Summary
Ударные волны в настоящее время хорошо известны за их регенеративных эффектов. Поэтому эксперименты в пробирке из растущего интереса. Поэтому мы разработали модель для в пробирке ударных волн исследований (IVSWT), что позволяет нам имитировать в условиях естественных условиях, благодаря чему исключаются отвлекающие физические эффекты.
Abstract
Ударные волны в настоящее время хорошо известны за их регенеративных эффектов. Основные результаты исследований показали, что ударные волны вызывают биологический стимул к клеткам-мишеням или тканей без последующего ущерба. Таким образом, эксперименты в пробирке из растущего интереса. Различные методы нанесения ударные волны на культурах клеток были описаны. В общем, все существующие модели сосредоточиться на том, как лучше применять ударные волны на клетках.
Тем не менее, этот вопрос остается: Что происходит с волнами после прохождения через клеточную культуру? Разность акустического импеданса среды культуры клеток и окружающим воздухом, что высока, что более 99% ударных волн будут отражаться! Поэтому мы разработали модель, которая в основном состоит из оргстекла построен контейнер, который позволяет волны распространяться в воде после прохождения через клеточную культуру. Это позволяет избежать кавитационных эффекты, а также отражение волн, которые могли бы нарушить предстоящих них. Wiй этой модели мы можем имитировать Vivo условия в и таким образом получить больше и больше знаний о том, как физический стимул ударных волн будет преобразован в сигнал биологической клетки ("механотрансдукции").
Introduction
Ударные волны являются звуковые волны давления, возникающие в результате внезапного высвобождения энергии, например. как гром, когда молния. В медицине ударные волны были использованы на протяжении более 30 лет в литотрипсии для распада камней в почках. С побочной нахождения подвздошной кости утолщение в литотрипсии пациентов в начале 1980-х, первые исследования были проведены, чтобы оценить эффект лечения ударно-волновой (SWT) на кости исцеления 1. Впечатляющие результаты улучшения заживления длинных костей несращения можно было наблюдать 2. Впоследствии, показания были расширены на раны мягких тканей 3. Основные результаты исследований показали, что ударные волны вызывают стимул биологической ткани-мишени без последующего повреждения. Выпуск ангиогенных факторов роста (например, VEGF, PLGF, FGF) следует значительной ангиогенеза. Это привело к дальнейшему расширению показаний к ишемических патологий. Наша группа и другие показали положительную эффECT из УВТ по ишемической болезни сердца на животных моделях, а также в клинических испытаниях 4-6.
Тем не менее, точный механизм, как физическое стимулом SWT переводится в биологической сигнала (механотрансдукции) остается неизвестной. Как интереса к SWT от нескольких областях медицины непрерывно увеличивается, стремление к механизму становится все более и более интенсивным. Таким образом, в пробирке ударных волн эксперименты приобретают все большее значение. Кроме сокращения экспериментах на животных и экономической эффективности, самое большое преимущество в пробирке лечения ударной волны (IVSWT) может быть рассмотрена возможность исследования специфическое поведение определенного типа клеток. В ударной волны опосредованного регенерации тканей, скорее всего, все клетки обрабатываемой ткани участвуют, обсуждаются даже системные эффекты. Тем не менее, каждый тип клеток играет особую роль и имеет свою собственную встроенную функцию. IVSWT позволяет обнаружить эту конкретную функцию ай, таким образом, дает нам лучшее понимание сложных основных процессов.
Сегодняшний знания о эффектов ударной волны по клеточных культур включает в себя увеличение пролиферации, изменение рецепторов клеточных мембран, увеличение и ускорение дифференцировки клеток, высвобождение факторов роста и химио-аттрактантов, а также повышенную миграцию клеток 7-9.
Отвлекающие физические эффекты в самых в пробирке моделей различных методов применения ударных волн на клеточных культурах были описаны. Этот факт приводит к проблеме, что это очень трудно сравнивать результаты, как физические условия стимуляции клеток существенно отличаются между этими моделями. В общем, все существующие модели сосредоточиться на том, как лучше применять ударные волны на клетках.
Тем не менее, этот вопрос остается: Что происходит с волнами после прохождения через клеточную культуру? Основная проблема заключается в том, что разница в акустическихимпеданс клеточной культуральной среде и окружающим воздухом, что высока, что более 99% ударных волн будут отражаться Рисунок 1.
Из-за разницы в акустического импеданса двух сред волны не только отражение, но фазового сдвига на 180 ° происходит в результате сильных растягивающих сил на клетки Рисунок 2.
Акустическая сопротивление определяется как произведение плотности материала и его скорость звука Z = ρ х в. Для воды акустический импеданс является ZWater = 1440000 Ns / м 3, для воздуха это только 420 Нс / м 3. Большое различие этих двух величин приводит отражения и сдвига фаз ударных волн. Сдвиг фазы оказывается импульс положительным давлением в растяжение волны.
Даже если это усилие натяжения не является вредным для клеток, он мешает с идеей подражая в естественных условиях ударно-волновых эффектов в пробирке. В естественных условиях этирастягивающие усилия вряд ли произойти из-за больших структур тела.
Кроме того, задняя бегущих волн могут даже мешать входящие. Это может вызвать помехи. Два типа помех известны. Конструктивная интерференция означает, что обе волны добавляются в результате чего в два раза амплитуды рисунке 3. Деструктивная интерференция возникает, если волны встречаются диаметрально противоположны. Это вызывает отмену волн (рис. 3). Поэтому IVSWT нужна модель, которая позволяет ударные волны распространяться после прохождения через клеточную культуру.
Водяная баня IVSWT
Соображения следующие вышеупомянутых проблем приведет нас к разработке ванну воды для избежания описанные проблемы Рисунок 4. В принципе, он состоит из оргстекла построен контейнер с мембраной для подключения каждый вид ударной волны аппликатора. Для связи между этой мембраны и передачи аппликатор ультразвука гел должен быть использован. Водяная баня наполняется дегазированной воды, чтобы избежать кавитации, что произошло бы, если газ растворяется в воде. Нагреватель на дне с помощью датчика температуры, соединенного с блоком управления позволяет регулировать температуру для имитации условий в естественных условиях и, чтобы избежать клеточных культур остыть во время процедуры. Температура может быть привлечен к стабильным на уровне 37 градусов по Цельсию, как это делается в инкубаторе. Держатель для образцов клеток позволяет погружением любой культуральной колбы или трубки. Таким образом, образец сосуд должен быть полностью заполнен культуральной среде, как пузырьки воздуха будет блокировать ударные волны! Клиновидный поглотитель на задней стенке ванны разрушает волны для того, чтобы не отраженного и отбежать, чтобы избежать помех.
Еще одно преимущество для других моделей IVSWT является возможность изменения расстояния между аппликатором и культуральных колбах. Выводы нашей группы и другие лица, использующие эта модель явно ыкак, что каждый тип клеток реагирует очень специально для различных параметров обработки. Кроме того, определение расстояния между источником волн и образцом очень важно, поскольку оно позволяет управлять элементами, чтобы быть в определенном положении по отношению к фокусе ударной волны аппликатора.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этические разрешение
После получения письменного информированного согласия пациентов, пуповины были получены из кесарева сечения на кафедре гинекологии для изоляции человека эндотелиальных клеток пупочной вены (HUVECs). Разрешение было дано от комитета по этике Инсбрук медицинского университета (№ UN4435).
1. Подготовьте IVSWT водяной бане
- Подготовка 3,5 л водопроводной воды в соответствующем баке. Вода должна быть нагрета до 37 ° С (см. Протокол № 6).
- Заполните воду в водяной бане, пока уровень воды не находится примерно в 3 см ниже края. Следите, чтобы полностью покрыть мембрану с водой. Это потребует примерно подготовленный 3,5 L.
- Датчик температуры подключить к источнику питания.
- Поместите датчик в фитинг, предназначенного на задней стенке водяной бане.
- Подключите отопление к источнику питания датчика температуры. Не делайте этого, неводы в ванне, как нагревателя будет таять оргстекла.
- Подождите, пока вода не достигла стабильного температуру 37 ° С Размешайте воду регулярно с какой-то палкой, чтобы гарантировать постоянную температуру на протяжении всего водяной бане.
2. Подготовка ячеек и колбы с культурой
- Семенной клетки в течение ночи при требуемой плотности в T25 колбы с культурой или культурой клеток в колбах непосредственно, пока они не достигли желаемого слияния.
- Перед экспериментом, совместите колб вертикально.
- не Заполните культуры колбы с питательной среде до прямо под их шеях. Не заполняйте слишком много среды в колбах, как среды в контакте с шеи или закрытия крышки будет откладываться загрязнения.
- Винт колбы с твердотельных конденсаторов без фильтров для предотвращения загрязнения из воды. Напоминаем, что вода в ванне, и сама ванна не являются стерильными.
- Уплотнение крышки парафином до введения в водяной бане. <литий> Fix запечатанные колбы с культурой в предоставленном стенде.
- Вставка фиксированный колбу в водяную баню. Позаботьтесь, чтобы середина клеточной культуры колбу находится на той же высоте, центре мембраны ударной волны аппликатора. Линия на стороне ванны поможет вам.
3. Определить лечения по Параметры
- Определить расстояние между источником ударной волны и образца. Определить идеальные параметры обработки путем проведения пилотного эксперимента ознакомительной параметр, как описано на фигуре 6.
- Выберите правильные параметры лечения (плотность потока энергии, частоты) на ударной волны устройства. Опять же, см. Рисунок 6.
4. Ударной волны Применение
- Поместите большим количество коммерчески доступного ультразвукового геля передачи от волнового аппликатора ударной а также на мембране водяной бане. Это должно гарантировать, муфту. Нет воздуха или воздуха должно быть между аппликатором и мембраны какбыло бы поглощать ударные волны.
- Подключение аппликатор с мембраной и удерживать его стабильным в центре мембраны. Позаботьтесь, чтобы оно располагалось горизонтально.
- Убедитесь в том, что правильное вертикальное положение зонда внутри водяной бане находится в соответствии с указанными маркировки на стороне ванны.
- Держите центры аппликатором и колбы стабильной в виде горизонтальной линии.
- Активируйте ударной волны устройства и применять импульсы, сохраняя при этом колбу культуры, а также аппликатор в устойчивом положении во время всей процедуры.
5. После обращения
- Возьмем культуральной колбы из водяной бане.
- Высушите его с общими бумажными полотенцами.
- Протрите колбу точно с дезинфицирующих средств.
- Удалить парафильмом уплотнение и крышку.
- Внесите среды внутри колбы в центробежных труб.
- Центрифуга соответствующим образом. Центрифугирования параметры зависят от используемого типа клеток,
- Добавить 5 мл клеточной культуральной среды в колбу. Ресуспендируют осадок клеток центрифугируют с 2 мл клеточной культуральной среды. Внесите подвеску в колбу. Таким образом, фрагменты клеток или клеток, которые могут быть отдельные во время лечения не заблудиться.
Подводные камни
- Подготовка, а также лечение должно проводиться в стерильных условиях внутри ламинарного потока, чтобы избежать загрязнения клеточной культуре.
- Хорошая практика культивирования клеток рекомендуется, чтобы избежать загрязнения зондов. В частности дезинфекция снаружи колбы настоятельно рекомендуется, прежде чем положить их обратно в инкубатор. Водяная баня, а также вода внутри, не является стерильной!
- Не подключайте обогреватель к источнику питания, если вода ванна не наполнится водой, чтобы избежать повреждения оргстекла построенных ванну.
- Используйте щедрое количество ультразвукового геля на ударной волны заявлicator, чтобы гарантировать надлежащее сцепление и распространение волн в ванну. Воздушные и даже небольшие пузырьки воздуха делают поглощают ударные волны!
- Проверить положение зондов внутри водяной бане по отношению к аппликатору, чтобы обеспечить обработку всей площади роста.
- Не замочить зонды слишком глубоко в воду, чтобы избежать загрязнения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Использование описанного способа мы применяется ударные волны в эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVECs), что мы прежде изолированную от пуповины. Пуповины были получены из выборных кесарева сечения.
HUVECs лечили при впадении 90% в колбе T25 культуре клеток с электрогидравлической системой ударно-волновой терапии. Параметры лечения были плотность потока энергии 0,1 мДж / мм 2 и частотой 5 Гц. 300 импульсы были применены на расстоянии 5 см от источника ударных волн в слое клеток.
Экспрессия генов Tie-2 (тирозинкиназы с иммуноглобулином, как и EGF-подобных доменов 2) мРНК измеряли ПЦР в реальном времени анализа. Это было значительно повышающей регуляции во времени (2 ч после УВТ: 156,75 ± 14,49, 4 ч: 141,03 ± 9,71, 6 ч: 166,68 ± 2,15, р <0,05 по сравнению с CTR: 100,03 ± 7,5) фиг.5В. Это ангиопоэтин рецепторов дает прямое намек на эндотелиальной с Распространение локоть и является показателем их способности к ангиогенеза. В качестве положительного контроля использовали Poly (I: C) (полиинозиновая полицитидиловая кислота), что, как структура РНК аналог как известно, стимулирует эндотелиальные клетки (2 ч после SWT: 125,7 ± 10,08, 4 HR: 191,73 ± 5,15, 6 ч: 400,93 ± 19,62, р <0,05 по сравнению с CTR: 103,65 ± 6,18) 5А.
Массив цитокинов проводили через 48 часов после обработки для анализа основных воспалительных цитокинов IL-6 (59,97 ± 1,24, P <0,05 по сравнению с CTR 19,00 ± 0,44) и ИЛ-8 (71,89 ± 1,52, P <0,05 по сравнению с CTR 29,50 ± 0,87 ), которые по существу участвуют в начале ангиогенеза. Оба были значительно увеличены в группе лечения, как показано на рисунке массива цитокинов 5C и после количественного рисунок 5D.
ighres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/51076/51076fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Ударные волны наносят непосредственно на культуры клеток колбу. Почти 99% волн будут отражаться на задней стенке колбы что вызывает физические нарушения в клетках и предстоящих волн. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Фазовый волн на воде в воздушный канал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
ontent-ширина = "5 дюймов" FO: Пребывание "/ files/ftp_upload/51076/51076fig3highres.jpg" Первоначально "/ files/ftp_upload/51076/51076fig3.jpg" />
Рисунок 3. Интерференция спине под управлением и может произойти входящие волны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Изображая IVSWT водяной бане с описанием наиболее важных частей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
es/ftp_upload/51076/51076fig5highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/51076/51076fig5.jpg "/>
Рисунок 5 (A) HUVECs стимулировали с TLR-3 агониста и РНК структуры аналога Poly.. (I: C) и (B) Tie-2 экспрессии мРНК ударной волны стимулированного HUVECs ясно, изображающий значительное увеличение клеточной пролиферации данные приведены как относительная экспрессии мРНК, среднее ± SEM. (C) Результаты цитокинов массива показывая повышенные уровни IL-6 и IL-8. (D), изображающие количественную оценку результатов (плотность пикселей) из цитокинов массива, среднее ± SEM. * Р <0,05, ** р <0,01, *** р <0,001 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
6/51076fig6highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/51076/51076fig6.jpg "/>
Схема пилотного исследования для выявления наиболее подходящий параметров лечения для конкретного типа клеток Рисунок 6.. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Значимость предложенной модели для экстракорпорального лечения ударной волны является то, что волны могут распространяться после прохождения через клеточную культуру в отличие от существующих моделей. Таким образом, тревожные физические эффекты, такие как растягивающих сил можно избежать. Модель больше напоминает в условиях естественных условиях, чем, что, другие применения волны, чтобы их культивирования клеток колб напрямую.
Дополнительным преимуществом является возможность изменения расстояния между источником ударных волн и клеток. Это не было бы возможно, если лечения культуральной колбы напрямую. Тем не менее, в естественных условиях там на определенные различия в расстоянии между аппликатором и целевой области, в зависимости от того, как глубоко внутри ткани-мишени является. В то же время можно изучить влияние клеток, находящихся в определенных позициях в точке фокусировки волны.
Проведение первых экспериментов
По нашему опыту с окrdiomyocytes, эндотелиальные клетки, фибробласты и стволовые клетки, каждый тип клеток нуждается в своих конкретных параметров обработки. Поэтому мы настоятельно рекомендуем пилотный судом за оценку адекватных параметров лечения до проведения желаемых экспериментов. Этот пилотный испытание должно включать в себя различные расстояния между ударной волны аппликатора и образца, а также различной плотности потока энергии. Также должны быть созданы наиболее подходящим количество импульсов. Частота применения ударных волн по-прежнему вызывает озабоченность - даже в естественных условиях. Подходящий протокол для параметра лечения выяснения пилотного исследования обеспечивается как дополнение рисунке 6.
Использование идеального сосуда для культивирования имеет большое значение для успеха эксперимента. Мы предпочитаем общих клеточных культур фляги любого размера. Однако, может быть причин, чтобы использовать другие суда - например нуждаться меньшие объемы для полностью заполнять емкость во время ударной волны аРИМЕНЕНИЕ. Подходящие материалы из акустической точки зрения являются PE (Z = 1'760'000 Ns / м 3), мягкая резина (Z = 1'270'000 Ns / м 3), полиамид (Z = 1'960'000 Нс / м 3). Менее идеал ПВХ (3'270'000 Ns / м 3) Оргстекло (Z = 3'260'000 Ns / м 3) делрин (3'450'000 Ns / м 3) поликарбонат (2'770'000 Ns / м 3) или полипропилена (2'400'000 Ns / м 3). Твердые материалы, такие как стекло или металл не должны использоваться.
Критические шаги
Определение расстояния между источником ударных волн и образцом может быть довольно сложно. Причина в том, что источник (например, электродов советы в электрогидравлической системе) находится внутри аппликатора. Поэтому, необходимо знать расстояние от источника к аппликаторов мантии. Возможно, вам придется обратиться к производителю ударной волны устройства.
Недостатком данной модели является то, что флакон для культивирования клеток должна бытьнаполненный культуральной среде. Заполнение колб например культуре клеток подразумевает повышенное и дорогой потребление культуральной среде. Кроме расходов, этот факт также означает, что какими бы ни были клетки секретируют настоятельно разбавляют. Обнаружение молекул поэтому становится намного сложнее из-за пониженной концентрации. Таким образом, мы начали использовать белковые фильтры для центрифугирования и тем самым увеличить концентрацию снова.
Кроме того, использование различных типов клеточных культур флаконах, как описано выше, основной модификация для IVSWT является его использование для культуры тканей и бывших естественных условиях моделей. В частности, наша группа протестировали его с великолепными результатами в аорты кольцо ангиогенеза анализа 10. Это означает, что можно провести любой вид ткани органа или ткани инженерии трансплантатов в IVSWT водяной бане. Экс естественных ударная волна применение поэтому в дальнейшем могут быть использованы для улучшения различного рода методов посева клеток на инженерных трансплантатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Reiner Schultheiss и Вольфганг Schaden для их вдохновения для этой модели. Мы также благодарим христианскую Dorfmüller за его все время огромные усилия для поддержки нашего исследования.
Большое спасибо Роберт Göschl и Ханс Гогенэггер для тщательного технической реализации наших идей!
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orthogold shock wave device | Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA – manufactured by MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany | ||
| IVSWT Water Bath V2.0 | Johann Hohenegger - Technical Products | ||
| EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl. & Growth Factors | Lonza | CC-3156 & CC-4176 | This medium was used for the shown experiments with HUVECs to fill the cell culture flask. For other cell types, use the recommended medium. |
| Pechiney Parafilm M PM996 | Pechiney Plastic Packaging | PH-LF-PM996-EA at labplanet.com | for sealing flasks |
| Falcon Serological pipettes 25 ml | Becton Dickinson Labware | 357525 | |
| CellMate II Serological Pipette | Matrix Technologies | ||
| Skintact Ultrasonic Gel | Skintact | UL-01 250 ml | |
| T25 Cell culture flasks | COSTAR | 3056 | |
| Mikrozid disinfectant | Schülke | ||
| 3.5 L Degassed water | |||
| Paper towels |
References
- Haupt, G., Haupt, A., Ekkernkamp, A., Gerety, B., Chvapil, M. Influence of shock waves on fracture healing. Urology. 39, 529-532 (1992).
- Schaden, W., Fischer, A., Sailler, A. Extracorporeal shock wave therapy of nonunion or delayed osseous union. Clin. Orthop. Relat. Res. 387, 90-94 (2001).
- Schaden, W., et al. Shock wave therapy for acute and chronic soft tissue wounds: a feasibility study. J. Surg. Res. 143, 1-12 (2007).
- Tepeköylü, C., et al. Shock wave treatment induces angiogenesis and mobilizes endogenous CD31/CD34-positive endothelial cells in a hindlimb ischemia model: Implications for angiogenesis and vasculogenesis. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 146, 971-978 (2013).
- Nishida, T., et al. Extracorporeal cardiac shock wave therapy markedly ameliorates ischemia-induced myocardial dysfunction in pigs in vivo. Circulation. 110, 3055-3061 (2004).
- Fukumoto, Y., et al. Extracorporeal cardiac shock wave therapy ameliorates myocardial ischemia in patients with severe coronary artery disease. Coron. Artery Dis. 17, 63-70 (2006).
- Gotte, G., Amelio, E., Russo, S., Marlinghaus, E., Musci, G., Suzuki, H. Short-time non-enzymatic nitric oxide synthesis from L-arginine and hydrogen peroxide induced by shock waves treatment. FEBS Lett. 520, 153-155 (2002).
- Wang, F. S., Wang, C. J., Huang, H. J., Chung, H., Chen, R. F., Yang, K. D. Physical shock wave mediates membrane hyperpolarization and Ras activation for osteogenesis in human bone marrow stromal cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 287, 648-655 (2001).
- Mittermayr, R., et al. Extracorporeal shock wave therapy (ESWT) minimizes ischemic tissue necrosis irrespective of application time and promotes tissue revascularization by stimulating angiogenesis. Ann. Surg. 253, 1024-1032 (2011).
- Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat. Protoc. 22, 89-104 (2011).
