Choque aplicação de ondas de culturas de células
Summary
As ondas de choque nos dias de hoje são bem conhecidos por seus efeitos regenerativos. Portanto experimentos in vitro são de interesse crescente. Por isso, desenvolvemos um modelo in vitro para estudos de ondas de choque (IVSWT) que nos permite simular as condições in vivo, evitando assim efeitos físicos distracção.
Abstract
As ondas de choque nos dias de hoje são bem conhecidos por seus efeitos regenerativos. Resultados da investigação básica mostrou que as ondas de choque causam um estímulo biológico para atingir as células ou tecidos, sem qualquer dano subseqüente. Portanto, experimentos in vitro são de interesse crescente. Vários métodos de aplicação de ondas de choque em culturas de células têm sido descritos. Em geral, todos os modelos existentes se concentrar em como melhor aplicar ondas de choque em células.
No entanto, esta questão permanece: O que acontece com as ondas depois de passar a cultura de células? A diferença da impedância acústica do meio de cultura de células e o ar ambiente é tão elevada, que mais do que 99% de ondas de choque se reflete! Assim, desenvolvemos um modelo que consiste principalmente de um recipiente construído de Plexiglas que permite que as ondas se propagam para dentro da água, depois de passar a cultura de células. Isto evita o efeito de cavitação, bem como a reflexão das ondas que, de outra forma perturbam os próximos. Wiª este modelo somos capazes de imitar as condições in vivo e, assim, ganhar mais e mais conhecimento sobre como o estímulo físico de ondas de choque é traduzido em um sinal célula biológica ("mechanotransduction").
Introduction
As ondas de choque são ondas de pressão sonora decorrentes de uma liberação repentina de energia, por exemplo. como o trovão quando um raio. Na medicina ondas de choque têm sido utilizados por mais de 30 anos de Litotripsia para a desintegração de pedras nos rins. Uma vez que o achado incidental de ilíaca espessamento óssea em pacientes Litotripsia no início de 1980, os primeiros estudos foram realizados para avaliar o efeito do tratamento por ondas de choque (SWT) no osso cura 1. Resultados impressionantes de melhoria da cura de pseudartroses de ossos longos pode ser observada 2. Subsequentemente, as indicações foram expandidos para feridas de tecidos moles 3. Resultados básicos de pesquisa mostrou que as ondas de choque que causam um estímulo biológico para o tecido-alvo, sem qualquer dano subsequente. A libertação de factores de crescimento angiogénicos (por exemplo, VEGF, PlGF, FGF) é seguido por angiogénese significativa. Isto levou a uma maior expansão de indicações para patologias isquêmicos. Nosso grupo e outros mostraram o eff positivoect de SWT na doença isquêmica do coração em modelos animais, bem como em ensaios clínicos 4-6.
No entanto, o mecanismo exato de como o estímulo físico do SWT é traduzido em um sinal biológico (mechanotransduction) permanece em grande parte desconhecido. Como o interesse em SWT a partir de vários campos da medicina aumenta continuamente, a busca para o mecanismo está ficando mais e mais intensa. Portanto, experimentos in vitro onda de choque estão ganhando importância. Além da redução de experimentos com animais e relação custo-eficácia, a maior vantagem do tratamento in vitro por ondas de choque (IVSWT) pode ser a possibilidade de estudar o comportamento específico de um determinado tipo de célula. Em ondas de choque regeneração de tecidos mediada provavelmente todas as células do tecido tratado está envolvida, mesmo os efeitos sistémicos são discutidos. No entanto, cada tipo de célula tem um papel específico e tem a sua própria função intrínseca. IVSWT nos permite detectar esta função especial, umand assim nos dá uma melhor compreensão dos processos subjacentes complexas.
Conhecimentos actuais sobre os efeitos da onda de choque em culturas de células inclui o aumento da proliferação, transformação de receptores da membrana celular, aumento e aceleração da diferenciação das células, a libertação de factores de crescimento e quimio-atractivos, bem como o aumento da migração de células de 7-9.
Efeitos físicos de distracção em mais em modelos in vitro de vários métodos de aplicação de ondas de choque em culturas de células têm sido descritos. Este facto leva ao problema de que é muito difícil de comparar os resultados, como as condições físicas da estimulação de células são muito diferentes entre estes modelos. Em geral, todos os modelos existentes se concentrar em como melhor aplicar ondas de choque em células.
No entanto, esta questão permanece: O que acontece com as ondas depois de passar a cultura de células? O principal problema é que a diferença de o acústicoimpedância do meio de cultura de células e o ar ambiente é tão elevada, que mais do que 99% de ondas de choque se Figura 1 reflectida.
Devido à diferença de impedância acústica dos dois meios as ondas são reflectidas mas não só um deslocamento de fase de 180 ° ocorre resultando em fortes forças de tracção para as células a Figura 2.
Impedância acústica é definido como o produto da densidade de um material e a sua velocidade do som Z = ρ x c. Para a água a impedância acústica é ZWater = 1440000 Ns / m 3, para o ar é apenas 420 Ns / m 3. A grande diferença desses dois valores resulta em reflexão e mudança de fase de ondas de choque. O deslocamento de fase transforma um impulso de pressão positiva para uma onda de tracção.
Mesmo que essa força de tração não é prejudicial para as células, que interfere com a idéia de imitar em efeitos in vivo de ondas de choque, in vitro. In vivo estesas forças de tracção dificilmente ocorrem devido a grandes estruturas do corpo.
Além disso, a parte de trás correndo ondas pode até incomodar os que chegam. Isso pode causar interferência. Dois tipos de interferência são conhecidos. Interferência construtiva significa que ambas as ondas são adicionadas, assim, resultando em dobro amplitude Figura 3. Interferência destrutiva ocorre se ondas se encontram diametralmente opostas. Ela provoca abolição de ondas (Figura 3). Portanto, IVSWT precisa de um modelo que permite que as ondas de choque que se propagam após a passagem da cultura de células.
Banho de água IVSWT
Considerações seguintes as preocupações mencionadas acima nos levam a projetar um banho de água para evitar os problemas descritos Figura 4. Basicamente, ele consiste em um recipiente de acrílico construído com uma membrana para conectar todo tipo de aplicador de onda de choque. Para o acoplamento entre essa membrana e a transmissão aplicador de ultra-som gel tem de ser usado. O banho de água é cheio com água desgaseificada, para evitar a cavitação que poderia ocorrer se o gás se dissolva na água. Um aquecedor na parte inferior com um sensor de temperatura ligado a uma unidade de controlo permite regular a temperatura para a imitação de condições in vivo e culturas de células, para evitar a arrefecer durante o procedimento. A temperatura pode ser mantida estável a 37 graus centígrados, como é feito em uma incubadora. Um suporte para as amostras de células permite a imersão de qualquer tipo de frasco de cultura ou do tubo. Desse modo, o recipiente da amostra tem de ser completamente cheio com o meio de cultura, como bolhas de ar iria bloquear ondas de choque! Um absorvedor em forma de cunha para a parede traseira da banheira destructs ondas, a fim de não se correr e reflectida de volta, para evitar a interferência.
Uma vantagem adicional para outros modelos IVSWT é a possibilidade de variar a distância entre o aplicador e dos frascos de cultura. Apreciação do nosso grupo e outros que usam este modelo é claramentecomo que cada tipo de célula reage muito especificamente a diferentes parâmetros de tratamento. Além disso, a definição da distância entre a fonte de ondas e a amostra é crucial, uma vez que permite controlar as células a ser numa posição específica em relação ao foco do aplicador de ondas de choque.
Protocol
Representative Results
Discussion
A significância do modelo proposto para tratamento in vitro da onda de choque é o facto de que as ondas possam propagar depois de passar a cultura de células em contraste com os modelos actuais. Desse modo, os efeitos físicos perturbadoras tais como as forças de tracção pode ser evitada. O modelo se assemelha mais de perto as condições in vivo do que por outros aplicando ondas para os seus frascos de cultura de célula diretamente.
Uma vantagem adicional é a possi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem Reiner Schultheiss e Wolfgang Schaden por sua inspiração para este modelo. Agradecemos também Christian Dorfmüller para seus todos os esforços tremendos momento de apoiar a nossa pesquisa.
Muito obrigado a Robert Göschl e Hans Hohenegger para realização técnica cuidadoso das nossas ideias!
Materials
| Orthogold shock wave device | Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA – manufactured by MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany | ||
| IVSWT Water Bath V2.0 | Johann Hohenegger – Technical Products | – | |
| EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl.&Growth Factors | Lonza | CC-3156 & CC-4176 | This medium was used for the shown experiments with HUVECs to fill the cell culture flask. For other cell types, use the recommended medium. |
| Pechiney Parafilm M PM996 | Pechiney Plastic Packaging | PH-LF-PM996-EA at labplanet.com | for sealing flasks |
| Falcon Serological pipets 25ml | Becton Dickinson Labware | 357525 | |
| CellMate II Serological Pipette | Matrix Technologies | – | |
| Skintact Ultrasonic Gel | Skintact | UL-01 250 ml | |
| T25 cell culture flasks | COSTAR | 3056 | |
| mikrozid disinfectant | Schülke | – | |
| 3,5l degassed water | |||
| paper towels | |||
References
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