Summary
Chokbølger i dag er kendt for deres regenerative effekter. Derfor in vitro forsøg er af stigende interesse. Vi har derfor udviklet en model for in vitro trykbølge forsøg (IVSWT), der gør os i stand til at efterligne in vivo betingelser og derved undgå distraherende fysiske virkninger.
Abstract
Chokbølger i dag er kendt for deres regenerative effekter. Grundlæggende forskningsresultater viste, at chokbølger forårsager en biologisk stimulus til at målrette celler eller væv uden efterfølgende skader. Derfor in vitro forsøg er af stigende interesse. Der er beskrevet forskellige metoder til at anvende chokbølger på cellekulturer. Generelt fokuserer alle eksisterende modeller på, hvordan man bedst anvender chokbølger på celler.
Men dette spørgsmål er stadig: Hvad sker der med bølgerne efter at have passeret den celle kultur? Forskellen på den akustiske impedans af celledyrkningsmediet og den omgivende luft er så høje, at mere end 99% af chokbølger komme til udtryk! Vi har derfor udviklet en model, der primært består af en plexiglas indbygget beholder, der tillader at bølgerne udbreder sig i vandet efter passage af cellekulturen. Derved undgår kavitation effekter samt afspejling af de bølger, der ellers ville forstyrre kommende dem. With denne model er vi i stand til at efterligne betingelserne i et levende, og derved få mere og mere viden om, hvordan den fysiske stimulus af chokbølger bliver oversat til en biologisk celle signal ("mechanotransduction").
Introduction
Chokbølger er lydtrykbølgerne skyldes en pludselig frigivelse af energi, f.eks. som torden, når lyn. I medicin chokbølger har været anvendt i over 30 år i Lithotripsi til opløsningen af nyresten. Da den tilfældige fund af hoftebenet fortykkelse i litotripsi patienter i begyndelsen af 1980'erne blev de første undersøgelser for at vurdere effekten af trykbølge behandling (swt) på knoglehelingsprocessen 1.. Imponerende resultater af forbedret heling af lange knogler nonunions kunne observeres 2. Efterfølgende blev indikationer udvidet til blødtvævssår 3. Grundlæggende forskningsresultater har vist, at chokbølger forårsager en biologisk stimulus målvævet uden efterfølgende skader. Frigivelse af angiogene vækstfaktorer (f.eks VEGF, PLGF, FGF) er efterfulgt af betydelige angiogenese. Dette førte til en yderligere udvidelse af indikationer i retning af iskæmiske patologier. Vores gruppe og andre viste den positive effect af SWT på iskæmisk hjertesygdom i dyremodeller samt i kliniske forsøg 4-6.
Men den nøjagtige mekanisme for, hvordan den fysiske stimulus af SWT er oversat til et biologisk signal (mechanotransduction) forbliver stort set ukendt. Da interessen for SWT fra flere områder af medicin stiger konstant, er søgen efter den mekanisme bliver mere og mere intens. Derfor er in vitro trykbølge eksperimenter får betydning. Udover reduktion af dyreforsøg og omkostningseffektivitet, kan den største fordel af in vitro trykbølge behandling (IVSWT) være mulighed for at studere den specifikke adfærd af en bestemt celletype. I trykbølge medieret vævsregeneration sandsynligvis alle celler i det behandlede væv er involveret, er selv systemiske effekter diskuteret. Ikke desto mindre, hver celletype spiller en særlig rolle, og har sin egen iboende funktion. IVSWT muligt for os at opdage denne særlige funktion ennd derved giver os en bedre forståelse af de komplekse underliggende processer.
Dagens viden om trykbølge effekter på cellekulturer omfatter forøgelse af spredning, ændring af cellemembranreceptorer, stigning og acceleration af celledifferentiering, frigivelse af vækstfaktorer og kemo-tiltrækningsmidler samt øget celle migration 7-9.
Er blevet beskrevet distraherende fysiske effekter i de fleste in vitro-modeller forskellige metoder til at anvende chokbølger på cellekulturer. Dette forhold fører til det problem, at det er meget vanskeligt at sammenligne resultater, da de fysiske betingelser for cellestimulering er helt anderledes mellem disse modeller. Generelt fokuserer alle eksisterende modeller på, hvordan man bedst anvender chokbølger på celler.
Men dette spørgsmål er stadig: Hvad sker der med bølgerne efter at have passeret den celle kultur? Hovedproblemet er, at forskellen i den akustiskeimpedans celledyrkningsmediet og den omgivende luft er så høje, at mere end 99% af chokbølger komme til udtryk Figur 1.
På grund af forskellen i akustiske impedans af de to medier bølgerne ikke kun afspejles men en faseforskydning på 180 ° opstår resulterer i stærke trækkræfter til cellerne figur 2.
Akustisk impedans er defineret som produktet af densiteten af et materiale og dets lydhastighed Z = ρ x ca. Til vand den akustiske impedans er ZWater = 1.440.000 Ns / m 3, for luft er det kun 420 Ns / m 3. Den store forskel på disse to værdier resulterer i refleksion og faseforskydning af chokbølger. Faseforskydningen viser en positiv trykimpuls i en trækstyrke bølge.
Selv om dette trækkraft er ikke skadeligt for cellerne, det griber ind i tanken om at efterligne in vivo trykbølge effekter in vitro. In vivo dissetrækkræfter næppe forekomme som følge af store strukturer i kroppen.
Endvidere kan igen kører bølger selv forstyrre de indkommende dem. Dette kan forårsage forstyrrelser. To typer af interferens er kendt. Konstruktiv interferens betyder, at begge bølger tilføjes hvilket resulterer i en fordobling amplitude Figur 3.. Destruktiv interferens opstår, hvis bølger mødes diametralt modsatte. Det forårsager ophævelse af bølger (figur 3). Derfor nødvendigt IVSWT en model, der gør det muligt for chokbølger at udbrede efter passage af cellekulturen.
IVSWT vandbad
Overvejelser efter de ovennævnte bekymringer fører os frem til et vandbad for at undgå de beskrevne problemer figur 4. Dybest set består det af en plexiglas indbygget beholder med en membran for at forbinde alle slags trykbølge applikator. Til koblingen mellem denne membran og applikatoren ultralyd transmission gel skal anvendes. Vandbadet er fyldt med afgasset vand for at undgå kavitation, der ville ske, hvis gas blev der er opløst i vandet. En ovn i bunden med en temperaturføler forbundet til en styreenhed gør det muligt at regulere temperaturen til efterligning af in vivo-betingelser og for at undgå cellekulturer til at køle ned i løbet af proceduren. Temperaturen kan holdes stabilt på 37 grader celsius, som det sker i en inkubator. En holder til celleprøverne tillader nedsænkning enhver form for dyrkningskolbe eller rør. Derved har brug prøvekarret at være helt fyldt med dyrkningsmedium, som luftbobler ville blokere chokbølger! En kileformet absorber på bagvæggen af badet destructs bølger for ikke at komme til udtryk og løbe tilbage for at undgå interferens.
En yderligere fordel for andre IVSWT modeller er muligheden for at variere afstanden mellem applikator dyrkningskolberne. Resultaterne af vores gruppe og andre, der bruger denne model klart shvordan at hver celletype reagerer meget specifikt til forskellige behandlingsmetoder parametre. Desuden definerer afstanden mellem kilden af bølgerne, og prøven er af afgørende betydning, da det gør det muligt at kontrollere, at cellerne være på en bestemt position i forhold til fokus for chokbølgen applikator.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etisk tilladelse
Efter opnåelse af skriftligt informeret samtykke fra patienter blev navlestrenge indhentet fra kejsersnit ved Institut for Gynækologi til isolering af humane umbilical vene endotelceller (HUVEC'er). Tilladelsen blev givet fra den etiske komité i Innsbruck Medical University (nr. UN4435).
1.. Forbered IVSWT Water Bath
- Forbered 3,5 l ledningsvand i en passende tank. Vandet skal opvarmes til 37 ° C (se protokol 6).
- Fyld vand i vandbad, indtil vandniveauet er ca 3 cm under kanten. Mind til helt at dække membranen med vand. Dette vil kræve ca den forberedte 3,5 L.
- Slut temperaturføler til strømforsyningen.
- Sæt sensoren i den påtænkte montering på bagvæggen af vandbadet.
- Slut opvarmning til strømforsyning af temperaturføleren. Må ikke gøre dette udenVandet i badet som varmelegeme ville smelte plexiglas.
- Vent, indtil vandet har nået en stabil temperatur på 37 ° C. Rør vand regelmæssigt med en slags pind til at sikre en konstant temperatur i hele vandbadet.
2.. Forbered Celler og dyrkningskolber
- Seed celler natten over ved den ønskede tæthed i T25 dyrkningskolber eller kultur cellerne i kolberne direkte indtil de har nået den ønskede sammenløb.
- Før forsøget, justere kolberne lodret.
- Fyld dyrkningskolberne med dyrkningsmedium indtil lige under halsen. Fyld ikke for meget medium i kolberne som medium i kontakt med nakken eller lukkelåget ville få forurenet.
- Skru kolber med massive hætter uden filtre for at forhindre forurening fra vand. Huske, at vandet i bad og bad selv ikke er sterile.
- Forsegl hætter med Parafilm før indsættelse i vandbadet. <li> Fix forseglede dyrkningskolber i det medfølgende stativ.
- Sæt fast kolbe i vandbad. Sørge for, at midten af cellen dyrkningskolbe er i samme højde som centrum for chokbølgen applikator membran. En linje ved siden af badet guider dig.
3.. Definer Behandling Parametre
- Definer afstanden mellem trykbølge kilde og prøve. Identificer perfekte behandlingsparametre ved udførelse af parameteren konstatering pilotforsøg som beskrevet i fig. 6.
- Vælg den rigtige behandling parametre (energi fluxtæthed frekvens) på trykbølgen enhed. Igen henvises til figur 6.
4.. Chokbølge Anvendelse
- Put masser mængder af kommercielt tilgængelige ultralyd transmission gel på trykbølge applikator samt på membranen af vandbadet. Dette er for at sikre kobling. Ingen luft-eller luftbobler bør være mellem applikatoren og membranen somdet ville absorbere chokbølger.
- Slut applikator til membranen og holde den stabil i midten af membranen. Pas på, at den er justeret vandret.
- Sørg for, at den korrekte lodrette position af sonden inde i vandbadet er i overensstemmelse med den angivne markering på siden af badet.
- Hold centre i applikatoren og kolben stabilt i en vandret linje.
- Aktiver chokbølge enheden og anvende de impulser samtidig holde dyrkningskolbe samt applikatoren i en stabil stilling under hele proceduren.
5. Efter behandling
- Tag dyrkningskolbe ud af vandbadet.
- Tør den med almindelige papirservietter.
- Tør kolben præcist med desinficerende midler.
- Fjern Parafilm forsegling og hætte.
- Pipette Medium inde kolberne i centrifugal rør.
- Centrifuger hensigtsmæssigt. Centrifugering parametre afhænger af den anvendte celletype,
- Tilføj 5 ml cellekulturmedium til kolben. Resuspender centrifugeret cellepellet med 2 ml celledyrkningsmedium. Pipettere suspensionen ned i kolben. Således behøver cellefragmenter eller celler, der kan være blevet skilt under behandling ikke gå tabt.
Faldgruber
- Forberedelse samt behandling bør udføres under sterile forhold inde laminar strømning for at undgå forurening af cellekultur.
- Anbefales God cellekultur praksis at undgå forurening af sonderne. Især desinfektion af ydersiden af kolberne anbefales kraftigt før du lægger dem tilbage til inkubatoren. Vandbadet samt vandet inde, er ikke steril!
- Tilslut ikke varmelegeme til strømforsyningen medmindre vandbadet fyldes med vand for at undgå skader på plexiglas bygget bad.
- Brug generøse mængder af ultralyd gel på trykbølge applICATOR at sikre en korrekt kobling og bølgeudbredelse i badet. Luft og selv små luftbobler gør absorbere chokbølger!
- Kontroller placeringen af sonder inde i vandbad i forhold til applikatoren sikre behandling af hele vækstområde.
- Må ikke dunk sonder for dybt i vandet for at undgå forurening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af den beskrevne fremgangsmåde vi anvendte chokbølger til humane endotelceller i vena umbilicalis (HUVEC'er), vi oven isoleret fra navlestrenge. Navlestrenge blev indhentet fra elektive kejsersnit.
HUVEC'er blev behandlet på et sammenløb af 90% i en T25 cellekultur kolbe med et elektrohydraulisk trykbølge terapi system. Behandling parametre var en energi fluxtæthed på 0,1 mJ / mm 2 og en frekvens på 5 Hz. 300 impulser blev anvendt fra en afstand på 5 cm fra trykbølgen kilde til cellen lag.
Genekspression af Tie-2 (Tyrosinkinase med immunoglobulin-lignende og EGF-lignende domæner 2) mRNA blev målt ved real-time PCR-analyse. Det var betydeligt opreguleret over tid (2 timer efter SWT: 156,75 ± 14,49, 4 hr: 141,03 ± 9,71, 6 timer: 166,68 ± 2,15, p <0,05 vs CTR: 100,03 ± 7,5) 5B. Denne angiopoietin receptor giver en direkte vink til endotel c ell spredning og er en indikator for deres evne mod angiogenese. Som en positiv kontrol vi anvendte poly (I: C) (polyinosinic polycytidylic acid), at en RNA-struktur analog er kendt for at stimulere endotelceller (2 timer efter SWT: 125,7 ± 10,08, 4 hr: 191,73 ± 5.15 6 timer: 400,93 ± 19,62, p <0,05 vs CTR: 103,65 ± 6,18) Figur 5A.
En cytokin matrix blev udført 48 timer efter behandlingen for at analysere vigtigste inflammatoriske cytokiner IL-6 (59,97 ± 1,24, p <0,05 vs CTR 19,00 ± 0,44) og IL-8 (71,89 ± 1,52, p <0,05 vs CTR 29,50 ± 0,87 ), som i det væsentlige er involveret i tidlig angiogenese. Begge blev signifikant forøget i behandlingsgruppen som det fremgår af cytokin matrix 5C og efter kvantificering Figur 5D.
ighres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51076/51076fig1.jpg "/>
Figur 1.. Shock bølger påføres direkte på en cellekultur kolbe. Næsten 99% af bølger bliver reflekteret på bagvæggen af kolben hvorved fysiske forstyrrelser celler og kommende bølger. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2.. Phase-shift af bølger på vand til luft passage. Klik her for at se en større version af dette tal.
NDHOLDET-width = "5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/51076/51076fig3highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/51076/51076fig3.jpg" />
Figur 3.. Interferens mellem ryg kører, og kan forekomme indkommende bølger. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4.. Skildrer IVSWT vandbad med beskrivelse af de vigtigste dele. Klik her for at se en større version af dette tal.
es/ftp_upload/51076/51076fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51076/51076fig5.jpg "/>
Figur 5 (A) HUVEC'er stimuleret med TLR-3 agonist og RNA-struktur analog Poly.. (I: C) og (B) Tie-2-mRNA-ekspression af trykbølge stimulerede HUVEC'er klart viser en betydelig stigning i celleproliferation Data er givet som relative mRNA-ekspression, middelværdi ± SEM. (C) resultaterne af cytokin matrix viser øgede niveauer af IL-6 og IL-8. (D) afbilder kvantificering af resultaterne (pixeltæthed) fra cytokin array, middelværdi ± SEM. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 Klik her for at se en større version af dette tal.
6/51076fig6highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51076/51076fig6.jpg "/>
Figur 6.. Ordning for pilot forsøg på at identificere den perfekte behandling parametre for den specifikke celletype. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Betydningen af den foreslåede model for in vitro trykbølge behandling er, at bølger kan forplante sig efter passage af cellekulturen i modsætning til eksisterende modeller. Derved kan forstyrrende fysiske effekter såsom trækkræfter undgås. Modellen ligner mere in vivo betingelser end at ved andre anvender bølger til deres celledyrkningskolber direkte.
En yderligere fordel er muligheden for at variere afstanden mellem trykbølge kilden og celler. Dette ville ikke være muligt, hvis behandling af en dyrkningskolbe direkte. Men in vivo der visse forskelle i afstanden mellem applikator og målområdet, afhængigt af hvor dybt inde i målvævet er. Samtidig kan man undersøge virkningen af cellerne er i bestemte positioner bølgens fokuspunktet.
Gennemføre første forsøg
Ifølge vores erfaring med cardiomyocytes, endotelceller, fibroblaster og stamceller, hver celletype har brug for sine specifikke behandling parametre. Vi har derfor stærkt anbefale en pilotundersøgelse af vurderingen af den tilstrækkelige behandling parametre forud for udførelsen af de ønskede eksperimenter. Denne pilotundersøgelse skal omfatte forskellige afstande mellem trykbølgen applikator og prøven samt forskellige energi fluxdensitet. Også bør den mest passende antal pulser. Hyppigheden af at anvende chokbølger er stadig anledning til bekymring - også in vivo. En passende protokol for en behandling parameter finde pilotundersøgelse er fastsat som et supplement Figur 6..
Brugen af den ideelle kultur fartøj er af stor betydning for en vellykket gennemførelse af forsøget. Vi foretrækker fælles celledyrkningskolber af enhver størrelse. Dog kan der være grunde til at bruge andre fartøjer - fx til brug for mindre mængder af helt fylde beholderen under trykbølge etnvendelsen. Egnede materialer fra et akustisk synspunkt er PE (Z = 1'760'000 Ns / m 3), soft-gummi (Z = 1'270'000 Ns / m 3), polyamid (Z = 1'960'000 Ns / m 3). Mindre ideal er PVC (3'270'000 Ns / m 3) Plexiglas (Z = 3'260'000 Ns / m 3) delrin (3'450'000 Ns / m 3) polycarbonat (2'770'000 Ns / m 3) eller polypropylen (2'400'000 Ns / m 3). Hårde materialer som glas eller metal, må ikke anvendes.
Kritiske trin
Definition af afstanden mellem trykbølge kilden og prøven kan være ganske vanskelig opgave. Årsagen er, at kilden (f.eks elektrodespidserne i en elektro-hydrauliske system) er placeret inde i applikatoren. Derfor er det nødvendigt at kende afstanden fra kilden til applikatorer kappe. Du kan være nødt til at spørge producenten af trykbølgen enhed.
En ulempe ved denne model er, at cellekulturen hætteglasset skal værefyldt med dyrkningsmedium. Påfyldning f.eks celledyrkningskolber indebærer en øget og dyre forbrug af dyrkningsmedium. Udover omkostninger, betyder dette faktum også, at uanset hvilke celler udskiller er stærkt fortyndet. Afsløring molekyler derfor får meget mere vanskelig på grund af en nedsat koncentration. Derfor begyndte vi at bruge protein filtre til centrifugering og dermed øge koncentrationen igen.
Ud over anvendelse af forskellige typer af cellekultur hætteglas som beskrevet ovenfor, den vigtigste modifikation for IVSWT er dens anvendelse til vævskultur og ex vivo modeller. Især vores gruppe testet det med perfekte resultater i aortaringen angiogenese assay 10. Dette betyder, at det er muligt at holde enhver form for organvæv eller manipuleret væv transplantater i IVSWT vandbad. Ex vivo chokbølge ansøgning derfor i fremtiden kunne anvendes til at forbedre forskellige slags cellepodning metoder på manipuleret podninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Reiner Schultheiss og Wolfgang Schaden for deres inspiration til denne model. Vi takker også Christian Dorfmüller for hans all time enorm indsats for at støtte vores forskning.
Mange tak til Robert Göschl og Hans Hohenegger til omhyggelig teknisk realisering af vores ideer!
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orthogold shock wave device | Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA – manufactured by MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany | ||
| IVSWT Water Bath V2.0 | Johann Hohenegger - Technical Products | ||
| EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl. & Growth Factors | Lonza | CC-3156 & CC-4176 | This medium was used for the shown experiments with HUVECs to fill the cell culture flask. For other cell types, use the recommended medium. |
| Pechiney Parafilm M PM996 | Pechiney Plastic Packaging | PH-LF-PM996-EA at labplanet.com | for sealing flasks |
| Falcon Serological pipettes 25 ml | Becton Dickinson Labware | 357525 | |
| CellMate II Serological Pipette | Matrix Technologies | ||
| Skintact Ultrasonic Gel | Skintact | UL-01 250 ml | |
| T25 Cell culture flasks | COSTAR | 3056 | |
| Mikrozid disinfectant | Schülke | ||
| 3.5 L Degassed water | |||
| Paper towels |
References
- Haupt, G., Haupt, A., Ekkernkamp, A., Gerety, B., Chvapil, M. Influence of shock waves on fracture healing. Urology. 39, 529-532 (1992).
- Schaden, W., Fischer, A., Sailler, A. Extracorporeal shock wave therapy of nonunion or delayed osseous union. Clin. Orthop. Relat. Res. 387, 90-94 (2001).
- Schaden, W., et al. Shock wave therapy for acute and chronic soft tissue wounds: a feasibility study. J. Surg. Res. 143, 1-12 (2007).
- Tepeköylü, C., et al. Shock wave treatment induces angiogenesis and mobilizes endogenous CD31/CD34-positive endothelial cells in a hindlimb ischemia model: Implications for angiogenesis and vasculogenesis. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 146, 971-978 (2013).
- Nishida, T., et al. Extracorporeal cardiac shock wave therapy markedly ameliorates ischemia-induced myocardial dysfunction in pigs in vivo. Circulation. 110, 3055-3061 (2004).
- Fukumoto, Y., et al. Extracorporeal cardiac shock wave therapy ameliorates myocardial ischemia in patients with severe coronary artery disease. Coron. Artery Dis. 17, 63-70 (2006).
- Gotte, G., Amelio, E., Russo, S., Marlinghaus, E., Musci, G., Suzuki, H. Short-time non-enzymatic nitric oxide synthesis from L-arginine and hydrogen peroxide induced by shock waves treatment. FEBS Lett. 520, 153-155 (2002).
- Wang, F. S., Wang, C. J., Huang, H. J., Chung, H., Chen, R. F., Yang, K. D. Physical shock wave mediates membrane hyperpolarization and Ras activation for osteogenesis in human bone marrow stromal cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 287, 648-655 (2001).
- Mittermayr, R., et al. Extracorporeal shock wave therapy (ESWT) minimizes ischemic tissue necrosis irrespective of application time and promotes tissue revascularization by stimulating angiogenesis. Ann. Surg. 253, 1024-1032 (2011).
- Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat. Protoc. 22, 89-104 (2011).
