positive en une onde de traction.
Même si cette force de traction n'est pas nocif pour les cellules, elle interfère avec l'idée d'imiter des effets d'ondes de choc vivo et in vitro. In vivo cesforces de traction à peine sont dues à de grandes structures de l'organisme.
En outre, le running back des vagues peut même déranger ceux entrants. Cela peut provoquer des interférences. Deux types d'intervention sont connues. Une interférence constructive que les deux ondes sont ajoutés entraînant ainsi l'amplitude doublé Figure 3. L'interférence destructive se produit si les ondes se rencontrent diamétralement opposée. Il provoque l'abolition des vagues (figure 3). Par conséquent, IVSWT a besoin d'un modèle qui permet aux ondes de choc de se propager après le passage de la culture cellulaire.
bain d'eau IVSWT
Considérations suivantes les préoccupations mentionnées ci-dessus nous conduisent à concevoir un bain d'eau pour éviter les problèmes décrits Figure 4. Fondamentalement, il s'agit d'un plexiglas contenant construit avec une membrane de connecter tout type de applicateur d'ondes de choc. Pour le couplage entre cette membrane et la transmission applicateur ultrasonore gel doit être utilisé. Le bain d'eau est rempli d'eau dégazée pour éviter la cavitation qui pourrait se produire si le gaz a été soluté dans l'eau. Dispositif de chauffage par le bas avec un capteur de température relié à une unité de commande permet de réguler la température de l'imitation de conditions in vivo et pour éviter des cultures de cellules de refroidir pendant la procédure. La température peut être maintenue stable à 37 degrés centigrades comme cela se fait dans un incubateur. Un support pour les échantillons de cellules permet une immersion de n'importe quel type de ballon de culture ou d'un tube. De ce fait, le réservoir d'échantillon doit être complètement remplie de milieu de culture, comme des bulles d'air pourraient bloquer les ondes de choc! Un absorbeur en forme de coin à la paroi arrière de la salle de bain destructs vagues pour ne pas se réfléchie et courir en arrière pour éviter les interférences.
Un autre avantage pour d'autres modèles de IVSWT est la possibilité de faire varier la distance entre l'applicateur et les flacons de culture. Les résultats de notre groupe et d'autres qui utilisent ce modèle s clairementfaçon que chaque type de cellule réagit très spécifiquement à différents paramètres de traitement. De plus, la définition de la distance entre la source des ondes et l'échantillon est cruciale car elle nous permet de contrôler les cellules à se trouver à une position spécifique par rapport à l'orientation de l'applicateur d'onde de choc.
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Protocol
Permission éthique
Après avoir obtenu le consentement éclairé des patients, le cordon ombilical ont été obtenus à partir de la césarienne au Département de gynécologie pour l'isolement de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC). Autorisation a été donnée par le comité d'éthique de l'Université médicale d'Innsbruck (n ° UN4435).
1. Préparer la IVSWT bain d'eau
- Préparer 3,5 L d'eau du robinet dans un réservoir approprié. Doit être chauffé à 37 ° C (voir le protocole n ° 6) de l'eau.
- Remplir l'eau dans le bain-marie jusqu'à ce que le niveau d'eau est d'environ 3 cm en dessous du bord. L'esprit pour couvrir complètement la membrane avec de l'eau. Ce sera environ de la prêt de 3,5 L.
- Connectez le capteur de température à l'alimentation.
- Mettre le capteur dans le raccord prévu sur la paroi arrière du bain d'eau.
- Se connecter à l'alimentation électrique du chauffage de la sonde de température. Ne pas le faire sansl'eau dans le bain que le chauffe ferait fondre le plexiglas.
- Attendez que l'eau a atteint une température stable de 37 ° C. Incorporer l'eau régulièrement avec une sorte de bâton pour garantir une température constante tout au long de la salle de bain de l'eau.
2. Préparer les cellules et les flacons Culture
- des cellules de semences pendant une nuit à la densité désirée dans des flacons de culture T25 ou les cellules dans des flacons de culture directement jusqu'à ce qu'ils aient atteint la confluence souhaitée.
- Avant l'expérience, les flacons aligner verticalement.
- Remplir les flacons de culture avec un milieu de culture jusqu'à ce que juste en dessous du cou. Ne pas trop remplir milieu dans les flacons que le milieu en contact à la nuque ou le bouchon de fermeture serait être contaminé.
- Visser les flacons avec des bouchons solides sans filtres pour empêcher la contamination de l'eau. L'esprit que l'eau dans le bain et le bain lui-même ne sont pas stériles.
- Sceller les bouchons avec Parafilm avant l'insertion dans le bain d'eau. <li> Correction des flacons de culture scellées dans le support fourni.
- Insérer ballon fixe dans le bain d'eau. Veiller à ce que le milieu de la fiole de culture cellulaire est à la même hauteur que le centre de la membrane de l'onde de choc applicateur. Une ligne à côté de la salle de bain vous guide.
3. Définir des paramètres de traitement
- Définir la distance entre la source d'ondes de choc et de l'échantillon. Identifier les paramètres de traitement idéal en effectuant l'expérience pilote paramètre de constatation de la manière décrite à la Figure 6.
- Choisir les paramètres de traitement de droite (densité de flux d'énergie, fréquence) sur le dispositif à ondes de choc. Encore une fois, reportez-vous à la figure 6.
4. Shock application Vague
- Mettre des quantités d'abondance de gel disponibles dans le commerce de transmission d'ultrasons sur l'applicateur d'onde de choc, ainsi que sur la membrane du bain d'eau. Il s'agit d'assurer le couplage. Pas de bulles d'air ou de l'air devraient être entre l'applicateur et la membraneil serait absorber des ondes de choc.
- Raccorder applicateur de la membrane et la maintenir stable au centre de la membrane. Veillez à ce que il est aligné horizontalement.
- Assurez-vous que la position verticale correcte de la sonde à l'intérieur du bain d'eau est en conformité avec la spécification de marquage sur le côté de la baignoire.
- Tenez centres de l'applicateur et la stabilité du ballon dans une ligne horizontale.
- Activer le dispositif à ondes de choc et d'appliquer les impulsions tout en maintenant le flacon de culture, ainsi que l'applicateur dans une position stable pendant toute la procédure.
5. Après traitement
- Prendre le flacon de culture hors du bain d'eau.
- Sécher avec des serviettes en papier ordinaires.
- Essuyez le ballon avec précision agents désinfectants.
- Retirez le Parafilm étanchéité et le bouchon.
- Introduire à la pipette la moyenne à l'intérieur des flacons dans des tubes centrifuges.
- Centrifuger de façon appropriée. Centrifugation paramètres dépendent du type de cellule utilisée,
- Ajouter 5 ml de milieu de culture cellulaire dans le flacon. Remettre en suspension le culot de cellules centrifugé avec 2 ml de milieu de culture cellulaire. Introduire à la pipette la suspension dans le ballon. Ainsi, des fragments de cellules ou de cellules qui peuvent avoir été détachés pendant le traitement ne se perdent pas.
Pièges
- Préparation ainsi que le traitement doivent être effectuées dans des conditions stériles à l'intérieur de l'écoulement laminaire pour éviter la contamination de la culture cellulaire.
- Les bonnes pratiques de culture cellulaire est recommandé d'éviter la contamination des sondes. En particulier la désinfection de l'extérieur des flacons est fortement recommandé avant de les remettre à l'incubateur. Le bain d'eau, ainsi que l'intérieur de l'eau, n'est pas stérile!
- Ne pas brancher le chauffe-eau à l'alimentation à moins que le bain d'eau est rempli d'eau pour éviter d'endommager les plexiglas bain construites.
- Utilisez une quantité généreuse de gel d'ultrasons sur le appl d'onde de chocicator et garantissent un bon couplage et de propagation de l'onde dans le bain. Les bulles d'air de l'air et même de petits font absorber les ondes de choc!
- Vérifier la position des sondes à l'intérieur du bain d'eau par rapport à l'applicateur pour assurer un traitement de la totalité de la zone de croissance.
- Ne pas tremper les sondes trop profondément dans l'eau pour éviter la contamination.
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Representative Results
En utilisant le procédé décrit, nous avons appliqué les ondes de choc à des cellules endotheliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) qui nous mentionné ci isolé à partir de cordons ombilicaux. Cordon ombilical ont été obtenus à partir de césariennes électives.
Les cellules HUVEC ont été traitées à une confluence de 90% dans un flacon de culture de cellules T25 avec un système de thérapie par ondes de choc électro-hydraulique. les paramètres de traitement étaient une densité de flux d'énergie de 0,1 mJ / mm 2 et une fréquence de 5 Hz. 300 impulsions ont été appliquées à partir d'une distance de 5 cm de la source d'ondes de choc à la couche de cellules.
L'expression des gènes de Tie-2 (Tyrosine kinase avec des domaines de type immunoglobuline et EGF-like 2) de l'ARNm a été mesurée par analyse par PCR en temps réel. Il était significativement régulée à la hausse au fil du temps (2 heures après SWT: 156,75 ± 14,49, 4 heures: 141,03 ± 9,71, 6 h: 166,68 ± 2,15, p <0,05 vs CTR: 100,03 ± 7,5) figure 5B. Ce récepteur angiopoietin donne une indication directe de l'endothélium c prolifération ell et est un indicateur de la capacité vers l'angiogenèse. Comme contrôle positif, nous avons utilisé le poly (I: C) (acide polycytidylique polyinosinique) que comme un analogue de la structure de l'ARN est connue pour stimuler les cellules endothéliales (2 heures après SWT: 125,7 ± 10,08, 4 h: 191,73 ± 5,15, 6 h: 400,93 ± 19,62, p <0,05 vs CTR: 103.65 ± 6.18) figure 5A.
Un réseau de cytokines a été réalisée 48 heures après le traitement d'analyser principales cytokines inflammatoires IL-6 (59,97 ± 1,24, p <0,05 vs CTR 19,00 ± 0,44) et IL-8 (71,89 ± 1,52, p <0,05 vs 0,87 ± 29,50 CTR ) qui sont substantiellement impliqués dans l'angiogenèse précoce. Tous deux ont été augmenté de façon significative dans le groupe de traitement comme le montre le tableau de cytokines figure 5C et après quantification Figure 5D.
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Figure 1. Ondes de choc appliqués directement sur un flacon de culture cellulaire. Près de 99% des ondes se traduit à la paroi arrière du ballon provoquant ainsi des perturbations physiques des cellules et des vagues à venir. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Phase-shift de vagues à l'eau au passage de l'air. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3. L'interférence entre running back et vagues peuvent se produire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Représentant le bain d'eau IVSWT avec la description des parties les plus importantes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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La figure 5 (A) des cellules HUVEC stimulées avec du TLR-3 agoniste et de l'ARN la structure analogue Poly.. (I: C) et (B) Tie-2 expression de l'ARNm de l'onde de choc a stimulé des cellules HUVEC montrant clairement une augmentation significative de la prolifération des cellules de données sont données comme expression relative de l'ARNm, moyenne ± SEM. (C) les résultats de réseau de cytokine montrant une augmentation des taux d'IL-6 et IL-8. (D) représentant la quantification des résultats (densité de pixels) du réseau des cytokines, moyenne ± SEM. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 6. Schéma d'essai pilote pour identifier les paramètres de traitement parfaites pour le type de cellule spécifique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
La signification du modèle proposé pour le traitement in vitro de l'onde de choc dans le fait que les ondes peuvent se propager après le passage de la culture cellulaire, contrairement à des modèles existants. Ainsi, les effets physiques inquiétants tels que les forces de traction peuvent être évités. Le modèle ressemble plus étroitement les conditions in vivo que celle de l'application d'autres vagues de leurs flacons de culture cellulaire directement.
Un avantage supplémentaire est la possibilité de faire varier la distance entre la source et les cellules de l'onde de choc. Ceci ne serait pas possible si le traitement d'un flacon de culture directement. Cependant, in vivo il des différences dans la distance entre l'applicateur et la zone cible, en fonction de la profondeur à l'intérieur du tissu cible est. Dans le même temps, on peut étudier l'effet des cellules se trouvant dans des positions spécifiques à la mise au point de la vague.
Mener premières expériences
Selon notre expérience avec cardiomyocytes, des cellules endothéliales, des fibroblastes et des cellules souches, chaque type de cellule a besoin de ses paramètres de traitement spécifiques. Nous vous recommandons donc fortement d'un essai pilote pour l'évaluation des paramètres de traitement adéquates avant d'effectuer les expériences souhaitées. Cette étude pilote a besoin d'inclure des distances différentes entre l'applicateur d'onde de choc et l'échantillon ainsi que les différentes densités de flux d'énergie. Devrait également être établi le nombre le plus approprié d'impulsions. La fréquence de l'application des ondes de choc est toujours un sujet de préoccupation - même in vivo. Un protocole approprié pour un paramètre de traitement à trouver essai pilote est fourni en supplément la figure 6.
L'utilisation de la cuve de culture idéal est d'une grande importance pour la réussite de l'expérience. Nous préférons des flacons de culture de cellules ordinaires de n'importe quelle taille. Cependant, il peut y avoir des raisons d'utiliser d'autres navires - par exemple avoir besoin de plus petits volumes pour remplir complètement le navire pendant une onde de chocpplication. Les matériaux appropriés d'un point de vue acoustique sont PE (Z = 1'760'000 Ns / m 3), caoutchouc souple (Z = 1'270'000 Ns / m 3), polyamide (Z = 1'960'000 Ns / m 3). Moins idéal est en PVC (3'270'000 Ns / m 3) Plexiglas (Z = 3'260'000 Ns / m 3) delrin (3'450'000 Ns / m 3), le polycarbonate (2'770'000 Ns / m 3) ou de polypropylène (2'400'000 Ns / m 3). Matériaux durs tels que le verre ou le métal ne doivent pas être utilisés.
Les étapes critiques
Définition de la distance entre la source d'ondes de choc et l'échantillon peut être assez délicat. La raison en est que la source (par exemple électrode conseils à un système électro-hydraulique) est situé à l'intérieur de l'applicateur. Par conséquent, il est nécessaire de connaître la distance de la source à l'enveloppe des applicateurs. Vous pourriez avoir à demander au fabricant du dispositif de l'onde de choc.
Un inconvénient de ce modèle est le fait que la culture cellulaire flacon doit êtrerempli de milieu de culture. Remplissage des flacons de culture de cellules, par exemple implique une consommation accrue et coûteuse du milieu de culture. Outre les coûts, ce fait signifie également que tout ce que les cellules sécrètent est fortement dilué. La détection de molécules obtient donc beaucoup plus difficile en raison d'une diminution de la concentration. Par conséquent, nous avons commencé à utiliser des filtres de protéines pour la centrifugation et augmenter encore la concentration de ce fait.
Outre l'utilisation de différents types de flacons de culture cellulaire comme décrit ci-dessus, la modification principale de IVSWT est son utilisation pour la culture de tissus et modèles ex vivo. En particulier, notre groupe a testé avec des résultats parfaits dans le dosage de l'aorte anneau de l'angiogenèse 10. Cela signifie qu'il est possible de maintenir tout type de tissus d'organes ou de greffes de tissus d'ingénierie dans le bain d'eau IVSWT. Ex vivo l'application d'ondes de choc donc à l'avenir pourraient être utilisés pour améliorer différents types de méthodes d'ensemencement des cellules sur les greffes d'ingénierie.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Reiner Schultheiss et Wolfgang Schaden pour leur inspiration pour ce modèle. Nous remercions également Christian Dorfmüller pour ses tous temps des efforts considérables pour soutenir notre recherche.
Un grand merci à Robert Göschl et Hans Hohenegger pour la réalisation technique rigoureuse de nos idées!
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orthogold shock wave device | Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA – manufactured by MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany | ||
| IVSWT Water Bath V2.0 | Johann Hohenegger - Technical Products | ||
| EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl. & Growth Factors | Lonza | CC-3156 & CC-4176 | This medium was used for the shown experiments with HUVECs to fill the cell culture flask. For other cell types, use the recommended medium. |
| Pechiney Parafilm M PM996 | Pechiney Plastic Packaging | PH-LF-PM996-EA at labplanet.com | for sealing flasks |
| Falcon Serological pipettes 25 ml | Becton Dickinson Labware | 357525 | |
| CellMate II Serological Pipette | Matrix Technologies | ||
| Skintact Ultrasonic Gel | Skintact | UL-01 250 ml | |
| T25 Cell culture flasks | COSTAR | 3056 | |
| Mikrozid disinfectant | Schülke | ||
| 3.5 L Degassed water | |||
| Paper towels |
References
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