Summary
冲击波现在是众所周知的再生效果。因此， 在体外实验中面临着越来越大的兴趣。因此，我们开发了一个模型体外冲击波试验（IVSWT），使我们能够在体内条件，从而避免分散注意力的物理效应模拟。
Abstract
冲击波现在是众所周知的再生效果。基础研究的成果表明，冲击波也引起生物刺激靶细胞或组织没有任何后续的损害。因此， 在体外实验中面临着越来越大的兴趣。施加冲击波到细胞培养物中的各种方法进行了描述。一般来说，所有现有车型集中在如何最好地运用冲击波到细胞。
但是，这个问题仍然是：通过细胞培养后发生了什么浪？细胞培养基中的声阻抗与空气的区别在于高，即99％以上的冲击波被反射！因此，我们开发了一个模型，主要由树脂玻璃建造的集装箱，使波通过细胞培养后，在水中传播的。这就避免了空化效应，以及，否则将扰乱即将到来的那些波的反射。无线日这个模型，我们能够模拟体内条件，从而获得关于如何冲击波的物理刺激被转换为生物细胞信号（“机械传导”）越来越多的知识。
Introduction
冲击波是从能源， 如突然释放所产生的声压波。如打雷时，闪电。在医学上的冲击波已经使用了30多年的碎石治疗肾结石的解体。由于骨骼增厚偶然发现在碎石患者在20世纪80年代初，第一次进行了研究，以评估骨愈合1冲击波治疗（SWT）的效果。长骨骨不连愈合改善令人印象深刻的结果可以观察到2。随后，适应症扩大到软组织伤口3。基础研究的成果表明，冲击波也引起生物刺激靶组织没有任何后续的损害。的血管生长因子（VEGF 例如 ，的PlGF，FGF）发行其次是显著的血管生成。这导致适应症对缺血性病变进一步扩大。本集团与其他人表现的积极EFF抽搐SWT对缺血性心脏疾病的动物模型中以及在临床试验4-6。
然而，如何SWT的物理刺激被翻译成的生物信号（机械传导）的确切机制仍然知之甚少。从医学不断增加几个字段在SWT的利益，追求的机制越来越激烈。因此， 体外冲击波实验是越来越重要。除了 减少的动物实验和成本效益， 体外冲击波治疗（IVSWT）的最大优势可能是学习某一细胞类型的特定行为的可能性。在冲击波介导的组织再生最有可能被治疗组织的所有细胞都参与其中，甚至全身作用进行了讨论。然而，不同的细胞类型中起着特殊的作用，有其自身固有的功能。 IVSWT使我们能够检测到这种特殊功能的ND从而使我们更好地理解复杂的基本流程。
今天的关于细胞培养冲击波的影响的认识，包括增加增殖，改变细胞膜受体，增加和细胞分化的加速，生长因子和化学引诱剂释放以及增加细胞迁移7-9。
在体外模型施加冲击波到细胞培养物中的各种方法中最令人分心的物理效应进行了描述。这一事实导致了它是非常难以比较的结果，如细胞刺激身体条件这些模型之间完全不同的问题。一般来说，所有现有车型集中在如何最好地运用冲击波到细胞。
但是，这个问题仍然是：通过细胞培养后发生了什么浪？主要的问题在于，所述声的差细胞培养基和环境空气的阻抗是高的，即99％以上的冲击波被反射图1。
由于在两种介质的声阻抗的差异波不仅反映但相移为180°时产生强的拉力向细胞图2。
声阻抗被定义为材料的密度和它的产品声速Z =ρX C。对于水的声阻抗是ZWater = 1440000 Ns个/ m 3时，对空气，只有420纳秒/米3。这两个值的巨大差异导致了冲击波的反射和相移。相移变成正压脉冲成拉伸波。
即使这样的拉伸力是不会伤害到细胞内，它干扰了模仿在体外体内冲击波影响的想法。 体内这些拉力很难由于大身体结构发生。
此外，行波后面甚至可以打扰传入的。这可能会引起干扰。两种类型的干扰是已知的。建设性的干扰是指两个波被添加，从而导致了一倍振幅图3。如果波相遇截然相反的发生破坏性干扰。它会导致波的取消（ 图3）。因此，IVSWT需要一个模型，使冲击波通过细胞培养后进行传播。
IVSWT水浴
按照上面提到的顾虑考虑导致我们设计的水浴中，以避免所描述的问题的图4。基本上，它包括一个有机玻璃的内置容器用膜来连接各种冲击波施加器。对于这种膜和涂敷超声传输格之间的耦合升已被使用。水浴填充脱气的水，以避免气蚀，如果气体中的水固溶会发生的。加热器在底部有温度传感器连接到控制单元使得能够调节温度为模仿体内条件和避免细胞培养的过程中，以进行冷却。温度可维持在37℃以下，因为它是在培养箱中进行。为细胞样品持有人允许任何浸入一种文化烧瓶或试管的。由此，试样容器需要被完全装满培养基，因为气泡会阻止冲击波！甲楔形吸收体在沐浴的后壁解构，为了不被反射并运行回，以避免干扰波。
进一步的优点与其他IVSWT模型是不同的涂抹器和培养瓶之间的距离的可能性。谁使用这种模式显然是我们小组的研究结果和其他怎么每个细胞类型的反应非常明确不同的治疗参数。此外，限定了波的源和样品之间的距离是至关重要的，因为它使我们能够控制细胞是在相对于冲击波施加器的焦点的特定位置。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
道德许可
取得患者的书面知情同意书后，脐带从在妇产科学系剖腹产的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中分离获得。权限是从因斯布鲁克医科大学（编号：UN4435）伦理委员会给出。
1，准备IVSWT水浴
- 制备3.5升的自来水在适当的容器。水需要被加热到37°C（见协议6）。
- 水填充入水浴，直到水位大约为3厘米以下的优势。心灵完全覆盖水的膜。这将需要大约准备3.5 L。
- 将温度传感器连接到电源。
- 把传感器放到预期的拟合置水浴上的后墙。
- 连接加热至温度传感器的电源。没有不要这样做水在浴中的加热器将熔融树脂玻璃。
- 等到水温达到37°C的温度稳定与某种棍定期搅水，以保证整个水浴恒温。
2，准备和细胞培养瓶
- 种子细胞在晚上直接，直到他们达到所需的汇合在T25培养瓶或培养的细胞在培养瓶所需的密度。
- 在实验前，垂直对齐的烧瓶中。
- 填补了培养瓶用培养液，直到下方脖子。不要填写太多的介质进入接触到颈部或封闭盖的瓶为介质将受到污染。
- 用螺丝固上限瓶无过滤器，以防止污染的水。记住，水在浴室和浴缸本身不是无菌的。
- 插入水中洗澡前用封口膜密封的瓶盖。 <李>修复密封培养瓶在所提供的立场。
- 将固定烧瓶放入水浴中。注意使细胞培养烧瓶的中间是在同一高度上的冲击波施加器的膜的中央。 A线在洗澡的侧面引导你。
3，定义处理参数
- 定义冲击波源和样品之间的距离。通过进行该参数的发现导频实验如在图6中所述确定理想的治疗参数。
- 选择冲击波设备上正确的治疗参数（能量密度，频率）。再次，参考图6。
4，冲击波的应用
- 把市售的超声波传输胶量充足的冲击波敷贴以及置水浴上的膜。这是为了保证耦合。没有空气或气泡应该施加器和膜之间的它会吸收冲击波。
- 连接敷贴到膜上，并保持稳定的膜的中央。请注意，这是水平对齐。
- 确保水浴内探头的正确的垂直位置与所述指示标记在恒温槽的侧线。
- 保持在一个水平行中的敷贴器，将烧瓶稳定的中心。
- 激活冲击波装置和应用该脉冲，同时保持培养瓶中，以及在整个手术过程中稳定的位置的敷贴。
5，治疗后
- 就拿培养瓶中出来的水洗澡。
- 与普通纸巾擦干。
- 准确地擦拭量瓶中，用消毒剂。
- 除去封口膜密封帽。
- 吸管中的烧瓶内到离心管中。
- 离心机适当。离心参数取决于所用的细胞类型，
- 加细胞培养基5ml的烧瓶中。重悬离心细胞沉淀用2ml细胞培养基。移液器的悬浮液加入到烧瓶中。因此，可能在治疗过程中已脱落细胞碎片或细胞不迷路。
陷阱
- 制剂以及治疗应进行层流内的无菌条件下，以避免细胞培养物污染。
- 良好的细胞培养实践建议，以避免探针的污染。特别是瓶外的消毒，强烈建议把他们带回孵化器之前。水浴，以及里面的水，是没有出息！
- 不要将加热器连接到电源，除非水浴是装满了水，以免损坏内置浴有机玻璃。
- 使用超声波凝胶的数额慷慨的冲击波APPLicator以保证正确的耦合和波的传播进入浴缸。空气，甚至小气泡做吸收冲击波！
- 检查水浴相对于敷贴器内的探针的位置，以确保治疗的整个生长区域。
- 不要扣篮探头插入过深的水，以避免污染。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
使用我们应用的冲击波，以人脐静脉内皮细胞所描述的方法（内皮细胞），我们前述隔离脐带。脐带从选修剖腹产获得。
脐静脉内皮细胞均在90％的汇合在一个T25细胞培养瓶中用液电冲击波治疗系统治疗。治疗参数为0.1毫焦耳/ 平方毫米和5 Hz的频率的能量通量密度。 300冲动被应用从5厘米的冲击波源的距离的细胞层。
的Tie-2的基因表达（免疫球蛋白样和EGF样结构域酪氨酸激酶2）mRNA的实时荧光定量PCR分析测定。这是显著上调，随着时间的推移（2小时后SWT：156.75±14.49，4 小时：141.03±9.71，6小时：166.68±2.15，P <0.05与点击率：100.03±7.5） 图5B。这种血管生成素受体直接给出提示内皮ç ELL扩散，是他们对血管生成能力的指标。作为阳性对照，我们使用的聚（I：C）（聚肌苷酸胞苷酸），作为一个RNA的结构类似物是众所周知的刺激内皮细胞（2小时后SWT：125.7±10.08，4小时：191.73±5.15，6小时：400.93 ±19.62，P <0.05与点击率：103.65±6.18） 图5A。
被执行的细胞因子阵列处理48小时后，分析主要的炎性细胞因子IL-6（59.97±1.24，P <0.05与CTR 19.00±0.44）和IL-8（71.89±1.52，P <0.05与CTR 29.50±0.87 ），它们主要涉及早期血管生成。两治疗组中均显著增加所表现出的细胞因子的阵列图5C和量化后图5D。
ighres.jpg“SRC =”/ files/ftp_upload/51076/51076fig1.jpg“/>
图1。冲击波直接应用到细胞培养瓶中，近99％的波在烧瓶从而造成物理干扰细胞和即将到来波的后墙得到体现 。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：在水气通道相移波。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
ontent宽度=“5英寸”FO：SRC =“/ files/ftp_upload/51076/51076fig3highres.jpg”SRC =“/ files/ftp_upload/51076/51076fig3.jpg”/>
运行，并可能出现入射波背部之间如图3所示。干扰。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
图4描绘了IVSWT水浴中最重要的部分描述。 请点击此处查看该图的放大版本。
es/ftp_upload/51076/51076fig5highres.jpg“SRC =”/ files/ftp_upload/51076/51076fig5.jpg“/>
图5与TLR-3激动剂和RNA的结构类似物聚刺激（A）内皮细胞。（I：C）和（B）的Tie-2 mRNA的冲击波刺激的HUVECs清楚地描绘细胞增殖数据显著增加表达式给出作为相对mRNA表达，平均值±SEM表示。细胞因子阵列示出的IL-6和IL-8水平的提高（C）的结果（D）示出了从细胞因子阵列结果（像素密度）的量化，平均值±SEM表示。 * P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001 请点击这里查看该图的放大版本。
6/51076fig6highres.jpg“SRC =”/ files/ftp_upload/51076/51076fig6.jpg“/>
图6。计划试点试验，以确定最佳的治疗参数为特定的细胞类型。 请点击此处查看该图的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
该模型用于体外冲击波治疗的意义是，波可以通过细胞培养而相比之下，现有的模型后传播。由此，能够避免干扰物质的影响，如拉力。该模型由他人直接涂布波到其细胞培养瓶更接近于体内条件比。
一个附加的优点是不同冲击波源和细胞之间的距离的可能性。这将是不可能的，如果直接处理的培养烧瓶中。然而， 体内存在的涂抹器与目标区域之间的某些差异的距离，这取决于如何深靶组织内的。在同一时间可以研究细胞中的特定位置，以波的聚焦点是的效果。
进行第一次实验
根据我们与CA的经验rdiomyocytes，内皮细胞，成纤维细胞和干细胞，每个细胞类型需要其具体的治疗参数。因此，我们在进行所需的实验之前，强烈建议试点试验的适当治疗参数的评估。此预试验需要包括冲击波施加器和样品以及不同的能量通量密度之间的不同距离。也脉冲的最适当的数量应该建立。施加冲击波的频率仍是令人关注的问题-即使是在体内 。合适的协议，用于处理参数找到初步试验是作为一个补充图6。
使用的理想培养容器是非常重要的实验的成功。我们喜欢的任何大小的普通细胞培养瓶中。然而，有可能是理由使用其他船只- 例如需要更小的体积为在冲击波完全填充的容器应用的研究。但从声学角度合适的材料是聚乙烯（Z = 1'760'000 Ns个/米3），软橡胶（Z = 1'270'000 Ns个/米3），聚酰胺（Z = 1'960'000 NS /米3）。不太理想的是聚氯乙烯（3'270'000 Ns个/米3）有机玻璃（Z = 3'260'000 Ns个/米3）聚甲醛（3'450'000 Ns个/米3）的聚碳酸酯（2'770'000 NS /米3）或聚丙烯（2'400'000 Ns个/米3）。硬的材料，如玻璃或金属，不得使用。
关键步骤
定义冲击波源与样品之间的距离可以是相当棘手的。其原因是，在源（ 例如，电极的电动液压系统中的提示）位于所述施放器内。因此，有必要知道从源到喷头地幔的距离。您可能要问的冲击波设备的制造商。
这种模式的一个缺点是，在细胞培养瓶中需要的事实充满培养基。填充例如细胞培养瓶中暗示培养基的一种增加的和昂贵的消费。除了成本，这一事实也意味着，无论细胞分泌强烈稀释。检测分子因此得到，因为降低的浓度的要困难得多。因此，我们开始使用蛋白过滤器，离心分离，从而再次增加浓度。
除了 使用不同类型的细胞培养物小瓶，如上所述，主要修改为IVSWT是其用于组织培养和体外模型。特别是，我们组在主动脉环血管生成检测10完美的效果进行了测试。这意味着，它可以容纳任何类型的器官组织或组织工程移植物的插入IVSWT水浴中。 体外冲击波因此应用在未来可能用于改善不同种的工程化移植物细胞接种方法。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
作者感谢莱纳Schultheiss和沃尔夫冈沙登他们的灵感为这个模型。我们也感谢基督教Dorfmüller他所有的时间了巨大的努力，以支持我们的研究。
非常感谢罗伯特Göschl和汉斯Hohenegger仔细的技术实现我们的想法！
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orthogold shock wave device | Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA – manufactured by MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany | ||
| IVSWT Water Bath V2.0 | Johann Hohenegger - Technical Products | ||
| EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl. & Growth Factors | Lonza | CC-3156 & CC-4176 | This medium was used for the shown experiments with HUVECs to fill the cell culture flask. For other cell types, use the recommended medium. |
| Pechiney Parafilm M PM996 | Pechiney Plastic Packaging | PH-LF-PM996-EA at labplanet.com | for sealing flasks |
| Falcon Serological pipettes 25 ml | Becton Dickinson Labware | 357525 | |
| CellMate II Serological Pipette | Matrix Technologies | ||
| Skintact Ultrasonic Gel | Skintact | UL-01 250 ml | |
| T25 Cell culture flasks | COSTAR | 3056 | |
| Mikrozid disinfectant | Schülke | ||
| 3.5 L Degassed water | |||
| Paper towels |
References
- Haupt, G., Haupt, A., Ekkernkamp, A., Gerety, B., Chvapil, M. Influence of shock waves on fracture healing. Urology. 39, 529-532 (1992).
- Schaden, W., Fischer, A., Sailler, A. Extracorporeal shock wave therapy of nonunion or delayed osseous union. Clin. Orthop. Relat. Res. 387, 90-94 (2001).
- Schaden, W., et al. Shock wave therapy for acute and chronic soft tissue wounds: a feasibility study. J. Surg. Res. 143, 1-12 (2007).
- Tepeköylü, C., et al. Shock wave treatment induces angiogenesis and mobilizes endogenous CD31/CD34-positive endothelial cells in a hindlimb ischemia model: Implications for angiogenesis and vasculogenesis. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 146, 971-978 (2013).
- Nishida, T., et al. Extracorporeal cardiac shock wave therapy markedly ameliorates ischemia-induced myocardial dysfunction in pigs in vivo. Circulation. 110, 3055-3061 (2004).
- Fukumoto, Y., et al. Extracorporeal cardiac shock wave therapy ameliorates myocardial ischemia in patients with severe coronary artery disease. Coron. Artery Dis. 17, 63-70 (2006).
- Gotte, G., Amelio, E., Russo, S., Marlinghaus, E., Musci, G., Suzuki, H. Short-time non-enzymatic nitric oxide synthesis from L-arginine and hydrogen peroxide induced by shock waves treatment. FEBS Lett. 520, 153-155 (2002).
- Wang, F. S., Wang, C. J., Huang, H. J., Chung, H., Chen, R. F., Yang, K. D. Physical shock wave mediates membrane hyperpolarization and Ras activation for osteogenesis in human bone marrow stromal cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 287, 648-655 (2001).
- Mittermayr, R., et al. Extracorporeal shock wave therapy (ESWT) minimizes ischemic tissue necrosis irrespective of application time and promotes tissue revascularization by stimulating angiogenesis. Ann. Surg. 253, 1024-1032 (2011).
- Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat. Protoc. 22, 89-104 (2011).
