Summary
Schokgolven tegenwoordig bekend om hun regeneratieve effecten. Daarom in vitro experimenten zijn van toenemend belang. We hebben daarom een model ontwikkeld voor in vitro schokgolf trials (IVSWT) die ons in staat stelt om na te bootsen in vivo omstandigheden waardoor storende fysieke effecten te vermijden.
Abstract
Schokgolven tegenwoordig bekend om hun regeneratieve effecten. Fundamenteel onderzoek bevindingen bleek dat schokgolven veroorzaken een biologische prikkel om cellen of weefsel te richten zonder eventuele gevolgschade. Daarom, in vitro experimenten van toenemend belang. Verschillende methoden voor het aanbrengen schokgolven op celkweken beschreven. In het algemeen, alle bestaande modellen richten op hoe schokgolven beste toepassen op cellen.
Echter, deze vraag blijft: Wat gebeurt er met de golven na het passeren van de celkweek? Het verschil van de akoestische impedantie van het celkweekmedium en de lucht is zo hoog, dat meer dan 99% van schokgolven gereflecteerd! We hebben daarom een model ontwikkeld dat voornamelijk bestaat uit een plexiglas gebouwde container die het mogelijk maakt de golven te verspreiden in het water na het passeren van de celkweek. Dit voorkomt cavitatie effecten evenals reflectie van de golven die anders nog te houden zou verstoren. With dit model zijn we in staat om in vivo omstandigheden na te bootsen en zo krijgen meer en meer kennis over hoe de fysieke prikkel van schokgolven wordt vertaald in een biologische cel-signaal ("mechanotransduction").
Introduction
Schokgolven zijn geluidsdrukgolven die voortvloeien uit een plotseling vrijkomen van energie, bijvoorbeeld. als donder bij bliksem. In de geneeskunde schokgolven worden al meer dan 30 jaar Lithotripsie de desintegratie van nierstenen. Aangezien de incidentele vaststelling van iliacale bot verdikking bij Lithotripsie patiënten in de vroege jaren 1980, werd eerste studies uitgevoerd om het effect van drukgolfbehandeling (SWT) op botgenezing 1 evalueren. Indrukwekkende resultaten van een betere genezing van de lange bot nonunions kon worden waargenomen 2. Vervolgens werden aanwijzingen uitgebreid zacht weefsel wonden 3. Fundamenteel onderzoek bevindingen bleek dat schokgolven veroorzaken een biologische prikkel om het te onderzoeken weefsel zonder eventuele gevolgschade. Vrijgave van angiogene groeifactoren (bijvoorbeeld VEGF, PlGF, FGF) wordt gevolgd door aanzienlijke angiogenese. Dit leidde tot een verdere uitbreiding van indicaties naar ischemische pathologieën. Onze groep en anderen toonden de positieve effect van SWT op ischemische hartziekte in diermodellen als in klinische studies 4-6.
Echter, het exacte mechanisme van hoe de fysieke prikkel van SWT wordt vertaald in een biologisch signaal (mechanotransduction) blijft grotendeels onbekend. Omdat de belangstelling voor SWT uit verschillende gebieden van de geneeskunde neemt voortdurend toe, is de zoektocht naar het mechanisme steeds meer en intenser. Daarom worden in vitro schokgolf experimenten steeds belangrijker. Naast vermindering van dierproeven en kosteneffectiviteit, kan het grootste voordeel van in vitro schokgolf behandeling (IVSWT) de mogelijkheid van het bestuderen van de specifieke werking van een bepaald type cel. In schokgolf gemedieerde weefselregeneratie waarschijnlijk alle cellen van het behandelde weefsel betrokken zijn, zelfs systemische effecten besproken. Toch heeft elk type cel speelt een specifieke rol en heeft een eigen intrinsieke functie. IVSWT stelt ons in staat om deze specifieke functie een te detecterennd daardoor geeft ons een beter begrip van de complexe onderliggende processen.
Kennis van vandaag over effecten schokgolf op celculturen omvat de toename van proliferatie, wijziging van celmembraanreceptoren, verhoging en versnelling van celdifferentiatie, afgifte van groeifactoren en chemo-lokstoffen evenals verhoogde cel migratie 7-9.
Storende fysieke effecten meeste in vitro modellen Verschillende methoden voor het aanbrengen schokgolven op celkweken beschreven. Dit feit leidt tot het probleem dat het zeer moeilijk resultaten te vergelijken, zoals lichamelijke toestand van cel stimulatie heel verschillend tussen deze modellen. In het algemeen, alle bestaande modellen richten op hoe schokgolven beste toepassen op cellen.
Echter, deze vraag blijft: Wat gebeurt er met de golven na het passeren van de celkweek? Het grootste probleem is dat het verschil in de akoestischeimpedantie van het celkweekmedium en de omgevingslucht is zo hoog, dat meer dan 99% van schokgolven gereflecteerd Figuur 1.
Door het verschil in akoestische impedantie van de twee media de golven niet alleen terug, maar een faseverschuiving van 180 ° komt die een sterke trekkrachten aan de cellen Figuur 2.
Akoestische impedantie wordt gedefinieerd als het product van de dichtheid van een materiaal en de geluidssnelheid Z = ρ x c. Voor water de akoestische impedantie is ZWater = 1440000 Ns / m 3, voor de lucht is het slechts 420 Ns / m 3. Het grote verschil tussen deze twee waarden resulteert in reflectie en faseverschuiving van schokgolven. De faseverschuiving blijkt een positieve druk puls in een trek-golf.
Hoewel deze trekkracht niet schadelijk voor de cellen, het interfereert met het idee nabootsen in vivo schokgolf effecten in vitro. In vivo dezetrekkrachten nauwelijks optreden als gevolg van grote lichaamsstructuren.
Bovendien kan de achterkant loopt golven zelfs verstoren de inkomende Ones. Dit kan storingen veroorzaken. Twee soorten storingen bekend. Constructieve interferentie betekent dat beide golven worden toegevoegd hetgeen resulteert in een verdubbeling amplitude Figuur 3. Destructieve interferentie treedt op als golven ontmoeten lijnrecht tegenover elkaar. Het veroorzaakt afschaffing van golven (Figuur 3). Daarom IVSWT moet een model dat schokgolven kunnen voortplanten na het passeren van de celkweek.
IVSWT waterbad
Overwegingen naar aanleiding van de bovengenoemde bezwaren leiden ons naar een waterbad voor het vermijden van het ontwerp van de beschreven problemen Figuur 4. Kortom, het bestaat uit een plexiglas gebouwde container met een membraan om elk soort schokgolf applicator verbinden. Voor koppeling tussen dit membraan en de applicator ultrageluidtransmissie geIk moet worden gebruikt. Het waterbad is gevuld met ontgast water cavitatie die zou optreden als gas werd soluted in het water te vermijden. Een kachel bij de bodem met een temperatuursensor verbonden met een regeleenheid stelt om gedurende imitatie van in vivo omstandigheden reguleren en celculturen vermijden tijdens de procedure afkoelen. De temperatuur kan stabiel worden gehouden op 37 graden Celsius als het wordt gedaan in een incubator. Een houder voor de cel monsters zorgt voor het onderdompelen van elke vorm van cultuur fles of buis. Daarbij moet het monster vaartuig volledig worden gevuld met kweekmedium, zoals luchtbellen schokgolven zouden blokkeren! Een wigvormige absorber aan de achterwand van het bad vernietigt golven om niet gereflecteerd en ren terug om interferentie te voorkomen.
Een verder voordeel van andere IVSWT modellen is de mogelijkheid van het variëren van de afstand tussen de applicator en de cultuur kolven. Bevindingen van onze groep en anderen die gebruik maken van dit model duidelijk ishoe dat elk type cel reageert zeer specifiek naar verschillende behandeling parameters. Bovendien bepalen de afstand tussen de bron van de golven en het monster is belangrijk omdat hiermee de cellen te controleren om op een bepaalde positie ten opzichte van de focus van de schokgolf applicator.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethische toestemming
Na het verkrijgen van informed consent van de patiënten, werden navelstrengen verkregen van een keizersnede op de afdeling Gynaecologie voor isolatie van humane navelstreng endotheel cellen (HUVEC). Toestemming werd gegeven van de ethische commissie van de Medische Universiteit van Innsbruck (nr. UN4435).
1. Bereid de IVSWT Water Bath
- Bereid 3.5 L van leidingwater in een geschikte tank. Water moet worden verwarmd tot 37 ° C (zie Protocol nr. 6).
- Vul het water in het waterbad totdat het waterpeil ongeveer 3 cm onder de rand. Erg om volledig te bedekken het membraan met water. Dit zal ongeveer de voorbereide 3,5 L. vereisen
- Sluit de temperatuursensor op de voeding.
- Plaats de sensor in de bedoelde bevestiging op de achterwand van het waterbad.
- Sluit verwarming tot voeding van de temperatuursensor. Doe dit niet zonderwater in het bad als de verwarming zou het plexiglas smelten.
- Wacht tot het water een stabiele temperatuur van 37 ° C heeft bereikt Roer het water regelmatig met een soort stok om een constante temperatuur in het waterbad te garanderen.
2. Bereid Cellen en cultuur Kolven
- Zaadcellen overnacht op gewenste dichtheid in T25 kweekkolven of kweek van de cellen in de kolven direct tot zij de gewenste samenvloeiing bereikt.
- Voor het experiment, lijnt de kolven verticaal.
- Vul de cultuur kolven met kweekmedium tot vlak onder hun nek. Vul niet te veel medium in de kolven als medium in contact met de nek of de afsluitdop zou besmet raken.
- Schroef de kolven met stevige kappen zonder filters om besmetting te voorkomen van water. Let erop dat het water in het bad en het bad zelf zijn niet steriel.
- Sluit de doppen met Parafilm vóór het inbrengen in het waterbad. <li> Fix verzegeld kweekflessen in de meegeleverde voet.
- Steek vaste kolf in het waterbad. Zorg ervoor dat het midden van de celkweek kolf ligt op dezelfde hoogte als het centrum van het membraan schokgolf applicator. Een lijn aan de zijkant van het bad begeleidt u.
3. Definieer Behandeling Parameters
- Definieer afstand tussen schokgolf bron en voorbeeld. Identificeer perfecte behandeling parameters uitvoering van de parameter conclusie proefproject zoals beschreven in figuur 6.
- Kies de juiste behandeling parameters (energie fluxdichtheid, frequentie) op de schokgolf apparaat. Nogmaals, zie figuur 6.
4. Shock Wave Toepassing
- Zet tal hoeveelheden commercieel verkrijgbare ultrasone transmissie gel op de schokgolf applicator en op het membraan van het waterbad. Dit is om koppeling te verzekeren. Geen lucht of luchtbellen moet tussen de applicator en het membraan alshet zou schokgolven absorberen.
- Sluit applicator aan het membraan en houd het stabiel in het midden van het membraan. Zorg ervoor dat het horizontaal is uitgelijnd.
- Zorg ervoor dat de juiste verticale positie van de sonde in het waterbad is in lijn met de aangegeven markering aan de zijkant van het bad.
- Houd centra van de applicator en de kolf stabiel in een horizontale lijn.
- Activeer de schokgolf apparaat en de impulsen passen terwijl de kolf en de applicator in een stabiele positie tijdens de hele procedure.
5. Na behandeling
- Neem de kolf uit het waterbad.
- Droog het met gewone papieren handdoeken.
- Veeg de kolf nauwkeurig met desinfecterende middelen.
- Verwijder Parafilm afdichting en cap.
- Pipetteer het medium in de kolven in centrifugale buizen.
- Centrifugeren gepast. Centrifugeren parameters afhankelijk van het gebruikte celtype,
- 5 ml celcultuurmedium Voeg aan de kolf. Resuspendeer de celpellet gecentrifugeerd met 2 ml celkweekmedium. Pipetteer de suspensie in de kolf. Zo hoeft cel fragmenten of cellen die tijdens de behandeling kunnen zijn losgemaakt niet verdwalen.
Valkuilen
- Bereiding en behandeling moet onder steriele omstandigheden in laminaire stroming geschieden dat verontreiniging van de celkweek te voorkomen.
- Goede celkweek praktijk wordt aanbevolen om verontreiniging van de probes voorkomen. In het bijzonder desinfectie van de buitenkant van de kolven wordt sterk aanbevolen alvorens ze terug naar de incubator. Het waterbad, evenals het water in, is niet steriel!
- Gebruik de kachel niet aan op de stroomvoorziening, tenzij het water bad wordt gevuld met water om schade aan het plexiglas gebouwd bad te voorkomen.
- Gebruik royale hoeveelheden ultrasone gel op de schokgolf applicator om een goede koppeling en golfvoortplanting garanderen in het bad. Lucht en zelfs kleine luchtbelletjes doen absorberen schokgolven!
- Positie van de sondes in het waterbad met betrekking tot de applicator op de behandeling van het gehele groei te garanderen.
- Niet probes dunk te diep in het water om besmetting te voorkomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met de beschreven werkwijze pasten wij schokgolven op humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) die wij hiervoor geïsoleerd uit navelstrengen. Navelstrengen werden verkregen van electieve keizersneden.
HUVECs werden behandeld op een samenloop van 90% in een T25 celkweekkolf met een elektrohydraulische schokgolf therapie systeem. Behandelingsparameters waren een energie fluxdichtheid van 0,1 mJ / mm 2 en een frequentie van 5 Hz. 300 impulsen toegepast op een afstand van 5 cm van de schokgolf bron tot de cellaag.
Genexpressie van Tie-2 (Tyrosine kinase met immunoglobuline-achtige en EGF-achtige domeinen 2) mRNA werd gemeten met behulp van real-time PCR analyse. Het was beduidend omhoog-geregeld in de tijd (2 uur na SWT: 156.75 ± 14.49, 4 uur: 141,03 ± 9.71, 6 uur: 166,68 ± 2,15, p <0,05 vs CTR: 100,03 ± 7.5) Figuur 5B. Dit angiopoietin receptor geeft een directe hint voor endotheliale c ell proliferatie en is een indicator voor hun vermogen tot angiogenese. Als positieve controle gebruikten we Poly (I: C) (polyinosinic polycytidylic acid) dat als een RNA structuur analoog is bekend endotheelcellen (2 h na SWT stimuleert 125.7 ± 10.08, 4 uur: 191,73 ± 5.15, 6 uur: 400,93 ± 19.62, p <0,05 vs CTR: 103,65 ± 6,18) Figuur 5A.
Een cytokine-array werd uitgevoerd 48 uur na de behandeling naar de algemene inflammatoire cytokines analyseren IL-6 (59,97 ± 1,24, p <0,05 vs CTR 19,00 ± 0,44) en IL-8 (71,89 ± 1,52, p <0,05 vs CTR 29.50 ± 0.87 ) die in hoofdzaak betrokken zijn bij vroege angiogenese. Beide waren significant toegenomen in de behandelingsgroep zoals blijkt uit de cytokine matrix Figuur 5C en na kwantificatie Figuur 5D.
ighres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51076/51076fig1.jpg "/>
Figuur 1. Schokgolven aangebracht direct op een celkweek kolf. Bijna 99% van de golven gereflecteerd op de achterwand van de kolf met als gevolg lichamelijke verstoringen van cellen en aankomende golven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Fase-verschuiving van de golven op het water aan de lucht passage. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
NHOUD-width = "5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/51076/51076fig3highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/51076/51076fig3.jpg" />
Figuur 3. Interferentie tussen rug draait en inkomende golven kunnen optreden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Beeltenis van de IVSWT waterbad met beschrijving van de belangrijkste onderdelen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
es/ftp_upload/51076/51076fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51076/51076fig5.jpg "/>
Figuur 5 (A) HUVEC gestimuleerd met de TLR-3 agonist en RNA structuur analoog Poly.. (I: C) en (B) Tie-2 mRNA expressie van schokgolf gestimuleerde HUVEC duidelijk die een significante toename van celproliferatie gegevens zijn relatieve mRNA-expressie, gemiddelde ± SEM. (C) De resultaten van cytokine matrix toont verhoogde niveaus van IL-6 en IL-8. (D) afschilderen kwantificering van resultaten (pixeldichtheid) van cytokine matrix, gemiddelde ± SEM. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
6/51076fig6highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51076/51076fig6.jpg "/>
Figuur 6. Regeling pilot trial om de perfecte behandeling parameters voor het specifiek celtype identificeren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De betekenis van het voorgestelde model voor in vitro drukgolfbehandeling is het feit dat golven kunnen voortplanten na het passeren van de celkweek in tegenstelling tot bestaande modellen. Daardoor kunnen storende fysische effecten zoals trekkrachten worden vermeden. Het model lijkt meer op in vivo omstandigheden dan die door anderen toepassen golven om hun celkweekkolven direct.
Een bijkomend voordeel is de mogelijkheid van het variëren van de afstand tussen schokgolf bron en cellen. Dit zou niet mogelijk zijn als direct behandelen van een kolf. In vivo er bepaalde verschillen in de afstand tussen de applicator en het doelgebied, afhankelijk van hoe diep in het doelweefsel. Tegelijkertijd kan men het effect van de cellen zich op bepaalde posities van de golven focuspunt bestuderen.
Het uitvoeren van eerste experimenten
Volgens onze ervaring met cardiomyocytes, endotheelcellen, fibroblasten en stamcellen, elk celtype heeft zijn specifieke behandeling parameters. Wij raden daarom een pilot voor de beoordeling van de adequate behandeling parameters voor het uitvoeren van de gewenste experimenten. Deze pilot moet verschillende afstanden tussen de schokgolf applicator en het monster evenals verschillende energie fluxdichtheden omvatten. Ook de meest geschikte aantal pulsen worden vastgesteld. De frequentie van de toepassing van schokgolven is nog steeds een punt van zorg - ook in vivo. Een geschikt protocol voor behandeling parameter vinden pilot wordt geleverd als aanvulling Figuur 6.
Het gebruik van het ideale kweekvat van groot belang voor het succes van het experiment. Wij geven de voorkeur gemeenschappelijke celkweekkolven van elke grootte. Bijvoorbeeld om kleinere volumes nodig hebben voor het vaartuig volledig vullen tijdens schokgolf een - Er kunnen echter redenen zijn om andere schepen te gebruikenOEPASSING. Geschikte materialen vanuit een akoestisch oogpunt zijn PE (Z = 1'760'000 Ns / m 3), soft-rubber (Z = 1'270'000 Ns / m 3), polyamide (Z = 1'960'000 Ns / m 3). Minder ideaal is PVC (3'270'000 Ns / m 3) Plexiglas (Z = 3'260'000 Ns / m 3) Delrin (3'450'000 Ns / m 3) polycarbonaat (2'770'000 Ns / m 3) of polypropyleen (2'400'000 Ns / m 3). Harde materialen zoals glas of metaal mogen niet worden gebruikt.
Kritische stappen
Het definiëren van de afstand tussen de schokgolf bron en het monster kan heel lastig. De reden is dat de bron (bijv. elektrodetoppen op een elektro-hydraulisch systeem) ligt binnen de applicator. Daarom moet de afstand van de bron tot de applicators mantel kennen. Het kan zijn dat de fabrikant van de schokgolf apparaat vragen.
Een nadeel van dit model is dat de celkweek flesje moet wordengevuld met kweekmedium. Het vullen van bijvoorbeeld celkweekkolven impliceert een verhoogde en dure consumptie van kweekmedium. Naast de kosten, dit feit betekent ook dat wat de cellen scheiden wordt sterk verdund. Detecteren moleculen wordt derhalve veel moeilijker vanwege een verminderde concentratie. Vandaar dat we begonnen met eiwit filters gebruiken voor centrifugeren en daardoor weer toenemen concentratie.
Naast het gebruik van verschillende soorten celkweek flacons zoals hierboven beschreven, de belangrijkste modificatie voor IVSWT is het gebruik van weefselkweek en ex vivo modellen. In het bijzonder onze groep getest met een perfect resultaat in de aorta ring angiogenese assay 10. Dit betekent dat het mogelijk is om elke vorm van orgaan-weefsel of tissue engineered grafts houden in het IVSWT waterbad. Ex vivo schokgolf applicatie daarom in de toekomst kunnen worden gebruikt om verschillende soort cel zaaien methoden op gemanipuleerde enten verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs danken Reiner Schultheiss en Wolfgang Schaden voor hun inspiratie voor dit model. We danken ook Christian Dorfmüller voor zijn hele tijd enorme inspanningen om ons onderzoek te ondersteunen.
Veel dank aan Robert Göschl en Hans Hohenegger voor een zorgvuldige technische realisatie van onze ideeën!
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orthogold shock wave device | Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA – manufactured by MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany | ||
| IVSWT Water Bath V2.0 | Johann Hohenegger - Technical Products | ||
| EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl. & Growth Factors | Lonza | CC-3156 & CC-4176 | This medium was used for the shown experiments with HUVECs to fill the cell culture flask. For other cell types, use the recommended medium. |
| Pechiney Parafilm M PM996 | Pechiney Plastic Packaging | PH-LF-PM996-EA at labplanet.com | for sealing flasks |
| Falcon Serological pipettes 25 ml | Becton Dickinson Labware | 357525 | |
| CellMate II Serological Pipette | Matrix Technologies | ||
| Skintact Ultrasonic Gel | Skintact | UL-01 250 ml | |
| T25 Cell culture flasks | COSTAR | 3056 | |
| Mikrozid disinfectant | Schülke | ||
| 3.5 L Degassed water | |||
| Paper towels |
References
- Haupt, G., Haupt, A., Ekkernkamp, A., Gerety, B., Chvapil, M. Influence of shock waves on fracture healing. Urology. 39, 529-532 (1992).
- Schaden, W., Fischer, A., Sailler, A. Extracorporeal shock wave therapy of nonunion or delayed osseous union. Clin. Orthop. Relat. Res. 387, 90-94 (2001).
- Schaden, W., et al. Shock wave therapy for acute and chronic soft tissue wounds: a feasibility study. J. Surg. Res. 143, 1-12 (2007).
- Tepeköylü, C., et al. Shock wave treatment induces angiogenesis and mobilizes endogenous CD31/CD34-positive endothelial cells in a hindlimb ischemia model: Implications for angiogenesis and vasculogenesis. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 146, 971-978 (2013).
- Nishida, T., et al. Extracorporeal cardiac shock wave therapy markedly ameliorates ischemia-induced myocardial dysfunction in pigs in vivo. Circulation. 110, 3055-3061 (2004).
- Fukumoto, Y., et al. Extracorporeal cardiac shock wave therapy ameliorates myocardial ischemia in patients with severe coronary artery disease. Coron. Artery Dis. 17, 63-70 (2006).
- Gotte, G., Amelio, E., Russo, S., Marlinghaus, E., Musci, G., Suzuki, H. Short-time non-enzymatic nitric oxide synthesis from L-arginine and hydrogen peroxide induced by shock waves treatment. FEBS Lett. 520, 153-155 (2002).
- Wang, F. S., Wang, C. J., Huang, H. J., Chung, H., Chen, R. F., Yang, K. D. Physical shock wave mediates membrane hyperpolarization and Ras activation for osteogenesis in human bone marrow stromal cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 287, 648-655 (2001).
- Mittermayr, R., et al. Extracorporeal shock wave therapy (ESWT) minimizes ischemic tissue necrosis irrespective of application time and promotes tissue revascularization by stimulating angiogenesis. Ann. Surg. 253, 1024-1032 (2011).
- Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat. Protoc. 22, 89-104 (2011).
