Summary
As ondas de choque nos dias de hoje são bem conhecidos por seus efeitos regenerativos. Portanto experimentos in vitro são de interesse crescente. Por isso, desenvolvemos um modelo in vitro para estudos de ondas de choque (IVSWT) que nos permite simular as condições in vivo, evitando assim efeitos físicos distracção.
Abstract
As ondas de choque nos dias de hoje são bem conhecidos por seus efeitos regenerativos. Resultados da investigação básica mostrou que as ondas de choque causam um estímulo biológico para atingir as células ou tecidos, sem qualquer dano subseqüente. Portanto, experimentos in vitro são de interesse crescente. Vários métodos de aplicação de ondas de choque em culturas de células têm sido descritos. Em geral, todos os modelos existentes se concentrar em como melhor aplicar ondas de choque em células.
No entanto, esta questão permanece: O que acontece com as ondas depois de passar a cultura de células? A diferença da impedância acústica do meio de cultura de células e o ar ambiente é tão elevada, que mais do que 99% de ondas de choque se reflete! Assim, desenvolvemos um modelo que consiste principalmente de um recipiente construído de Plexiglas que permite que as ondas se propagam para dentro da água, depois de passar a cultura de células. Isto evita o efeito de cavitação, bem como a reflexão das ondas que, de outra forma perturbam os próximos. Wiª este modelo somos capazes de imitar as condições in vivo e, assim, ganhar mais e mais conhecimento sobre como o estímulo físico de ondas de choque é traduzido em um sinal célula biológica ("mechanotransduction").
Introduction
As ondas de choque são ondas de pressão sonora decorrentes de uma liberação repentina de energia, por exemplo. como o trovão quando um raio. Na medicina ondas de choque têm sido utilizados por mais de 30 anos de Litotripsia para a desintegração de pedras nos rins. Uma vez que o achado incidental de ilíaca espessamento óssea em pacientes Litotripsia no início de 1980, os primeiros estudos foram realizados para avaliar o efeito do tratamento por ondas de choque (SWT) no osso cura 1. Resultados impressionantes de melhoria da cura de pseudartroses de ossos longos pode ser observada 2. Subsequentemente, as indicações foram expandidos para feridas de tecidos moles 3. Resultados básicos de pesquisa mostrou que as ondas de choque que causam um estímulo biológico para o tecido-alvo, sem qualquer dano subsequente. A libertação de factores de crescimento angiogénicos (por exemplo, VEGF, PlGF, FGF) é seguido por angiogénese significativa. Isto levou a uma maior expansão de indicações para patologias isquêmicos. Nosso grupo e outros mostraram o eff positivoect de SWT na doença isquêmica do coração em modelos animais, bem como em ensaios clínicos 4-6.
No entanto, o mecanismo exato de como o estímulo físico do SWT é traduzido em um sinal biológico (mechanotransduction) permanece em grande parte desconhecido. Como o interesse em SWT a partir de vários campos da medicina aumenta continuamente, a busca para o mecanismo está ficando mais e mais intensa. Portanto, experimentos in vitro onda de choque estão ganhando importância. Além da redução de experimentos com animais e relação custo-eficácia, a maior vantagem do tratamento in vitro por ondas de choque (IVSWT) pode ser a possibilidade de estudar o comportamento específico de um determinado tipo de célula. Em ondas de choque regeneração de tecidos mediada provavelmente todas as células do tecido tratado está envolvida, mesmo os efeitos sistémicos são discutidos. No entanto, cada tipo de célula tem um papel específico e tem a sua própria função intrínseca. IVSWT nos permite detectar esta função especial, umand assim nos dá uma melhor compreensão dos processos subjacentes complexas.
Conhecimentos actuais sobre os efeitos da onda de choque em culturas de células inclui o aumento da proliferação, transformação de receptores da membrana celular, aumento e aceleração da diferenciação das células, a libertação de factores de crescimento e quimio-atractivos, bem como o aumento da migração de células de 7-9.
Efeitos físicos de distracção em mais em modelos in vitro de vários métodos de aplicação de ondas de choque em culturas de células têm sido descritos. Este facto leva ao problema de que é muito difícil de comparar os resultados, como as condições físicas da estimulação de células são muito diferentes entre estes modelos. Em geral, todos os modelos existentes se concentrar em como melhor aplicar ondas de choque em células.
No entanto, esta questão permanece: O que acontece com as ondas depois de passar a cultura de células? O principal problema é que a diferença de o acústicoimpedância do meio de cultura de células e o ar ambiente é tão elevada, que mais do que 99% de ondas de choque se Figura 1 reflectida.
Devido à diferença de impedância acústica dos dois meios as ondas são reflectidas mas não só um deslocamento de fase de 180 ° ocorre resultando em fortes forças de tracção para as células a Figura 2.
Impedância acústica é definido como o produto da densidade de um material e a sua velocidade do som Z = ρ x c. Para a água a impedância acústica é ZWater = 1440000 Ns / m 3, para o ar é apenas 420 Ns / m 3. A grande diferença desses dois valores resulta em reflexão e mudança de fase de ondas de choque. O deslocamento de fase transforma um impulso de pressão positiva para uma onda de tracção.
Mesmo que essa força de tração não é prejudicial para as células, que interfere com a idéia de imitar em efeitos in vivo de ondas de choque, in vitro. In vivo estesas forças de tracção dificilmente ocorrem devido a grandes estruturas do corpo.
Além disso, a parte de trás correndo ondas pode até incomodar os que chegam. Isso pode causar interferência. Dois tipos de interferência são conhecidos. Interferência construtiva significa que ambas as ondas são adicionadas, assim, resultando em dobro amplitude Figura 3. Interferência destrutiva ocorre se ondas se encontram diametralmente opostas. Ela provoca abolição de ondas (Figura 3). Portanto, IVSWT precisa de um modelo que permite que as ondas de choque que se propagam após a passagem da cultura de células.
Banho de água IVSWT
Considerações seguintes as preocupações mencionadas acima nos levam a projetar um banho de água para evitar os problemas descritos Figura 4. Basicamente, ele consiste em um recipiente de acrílico construído com uma membrana para conectar todo tipo de aplicador de onda de choque. Para o acoplamento entre essa membrana e a transmissão aplicador de ultra-som gel tem de ser usado. O banho de água é cheio com água desgaseificada, para evitar a cavitação que poderia ocorrer se o gás se dissolva na água. Um aquecedor na parte inferior com um sensor de temperatura ligado a uma unidade de controlo permite regular a temperatura para a imitação de condições in vivo e culturas de células, para evitar a arrefecer durante o procedimento. A temperatura pode ser mantida estável a 37 graus centígrados, como é feito em uma incubadora. Um suporte para as amostras de células permite a imersão de qualquer tipo de frasco de cultura ou do tubo. Desse modo, o recipiente da amostra tem de ser completamente cheio com o meio de cultura, como bolhas de ar iria bloquear ondas de choque! Um absorvedor em forma de cunha para a parede traseira da banheira destructs ondas, a fim de não se correr e reflectida de volta, para evitar a interferência.
Uma vantagem adicional para outros modelos IVSWT é a possibilidade de variar a distância entre o aplicador e dos frascos de cultura. Apreciação do nosso grupo e outros que usam este modelo é claramentecomo que cada tipo de célula reage muito especificamente a diferentes parâmetros de tratamento. Além disso, a definição da distância entre a fonte de ondas e a amostra é crucial, uma vez que permite controlar as células a ser numa posição específica em relação ao foco do aplicador de ondas de choque.
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Protocol
Permissão de Ética
Após a obtenção do consentimento livre e esclarecido dos pacientes, cordões umbilicais foram obtidos a partir de cesariana no Departamento de Ginecologia para o isolamento de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC). A permissão foi dada a partir do comitê de ética da Universidade de Medicina de Innsbruck (no. UN4435).
1. Prepare o IVSWT Água Bath
- Prepare 3,5 L de água da torneira em um tanque apropriado. A água deve ser aquecida a 37 ° C (ver o Protocolo 6).
- Encher a água para o banho de água até que o nível da água é de aproximadamente 3 cm abaixo da borda. Mente para cobrir completamente a membrana com água. Isto vai exigir a aproximadamente 3,5 L. preparado
- Ligue o sensor de temperatura para a fonte de alimentação.
- Colocar o sensor dentro da instalação destinada à parede traseira da água do banho.
- Ligue o aquecimento a fonte de alimentação do sensor de temperatura. Não faça isso semágua no banho como o aquecedor poderia fundir o Plexiglas.
- Espere até que a água tenha atingido uma temperatura estável de 37 ° C. Agita-se a água regularmente com algum tipo de vara para garantir uma temperatura constante em todo o banho de água.
2. Prepare Células e frascos de cultura
- Células de sementes durante a noite com densidade desejada em frascos de cultura T25 ou cultura as células em frascos diretamente até que tenham atingido a confluência desejada.
- Antes do experimento, alinhe os frascos na vertical.
- Encha os frascos de cultura com meio de cultura até logo abaixo do pescoço. Não encha demais médio em balões como meio de contato para o pescoço ou a tampa de fechamento iria ficar contaminada.
- Aperte os frascos com capacitores sólidos sem filtros para evitar a contaminação da água. Mente que a água no banho e o banho em si não são estéreis.
- Selar as tampas com Parafilm antes da inserção no banho-maria. <li> Fix frascos de cultura fechados no suporte fornecido.
- Insira frasco fixo na água do banho. Ter cuidado para que o meio do frasco de cultura de células é na mesma altura que o centro da membrana da onda de choque do aplicador. A fila do lado da banheira o orienta.
3. Definir Tratamento Parâmetros
- Defina a distância entre a fonte de ondas de choque e amostra. Identificar os parâmetros de tratamento perfeitos através da realização da experiência piloto parâmetro achado como descrito na Figura 6.
- Escolha os parâmetros de tratamento de certas (densidade de fluxo de energia, frequência) no dispositivo de onda de choque. Mais uma vez, consulte a Figura 6.
4. Choque aplicação de ondas
- Coloque quantidades abundância de gel disponível no mercado de transmissão de ultra-som sobre a onda de choque do aplicador, bem como sobre a membrana do banho-maria. Isto é para assegurar o acoplamento. Não há bolhas de ar ou de ar deve estar entre o aplicador e a membrana quantoseria absorver as ondas de choque.
- Ligue aplicador para a membrana e segurá-lo estável no centro da membrana. Tome cuidado para que ela esteja alinhada horizontalmente.
- Certifique-se de que a posição vertical correcta da sonda no interior do banho de água é, de acordo com o indicado na marcação do lado da casa de banho.
- Segurar centros do aplicador e o balão estável numa linha horizontal.
- Activar o aparelho de ondas de choque e aplicar os impulsos, mantendo o frasco de cultura, bem como o aplicador numa posição estável durante todo o procedimento.
5. Depois do Tratamento
- Pegue a garrafa de cultura do banho de água.
- Seque-o com toalhas de papel comuns.
- Limpe o frasco de forma precisa com os agentes de desinfecção.
- Remover Parafilm vedação e tampa.
- Pipetar a média dentro dos frascos em tubos centrífugos.
- Centrifugar adequadamente. Parâmetros centrifugação dependerá do tipo de célula utilizada,
- Adicionar 5 ml de meio de cultura de células para o balão. Ressuspender o sedimento de células centrifugadas com 2 ml de meio de cultura celular. Pipetar a suspensão para dentro do frasco. Assim, fragmentos de células ou células que podem ter sido isoladas durante o tratamento não se percam.
Armadilhas
- Preparação, bem como o tratamento deve ser realizado sob condições estéreis para dentro de fluxo laminar, para evitar a contaminação da cultura de células.
- Boas práticas de cultura de células é recomendada para evitar a contaminação das sondas. Em particular, a desinfecção da parte exterior dos frascos é fortemente recomendado antes de colocá-los para trás para a incubadora. O banho de água, bem como o interior da água, não é estéril!
- Não ligar o aquecedor para o fornecimento de energia a não ser que o banho de água é enchido com água a fim de evitar danos para as Plexiglas construídos banho.
- Use uma quantidade generosa de gel de ultra-som no appl onda de choqueicator para garantir acoplamento adequado e de propagação da onda no banho. Ar e até mesmo pequenas bolhas de ar absorvem as ondas de choque!
- Verificar a posição das sondas no interior do banho de água em relação ao aplicador de garantir um tratamento de toda a área de crescimento.
- Não mergulhe sondas muito profundo dentro da água para evitar a contaminação.
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Representative Results
Usando o método descrito foi aplicado ondas de choque às células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) que dantes isolado a partir de cordão umbilical. Cordões umbilicais foram obtidos a partir de cesarianas eletivas.
HUVECs foram tratados em uma confluência de 90% em um frasco de cultura de células T25 com um sistema de terapia de ondas de choque eletro-hidráulico. Parâmetros de tratamento eram uma densidade de fluxo de energia de 0,1 mJ / mm 2 e uma freqüência de 5 Hz. 300 impulsos foram aplicados a partir de uma distância de 5 cm da fonte de ondas de choque para a camada de células.
A expressão de genes de Tie-2 (tirosina-quinase com domínios do tipo imunoglobulina e do tipo EGF 2) ARNm foi medido por análise em tempo real de PCR. Foi significativamente regulada ao longo do tempo (pós 2 horas SWT: 156,75 ± 14,49, 4 horas: 141,03 ± 9,71, 6 hr: 166,68 ± 2,15, p <0,05 vs CTR: 100,03 ± 7,5) Figura 5B. Este receptor angiopoietina dá uma dica direta para endotelial c proliferação ell e é um indicador para a sua capacidade para a angiogênese. Como controle positivo foi utilizada a Poly (I: C) (ácido polycytidylic polyinosinic) que, como um análogo estrutura RNA é conhecido por estimular células endoteliais (pós 2 horas SWT: 125,7 ± 10,08, 4 hr: 191,73 ± 5,15, 6 hr: 400,93 ± 19,62, p <0,05 vs CTR: 103,65 ± 6,18) Figura 5A.
Uma variedade de citocinas foi realizada 48 horas após o tratamento para analisar principais citoquinas inflamatórias IL-6 (59,97 ± 1,24, p <0,05 vs CTR 19,00 ± 0,44) e IL-8 (71,89 ± 1,52, p <0,05 vs CTR 29,50 ± 0,87 ) que são substancialmente envolvidos na angiogénese precoce. Ambos foram significativamente aumentados no grupo de tratamento, como mostrado pela matriz citocina Figura 5C e Figura 5D, após a quantificação.
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As ondas de choque Figura 1. Aplicado diretamente em um frasco de cultura de células. Cerca de 99% das ondas refletidas na parede do fundo do frasco, causando distúrbios físicos para as células e futuras ondas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Phase-shift de ondas na água para a passagem de ar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3. Interferência entre as costas rodando e podem ocorrer ondas de entrada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Representando a água do banho IVSWT com a descrição das partes mais importantes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 5 (A) HUVECs estimuladas com o TLR 3-agonista e RNA estrutura análogo Poly.. (I: C) e (B) de Tie-2 de expressão do mRNA de onda de choque HUVECs estimuladas descreve claramente um aumento significativo na proliferação de células de dados são dados como expressão de mRNA relativo, (C) resultados de citocina série mostrando aumento dos níveis de IL-6 e IL-8. (D) que retratam a quantificação dos resultados (densidade de pixels) do conjunto de citocinas média ± SEM., média ± SEM. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 6. Esquema para estudo piloto para identificar os parâmetros de tratamento perfeito para o tipo específico de célula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A significância do modelo proposto para tratamento in vitro da onda de choque é o facto de que as ondas possam propagar depois de passar a cultura de células em contraste com os modelos actuais. Desse modo, os efeitos físicos perturbadoras tais como as forças de tracção pode ser evitada. O modelo se assemelha mais de perto as condições in vivo do que por outros aplicando ondas para os seus frascos de cultura de célula diretamente.
Uma vantagem adicional é a possibilidade de variar a distância entre a fonte de ondas de choque e de células. Isto não seria possível se o tratamento de um frasco de cultura directamente. No entanto, in vivo, existem certas diferenças em distância entre o aplicador e a área de alvo, dependendo da profundidade dentro do tecido alvo. Ao mesmo tempo, pode-se estudar o efeito das células estarem em posições específicas ao ponto de foco da onda.
Realização primeiras experiências
De acordo com a nossa experiência com cardiomyocytes, células endoteliais, fibroblastos e células-tronco, cada tipo de célula precisa de seus parâmetros de tratamento específicos. Por isso, recomendamos fortemente um estudo piloto para avaliação dos parâmetros de tratamento adequado antes de realizar os experimentos desejados. Este estudo piloto precisa incluir diferentes distâncias entre o aplicador onda de choque ea amostra, bem como diferentes densidades de fluxo de energia. Também deve ser estabelecido o número mais adequado de pulsos. A freqüência de aplicação de ondas de choque ainda é motivo de preocupação - mesmo in vivo. Um protocolo adequado para um parâmetro de tratamento encontrar ensaio principal é fornecido como um suplemento Figura 6.
A utilização do recipiente de cultura ideal é de grande importância para o sucesso da experiência. Preferimos frascos de cultura de células comuns de qualquer tamanho. No entanto, pode haver razões para utilizar outras embarcações - por exemplo, precisar de volumes menores para encher completamente o navio durante o choque das ondas umPLICAÇÃO. Materiais adequados do ponto de vista acústico são PE (Z = 1'760'000 Ns / m 3), soft-borracha (Z = 1'270'000 Ns / m 3), poliamida (Z = 1'960'000 Ns / m 3). Menos ideal é PVC (3'270'000 Ns / m 3) acrílico (Z = 3'260'000 Ns / m 3) delrin (3'450'000 Ns / m 3) policarbonato (2'770'000 Ns / m 3) ou polipropileno (2'400'000 Ns / m 3). Não devem ser usados materiais rígidos, como vidro ou metal.
As etapas críticas
Definindo a distância entre a fonte de ondas de choque e a amostra pode ser bastante complicado. A razão é que a fonte (por exemplo, eléctrodos de pontas em um sistema electro-hidráulico) é localizado no interior do aplicador. Por isso, é necessário conhecer a distância a partir da fonte para o manto aplicadores. Você pode ter que perguntar ao fabricante do dispositivo de ondas de choque.
Uma desvantagem deste modelo é o facto de o frasco de cultura de células tem de serpreenchido com meio de cultura. Encher frascos de cultura de células, por exemplo implica um aumento do consumo e caro de meio de cultura. Além dos custos, este fato também significa que tudo o que as células secretam é fortemente diluída. Detecção de moléculas, por conseguinte, se torna muito mais difícil devido a uma diminuição da concentração. Daí, começamos a usar filtros de proteína para a centrifugação e, assim, aumentar a concentração novamente.
Além do uso de diferentes tipos de frascos de cultura de células, como descrito acima, o principal modificação para IVSWT é o seu uso para cultura de tecidos ex vivo e modelos. Em particular, o nosso grupo testado com resultados perfeitos no ensaio de anel angiogênese aórtica 10. Isto significa que é possível realizar qualquer tipo de tecido ou órgão de engenharia de tecidos de enxertos para o banho de água IVSWT. Ex vivo aplicação de ondas de choque, por conseguinte, no futuro pode ser usado para melhorar a diferentes tipos de métodos de semeadura sobre enxertos de células manipuladas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem Reiner Schultheiss e Wolfgang Schaden por sua inspiração para este modelo. Agradecemos também Christian Dorfmüller para seus todos os esforços tremendos momento de apoiar a nossa pesquisa.
Muito obrigado a Robert Göschl e Hans Hohenegger para realização técnica cuidadoso das nossas ideias!
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orthogold shock wave device | Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA – manufactured by MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany | ||
| IVSWT Water Bath V2.0 | Johann Hohenegger - Technical Products | ||
| EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl. & Growth Factors | Lonza | CC-3156 & CC-4176 | This medium was used for the shown experiments with HUVECs to fill the cell culture flask. For other cell types, use the recommended medium. |
| Pechiney Parafilm M PM996 | Pechiney Plastic Packaging | PH-LF-PM996-EA at labplanet.com | for sealing flasks |
| Falcon Serological pipettes 25 ml | Becton Dickinson Labware | 357525 | |
| CellMate II Serological Pipette | Matrix Technologies | ||
| Skintact Ultrasonic Gel | Skintact | UL-01 250 ml | |
| T25 Cell culture flasks | COSTAR | 3056 | |
| Mikrozid disinfectant | Schülke | ||
| 3.5 L Degassed water | |||
| Paper towels |
References
- Haupt, G., Haupt, A., Ekkernkamp, A., Gerety, B., Chvapil, M. Influence of shock waves on fracture healing. Urology. 39, 529-532 (1992).
- Schaden, W., Fischer, A., Sailler, A. Extracorporeal shock wave therapy of nonunion or delayed osseous union. Clin. Orthop. Relat. Res. 387, 90-94 (2001).
- Schaden, W., et al. Shock wave therapy for acute and chronic soft tissue wounds: a feasibility study. J. Surg. Res. 143, 1-12 (2007).
- Tepeköylü, C., et al. Shock wave treatment induces angiogenesis and mobilizes endogenous CD31/CD34-positive endothelial cells in a hindlimb ischemia model: Implications for angiogenesis and vasculogenesis. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 146, 971-978 (2013).
- Nishida, T., et al. Extracorporeal cardiac shock wave therapy markedly ameliorates ischemia-induced myocardial dysfunction in pigs in vivo. Circulation. 110, 3055-3061 (2004).
- Fukumoto, Y., et al. Extracorporeal cardiac shock wave therapy ameliorates myocardial ischemia in patients with severe coronary artery disease. Coron. Artery Dis. 17, 63-70 (2006).
- Gotte, G., Amelio, E., Russo, S., Marlinghaus, E., Musci, G., Suzuki, H. Short-time non-enzymatic nitric oxide synthesis from L-arginine and hydrogen peroxide induced by shock waves treatment. FEBS Lett. 520, 153-155 (2002).
- Wang, F. S., Wang, C. J., Huang, H. J., Chung, H., Chen, R. F., Yang, K. D. Physical shock wave mediates membrane hyperpolarization and Ras activation for osteogenesis in human bone marrow stromal cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 287, 648-655 (2001).
- Mittermayr, R., et al. Extracorporeal shock wave therapy (ESWT) minimizes ischemic tissue necrosis irrespective of application time and promotes tissue revascularization by stimulating angiogenesis. Ann. Surg. 253, 1024-1032 (2011).
- Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat. Protoc. 22, 89-104 (2011).
